环境微生物学侯森暨南大学环境学院Tel：18814100296E-mail：hs0010910@jnu.edu.cn第四篇微生物监测环境第18章污染物致突变性的微生物检测传统动物实验与人群流行病学调查短期生物学试验第18章污染物致突变性的微生物检测一、鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验）（一）原理正向突变野生型his+→→→→→→营养缺陷型his-回复突变试验菌株：组氨酸营养缺陷型哺乳动物微粒体酶：大鼠肝匀浆（二）试验方法纸片点试法平皿渗入法其他方法第一节基因突变试验第18章污染物致突变性的微生物检测二、发光细菌试验（一）原理正向突变发光细菌→→→暗变异株回复突变试验菌株：费氏弧菌等暗变异株回复原理：DNA损伤（二）试验方法液体培养法：发光强度>3x对照管；阳性结果≥3（5）（三）应用与评价与Ames试验有良好一致性第一节基因突变试验第18章污染物致突变性的微生物检测三、其他基因突变试验（一）营养缺陷型菌株回复突变（二）细菌的正向突变试验突变位点更多（三）粗糙脉胞菌的正向突变试验白色菌落（野生型）；紫色菌落（突变体）（四）构巢曲霉的突变试验菌落形态或营养要求：蛋氨酸和2-巯基黄嘌呤第一节基因突变试验第18章污染物致突变性的微生物检测一、SOS显色试验（一）原理：致突变因素诱导细菌SOS修复系统的反应（二）方法：检测溶源性大肠杆菌SOS修复的间接最终表现检测细菌细胞原发直接的SOS反应（三）应用与评价准确性与Ames试验相当，比Ames试验简单、快速第二节DNA损伤修复试验第18章污染物致突变性的微生物检测二、聚合酶缺陷型菌株试验（一）原理：比较具有修复能力的菌株与没有修复能力的变异株（二）方法：点试法（三）应用与评价间接作用；准确性待提高第二节DNA损伤修复试验第18章污染物致突变性的微生物检测三、重组缺陷型菌株试验（一）原理：微生物DNA修复能力的检测（重组修复）（二）方法：点试法（三）应用与评价间接作用；准确性待提高第二节DNA损伤修复试验第18章污染物致突变性的微生物检测四、溶源性细菌试验（原噬菌体诱导试验）（一）原理：微生物DNA修复能力的检测（重组修复）（二）方法：点试法（诱导原噬菌体，裂解指示菌）第二节DNA损伤修复试验第18章污染物致突变性的微生物检测酿酒酵母的自发基因重组第三节DNA重组试验第18章污染物致突变性的微生物检测大多数致癌物质（并非全部）都具有致突变作用，大多数非致癌物质不具有致突变作用。第四节微生物致突变试验与致癌物的确定第四篇微生物监测环境第19章微生物监测技术的新发展分子生物学在环境微生物监测中的应用微生物传感器在环境监测中的应用第19章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学在环境微生物监测中的应用一、分子生物学技术与环境微生物的分类、鉴定、监测（一）PCR反应（多聚酶链式反应）KaryB.Mullis引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段PCR的基本原理1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增PCR的环境微生物检测细菌检测毒素检测病毒检测其他实时荧光定量PCR仪梯度PCR仪普通PCR仪电泳：带电粒子在电场中的定向移动。一、分子生物学技术与环境微生物的分类、鉴定、监测（二）电泳技术第19章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学在环境微生物监测中的应用图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3电泳仪器⑴垂直板电泳仪⑵圆盘电泳仪图2夹心垂直板电泳槽示意图图3凝胶模示意图1.样品槽模板2.长玻璃板1.导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝6.上贮槽7.冷凝系统返回电泳装置染色凝胶扫描技术：借助薄层扫描仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳条带转换成峰图。凝胶成像技术：通过图像采集和图像分析，利用计算机程序自动识别图中所有可能条带。成像第19章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学在环境微生物监测中的应用一、分子生物学技术与环境微生物的分类、鉴定、监测（二）核酸杂交技术探针与特定核酸分子互补第19章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学在环境微生物监测中的应用一、分子生物学技术与环境微生物的分类、鉴定、监测（三）核酸多态性技术微生物群落结构、微生物多样性（1）DGGE（2）RFLP（3）RAPD（4）ARDRABand1Band2Band7Band6Band5Band4Band3Band25Band27Band20Band29Band26Band18Band23Band28Band24Band16Band13Band11Band12Band10Band17Band19Band21Band9Band8Band14Band15Band22第19章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学在环境微生物监测中的应用一、分子生物学技术与环境微生物的分类、鉴定、监测（四）rRNA、rDNA序列分析第19章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学在环境微生物监测中的应用一、分子生物学技术与环境微生物的分类、鉴定、监测（五）基因芯片技术第19章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学在环境微生物监测中的应用一、分子生物学技术与环境微生物的分类、鉴定、监测（六）微生物醌指纹法第19章微生物监测技术的新发展第一节分子生物学在环境微生物监测中的应用二、
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基因与环境微生物监测报告基因标记在靶基因的启动子或转录起始部位，通过对报告基因特定表达产物的分析可以方便地检测到细胞内重要功能基因或质粒的转录、翻译活性，因此可以用于监测微生物在生态系统中的时空分布规律与活力。（一）Lux报告基因技术（细菌荧光素酶）（二）GFP报告基因技术（绿色荧光蛋白）（三）INA报告基因技术（冰核活性）第19章微生物监测技术的新发展第二节微生物传感器在环境监测中的应用一、微生物传感器的构建（一）微生物细胞的固定化（二）微生物传感器的类型1.电化学型微生物传感器（1）呼吸活性型（氧量）（2）代谢物质型（代谢产生电极敏感活性物）2.生物发光型微生物传感器（发光细菌）第19章微生物监测技术的新发展第二节微生物传感器在环境监测中的应用二、微生物传感器在环境监测中的应用微生物传感器检测环境化学物质的特异性取决于微生物对底物利用的选择性。1.乙醇测定（固定化毛孢子菌）2.BOD分析THANKS!
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