ES细胞的建系细胞工程分离囊胚的内细胞群分离胚胎生殖腺嵴细胞与成纤维细胞共培养ES细胞非分化增殖胚胎干细胞的鉴定定向诱导分化成体干细胞功能细胞一、ES细胞的建系流程（一）ES细胞的分离从着床前（孕3～5d）的胚泡中分离内细胞群（ICM）细胞，是从早期胚胎建立ES细胞系的第一步，也是建立ES细胞系最主要的先决条件。二、ES细胞的建系
方法
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1.胚胎干细胞主要有两个来源免疫学方法:利用表面特殊标记物质和物理特性。免疫外科学方法:去除透明带后，利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体和补体结合对细胞的毒性杀伤作用去除滋养层细胞，保留ICM细胞。组织培养法:切除卵巢，给予外源激素使胚胎发育，但是延缓着床，几天后，取出胚泡进行培养，滋养层细胞生长并在培养皿底壁上铺展，而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用玻璃针挑出这种细胞消化传代即可。2.ES细胞的分离方法显微外科学方法:小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养即可。其中，免疫学方法和免疫外科学方法需要特殊的试剂，容易对内细胞造成损伤；显微外科学方法需要“专门”的仪器设备，并对人员的技术水平要求高，均难以推广；而组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较容易获得ES细胞。（二）ES细胞的分离培养1.饲养层的制备和分化抑制物质的选择所用饲养层细胞（成纤维细胞、输卵管上皮细胞、子宫上皮、睾丸上皮等）经过丝裂霉素等有丝分裂抑制剂处理后，与早期胚胎和原始生殖细胞共培养后，ES细胞就可分离。作用原理：饲养层细胞可以分泌成纤维细胞生长因子FGF、分化抑制因子LIF，这些因子既可以抑制细胞的凋亡和分化，还有助于ES细胞增殖。2.培养后分离传代将分离的早期胚胎和原始生殖细胞置于饲养层上。培养液：DMEM+血清+细胞因子+分化抑制物，当内细胞团增殖和原始生殖细胞出现ES细胞样克隆后即可以传代。添加物质的选用血清:天然培养基，含丰富营养物质，对细胞的生长繁殖和黏附有很大促进作用。一般加入10%小牛或胎牛血清。生长因子:表皮生长因子EGF、胰岛素和胰岛素样生长因子IGF、成纤维细胞生长因子FGF。分化抑制因子：LIF。其他添加物质:非必需氨基酸、核苷酸、柠檬酸钠、亚硝酸钠等。思考
题
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1.从胚泡中分离内细胞群（ICM）细胞的方法有哪些？2.如何获取原始生殖细胞？3.ES细胞的建系流程是什么？
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