扫描电镜及其制样技术

扫描电镜技术TechniquesofScanningElectronMicroscope一、扫描电镜的基本结构与成像原理二、扫描电镜的特点三、扫描电镜的生物样品制备技术（一）样品的常规制备方法（二）特殊样品的制备方法扫描电镜技术扫描电镜（ScanningElectronMicroscope，SEM）是继光镜和透射电镜之后发展起来的一种电镜，用于观察物质表面及断面的三维形貌结构和进行微区成分分析。一、扫描电镜的基本结构与成像原理1、SEM基本结构及其作用（１）电子光学系统　电子枪：阴极、阳极、栅极。阴极—通电加热后产生电子束。阳极—加速电子束。栅极—控制和会聚电子束流。电磁透镜：会聚电子束，形成直径5~10纳米的电子束（即电子探针），照射于样品上。图1-1扫描电镜工作原理图（２）检测系统①二次电子的来源及作用 在样品表面以下几纳米到几十纳米的区域，被入射电子（初级电子、一次电子）所激发出来的样品原子中的外层电子，称谓二次电子（次级电子）。 SEM通常是由二次电子所形成的图象来显示生物样品的表面形貌。（２）检测系统②二次电子检测系统的组成及作用 组成：检测器（二次电子探头）、光电倍增管、视频放大器。 作用：对二次电子进行收集、放大和处理，以调制显像管栅极电压并成象。图1-1扫描电镜工作原理图（３）电子偏转系统（扫描系统） 组成：扫描发生器、扫描线圈。 作用：使镜筒和显像管内的电子束分别进行同步光栅状扫描，最后在显像管的荧光屏上显示出完整图象。图1-1扫描电镜工作原理图2、影响图象形成的因素（1）倾斜角效应——二次电子成像原理 ∵二次电子产率主要取决于电子束的入射角，而入射角又主要取决于样品的倾斜程度。 ∴样品的倾斜角效应是影响图象反差的主要因素。 ∴SEM图象的反差主要是由样品表面的凹凸状态决定的，越是凸出的部位产生二次电子的数量越多，图象越明亮，反之则较暗。图1-2样品倾斜对二次电子产率的影响2、影响图象形成的因素（2）原子序数效应 原子序数效应：样品内原子序数不同的元素，在图象上也会形成一定的亮度差异，这种现象称为原子序数效应。 对策：观察生物样品时，在样品表面喷镀一层原子序数高的金属膜，可提高图象质量。2、影响图象形成的因素（3）充放电效应 充电：当初级电子轰击干燥的生物样品表面时，会因其导电性能差而发生电荷积累的充电现象，并对随后到来的初级电子产生排斥，使电子散开，且导致二次电子发射轨迹偏斜或杂乱。 放电：轰击区内电子堆积，与邻近区域间产生电位差，则可产生放电打火现象。 充放电效应：上述充、放电状况造成图象忽明忽暗或模糊不清等现象，称为充放电效应。 对策：采用金属镀膜、导电胶粘贴样品等导电处理，可减少充放电效应的影响。图1-4血细胞充放电效应图例二、扫描电镜的特点（一）图谱胃粘液腺癌培养细胞的表面扫描电镜图象。①细胞膜向外形成许多微绒毛。②细胞分裂中期：细胞中央突出部为纺锤体一端之中心粒部，其四周为形成赤道板的染色体③细胞分裂后期：两个子细胞的核(N)正在形成,分别位于两端并向外膨出。④细胞分裂末期：两个细胞已将完全分开,很少胞质相连。该二细胞深面为一分裂间期的贴壁细胞表面图象。①人胃粘膜表面：衬有单层柱状上皮细胞，且被纵横交错的小沟分隔许多小区（胃区），分布着许多胃小凹（F）。②人胃小凹：局部放大，可见胃上皮细胞顶端之间有一定的距离，并有棵粒状分泌物从细胞间排出③人胃粘膜上皮细胞：表面粗糙不平，布满短小的微绒毛。①兔肺细支管黏膜表面：假复层柱状纤毛上皮，顶部伸出纤毛。其间夹有较多杯状细胞，表面布满短小微绒毛。②图①的局部放大：图中部为2个杯状细胞，周围布满由纤毛细胞伸出的大量纤毛。兔气管粘膜表面：在密集的纤毛丛中有一杯状细胞(G).该细胞顶端彭大,表面有长短不一的微绒毛。子宫内膜：无纤毛细胞分泌物外排的另一种方式，即在细胞顶端的质膜表面，以微绒毛为基础，扩展成泡状隆起，分泌物自泡内排出后，质膜塌陷回缩，进而恢复原状。图左上为纤毛细胞。（二）扫描电镜的特点 观察表面形貌。 图象景深大，富有立体感。 放大范围广，分辨率较高：放大倍数为数10倍~数10万倍；分辨率取决于电子探针的直径，一般为5~10nm。 可观察块状样品：0.5~10cm3。 样品制备简单。 可结合元素分析。三、扫描电镜生物样品制备技术（一）样品的常规制备方法取材→清洗→固定→清洗→脱水→干燥→金属镀膜→SEM观察1、取样 取样部位要准确。 取样大小要适当：常为≤1cm3。 取样操作要轻巧快捷：取样要快，严防对样品的挤压损伤，以使样品更近于活体状态。 样品的基底部应切割平整（以便于样品粘贴），观察面应作好识别标记。2、清洗（1）清洗的目的：充分暴露样品观察面的表面特征。（2）清洗液的选择 常规洗液——生理盐水、PBS等缓冲液； 特殊洗液——低浓度的蛋白水解酶或乙醇等，用于表面覆盖着大量蛋白或脂类黏液的样品（如胃、肠黏膜及乳腺组织等）的初级清洗。（3）清洗的方法 浸泡清洗。 震荡清洗：一些粘着杂质多而紧密的样品（如胃、肠黏膜等），可利用震荡器进行震荡清洗。 离心清洗：游离细胞、微生物及其它微小生物样品的清洗。（4）清洗的要求 样品要清洗干净：换液数次，可在解剖镜下检查，直至干净，以充分暴露表面特征。3、固定 （1）固定的目的 保留样品的微细结构和外部形貌，使其更近于生活状 态。 使组织硬化，以增强样品在随后的干燥过程中耐受表 面张力变化的能力。 提高样品对镜筒内高真空和电子束轰击的耐受力。 （2）常用的固定剂 戊二醛：常用浓度为1~4%。 锇酸：一般用1~2%浓度。 （3）固定的方法 先用戊二醛固定1至几小时或更长，经缓冲液充分清 洗后，再用锇酸固定30~60分钟。4、脱水（1）脱水的目的用低表面张力且易挥发的有机溶剂（乙醇、丙酮等）取代组织细胞中的游离水，使样品在后续干燥处理时的表面张力减少。表1几种液体的表面张力单位：达因/cm（2）脱水的方法 PBS清洗3次，5~10min/次→乙醇梯度脱水到纯乙醇，5~30min/级。（3）脱水的要求 脱水要彻底； 严防发生空气干燥：在换液过程中，要始终保持样品润湿，以免因表面张力变化而造成样品的皱缩、塌陷或变形。5、干燥（1）干燥的目的彻底去除样品中的脱水剂，使样品干燥，以保护镜筒高真空和样品不变形。（2）干燥的方法 1）空气干燥法 2）真空干燥法 3）冷冻干燥法 4）临界点干燥法 （2）干燥的方法1）空气干燥法 方法：把样品放在空气中，让其中的脱水剂自然挥发掉，以达到干燥的目的。 特点：脱水剂存在的低表面张力，仍使许多样品发生变形或收缩，故本法是在缺乏其他条件下不得已采用的干燥方法。（2）干燥的方法 2）真空干燥法 方法：在真空的条件下使样品中的脱水剂 挥发掉。 特点：效果与空气干燥时相同，仅是干燥 的速度较快。（2）干燥的方法3）冷冻干燥法 特点：在干燥过程中由于不形成液-气界面， 所以由表面张力引起的样品变形和损 伤大为减少，因此干燥效果较好。 缺点：冷冻过程有可能形成冰晶损伤。图3-1冷冻干燥法技术流程（2）干燥的方法4）临界点干燥法①临界点干燥的原理（图3-2）图3-2临界点干燥原理图a：填充液体CO2（密闭、常温、有一定压力）。b：加热（密闭、加热、低于临界值）。c：临界状态（密闭、达临界状态、相界消失）。d：减压（临界状态下排气）。e：干燥结束（常温、常压、排气结束、样品干燥）临界点干燥的原理之小结 临界状态的条件：密闭容器中的液体加热达到一定的温度（临界温度）。 临界状态的特性：气、液密度相等，相界消失；液体变成气体，液体的表面张力消失为零；无论施加多大的压力，气体不会变成液体。 临界点干燥：利用临界状态下液体表面张力被消除的特性，使样品中的液体气化而最后完全干燥。②临界干燥液的选择——置换液与中间液置换液：在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体称为置换液(表2)。表2某些液体的临界特性 中间液：醋酸异戊酯③临界点干燥器的主要结构（图3-3）图3-3HCP-2型临界点干燥器A：HCP-2型临界点干燥器结构图。B：样品室放大剖面图④临界点干燥的操作程序取样固定脱水醋酸异戊酯样品入室注入液体CO2置换气化放气取样(15~30min或过夜）(0~10℃)(0~10℃)(15~20℃)(35~40℃)(35~40℃)(10~20min)(5~10min)(30min)图3-4临界点干燥过程6、粘样（样品的粘贴） （1）目的：将样品粘牢在样品台上。 （2）粘样材料 双面胶带：用于粘贴基底部平整或颗粒 状的样品。 导电胶：是银粉拌在低电阻树脂内制成的 糊状物，用于粘贴基底部不平 整的样品。 7、金属镀膜在样品表面喷镀一层厚约3~30nm的金属薄膜。（1）镀膜的目的①提高样品表面的导电性。②提高二次电子发射率。③减少电子束对样品的损伤。（2）镀膜材料的选择金、铂、金/铂合金、铂/钯合金。（3）镀膜的方法目前常用离子溅射法镀膜。7、金属镀膜 1）离子溅射法 ①离子溅射仪的主要结构 ②离子溅射镀膜的原理 辉光放电→离子溅射→漫散射镀膜 ③镀膜厚度的控制： 溅射时间的选择 8、电镜观察图3-6离子溅射仪及原理图（二）特殊样品的常规制备方法1、游离细胞的制样方法（1）将盖玻片洗净灭菌，样品面做标记；（2）将盖玻片垂直浸入热溶的2~5%明胶后即刻垂直取出，用滤纸吸去边缘多余的明胶；（3）将盖玻片的样品面朝上平放在滤纸上，于37℃干燥箱烘干后备用；（4）在盖玻片样品面上滴1~2滴细胞悬浮液，静置20min左右，用滤纸吸去表面残存的悬浮液。（5）用2%戊二醛固定30min，PBS清洗3次。（6）常规方法脱水、临界点干燥、粘样和镀膜。SEM样品的常规制备方法小结1、SEM样品的常规制备步骤取材→清洗→固定→清洗→脱水→中间液替代脱水剂→临界点干燥→粘样→（金属）镀膜→SEM观察2、SEM样品制备的基本要求与原则（1）样品观察面要处理干净，以充分暴露表面特征；（2）保护样品观察面，以保持原状不变形；（3）样品要彻底干燥，以保护镜筒的高真空和样品的形态结构；（4）样品要作导电处理，以减少充放电效应和提高二次电子发射率。复习题1、扫描电镜的特点2、临界点干燥的原理3、金属镀膜的目的4、SEM样品的常规制备步骤5、SEM样品制备的基本要求与原则胃粘液腺癌培养细胞的表面扫描电镜图象。①细胞膜向外形成许多微绒毛。②细胞分裂中期：细胞中央突出部为纺锤体一端之中心粒部，其四周为形成赤道板的染色体③细胞分裂后期：两个子细胞的核(N)正在形成,分别位于两端并向外膨出。④细胞分裂末期：两个细胞已将完全分开,很少胞质相连。该二细胞深面为一分裂间期的贴壁细胞表面图象。①人胃粘膜表面：衬有单层柱状上皮细胞，且被纵横交错的小沟分隔许多小区（胃区），分布着许多胃小凹（F）。②人胃小凹：局部放大，可见胃上皮细胞顶端之间有一定的距离，并有棵粒状分泌物从细胞间排出③人胃粘膜上皮细胞：表面粗糙不平，布满短小的微绒毛。①兔肺细支管黏膜表面：假复层柱状纤毛上皮，顶部伸出纤毛。其间夹有较多杯状细胞，表面布满短小微绒毛。②图①的局部放大：图中部为2个杯状细胞，周围布满由纤毛细胞伸出的大量纤毛。兔气管粘膜表面：在密集的纤毛丛中有一杯状细胞(G).该细胞顶端彭大,表面有长短不一的微绒毛。子宫内膜：无纤毛细胞分泌物外排的另一种方式，即在细胞顶端的质膜表面，以微绒毛为基础，扩展成泡状隆起，分泌物自泡内排出后，质膜塌陷回缩，进而恢复原状。图左上为纤毛细胞。a：填充液体CO2（密闭、常温、有一定压力）。b：加热（密闭、加热、低于临界值）。c：临界状态（密闭、达临界状态、相界消失）。d：减压（临界状态下排气）。e：干燥结束（常温、常压、排气结束、样品干燥）A：HCP-2型临界点干燥器结构图。B：样品室放大剖面图