SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究

华中科技大学硕士学位论文SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究姓名：冯燕申请学位级别：硕士专业：生物医学工程指导教师：杨祥良2011-05-24华中科技大学硕士学位论文摘要蛋白质偶联技术是采用一定的技术手段将具有生物活性的蛋白质与其它载体分子或标记物结合在一起的一种方法，在生命科学和医学领域有着广泛的应用。在标记免疫分析方法中，抗体与酶等标记物的偶联效果会直接影响到免疫方法的灵敏度和可靠性。常用的偶联方法如戊二醛法、碳二亚胺法、过碘酸钠氧化法法等不可避免地会产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使偶联效率降低、结合物活性减弱。在此基础上发展起来的异性双功能偶联剂虽然可以克服这一不足，但酶在抗体上的连接位点具有随机性，导致抗体和酶的活性会受到影响。因此，在实际应用中，需建立一种能定向偶联的抗体偶联技术。本研究采用SMCC法，研究优化了免疫球蛋白IgG与辣根过氧化物酶HRP的偶联条件，主要研究内容包括：1)采用体内诱生腹水法制备氯霉素单克隆抗体，并对其活性进行测定，建立竞争曲线。2)从投料比、反应温度、反应时间三个方面对抗体的DTT还原反应过程进行了研究，探讨了还原条件对免疫球蛋白的结构、活性等方面的影响。3)采用SMCC法将抗体与HRP偶联，并对其活性进行鉴定，并将其用于酶联免疫吸附实验。研究结果表明，DTT还原反应的温度和时间对抗体结构和活性影响不大，而DTT的加入量则有明显影响：在封闭巯基的条件下，投料比小于为600时，还原产物以大分子片段居多，当投料比大于600后，产物主要为小分子片段，且抗体活性开始下降，到6000时活性几乎完全丧失；在未封闭巯基条件下，由于游离巯基会重新聚合，当投料比在600～12000之间，抗体活性与产物的组成差异均不明显。在将其应用于羊抗小鼠二抗与HRP的偶联中，确定优化的SMCC法偶联条件为DTT与抗体I华中科技大学硕士学位论文投料的比为8000，反应温度为25℃，反应时间在20～30min。关键词：定向偶联，抗体，SMCC，DTTII华中科技大学硕士学位论文AbstractTheabilitytoconjugateaproteintoanothercarrierormoleculehasbeenwidelyusedinlifescienceresearchandmedicalscience.Inimmunoassay,theconjugationofantibodyandenzymewilldirectlyeffectsensitivityandreliabilityofthemethod.Presentmethods,suchasglutaraldehyde-modified,EDC-modifiedandsodiumperiodate-oxidized,haveinevitablyformedmuchpolyer,reducedtheefficiencyanddecreasedactivityoftheconjugation.HeterobifunctionalconjugationreagentslikeSPDP,MBScanovercomethisshortage,butenzymewillcrosslinksomewhatrandomlytonearlyallpartsoftheantibodymolecule,thisinturnleadstoaninfluenceofantibodyandenzyme.Sowemustestablishasite-directedconjugationschemesforapplication.ThisresearchconjugatingconditionofIgGandHRPwasstudiedandoptimizedmakinguseofSMCC-modified.Inthisresearch,monoclonalantibodywasproducedbyimmuningascticfluid,theactivityandtiterofantibodywasdeterminedbyELISA,andthecompetitioninhibitioncurvewasestablished.TheDTTreductionreactionofIgGhasbeenstudiedfromfeedratio,reactiontemperature,reactiontime,andinvestigateitsinfluenceonthestructure,activityofimmunoglobulin.HRPhasbeenconjugatedwithantibodiesusingSMCCasacrosslinkingreagent,whichwouldbeusedinELISA.Theresultsshowedthatreactiontemperatureandreactiontimehavelittleeffectonthestructureandactivityofimmunoglobulin,butthereisnotableeffectonthemifwechangethefeedratio.Intheconditionofblockingfreesulphydryl,theactivityofantibodybegintodeclinewhenthefeedratiois600,andtheactivityisalmostcompletelylossofwhenthefeedratiois6000;butthefreesulphydrylwouldre-aggregationifwedonotblockit,thenthedifferenceofstructureandactivityofantibodyarenotobviouswhentheIII华中科技大学硕士学位论文feedratioisbetween600～12000.Finally,wedeterminedthatthefeedratiois8000,reactiontimeisbetween20～30min,reactiontemperatureis25℃.Keywords:site-directedconjugation,antibody,SMCC,DTTIV华中科技大学硕士学位论文缩略词FBS胎牛血清DMSO二甲基亚砜BSA牛血清白蛋白IgG免疫球蛋白γ-globulin牛源γ-球蛋白GAM羊抗小鼠IgGHRP辣根过氧化物酶GSH谷胱甘肽IAAm碘乙酰胺OVA卵清蛋白ELISA酶联免疫吸附实验CAP氯霉素DTT二硫苏糖醇DTNB5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)SMCC4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐VII独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中科技大学硕士学位论文1.绪论1.1蛋白质偶联技术的发展蛋白质偶联是指将小分子物质（如药物、半抗原）或大分子物质（如酶、蛋白毒素等）以共价键的方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物，抗体靶向药物和免疫毒素等[1]。蛋白质偶联技术在生物学和医学领域得到越来越广泛的应用。蛋白质偶联方法首先发展于人工抗原的制备研究，Landsteiner等[2]第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性的小分子物质（半抗原）如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体分子共价结合，使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于免疫分析等。为了使免疫分析达到灵敏度高、特异性强的要求，前人对蛋白质偶联的方法进行了大量的研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等偶联技术。近10年来发展起来的酶标免疫检测技术，要求制备保持酶的生物活性和抗体的免疫结合活性的酶-抗体偶联物。常用的偶联方法如戊二醛法、碳二亚胺法等不可避免的产生酶或抗体的自身交联或多聚物，致使偶联效率降低，结合物活性减弱。为了克服这一不足，人们发展了异性双功能偶联试剂，如N-羟基琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯，以实现控制偶联，提高偶联反应的选择性和偶联产物的均一性。将药物与大分子载体连接，制备药物-载体结合物，以改善和控制药物在体内的转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物利用度和治疗指数。这是现代药物研究领域一个崭新的分支。载体药物必须能够在体内定量、定位释放原型药物，以此要求设计pH敏感或特定酶敏感的偶联键。导向药物的发展对蛋白质偶联方法提出了更高的要求。早在1906年，Ehrlich就提出靶向给药的设想。随着生物医学的发展，这一设想不断得到具体的实现。单克隆抗体作为导向载体的出现，更使导向药物的研究成为当代药物研究中最活跃和最1华中科技大学硕士学位论文引人注目的领域之一，而其中研究最广泛的是用于肿瘤治疗的抗体导向研究。其载体主要有针对肿瘤细胞表面相关抗原的抗体及其片段，肿瘤细胞表面受体的模拟配基。这些载体与药物或毒素分子连接而成的偶联物，能够选择性地杀伤肿瘤细胞，被誉为“生物导弹”。为了最大限度地保持导向载体和药物弹头的生物活性，同时实现最大的药物载运量，人们不断创新交联剂，改进偶联方法，发展了一批新的各具特性的异性双功能偶联剂，提高了导向药物的有效性和实用性。1.2现有标记方法IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端），其结构如下图：2华中科技大学硕士学位论文图1-1抗体结构示意图[3]一般说来，抗体蛋白分子中可以用于偶联的活性基团主要有游离氨基（如赖氨酸的ε-氨基或末端氨基）、游离羧基（如天冬氨酸残基，谷氨酸残基及末端羧基）、巯基（半胱氨酸）、羟基（丝氨酸或苏氨酸）等[1]。1.2.1戊二醛法戊二醛是应用最广泛的同功能偶联剂，其结构简单，反应机理也不复杂。它的两个醛基可以分别与两个相同或不同分子上的伯胺基形成Schiff氏碱，将两分子以五碳桥连接起来，随后以硼氢化钠或氰基硼氢化钠还原Schiff氏碱可以形成稳定的单键；根据对偶联键的不同要求，还原步骤也可以省略。恩诺沙星的完全抗原即用戊二醛将羧基与蛋白的氨基连接[4]。霍美俊[5]等利用戊二醛法将兔抗EV71多克隆抗体与氨基硅烷修饰的磁性纳米粒表面，通过酶联免疫、免疫荧光方法证实了抗体耦合在纳米粒表面，并通过BCA法测得偶联率为94.1%。Avrameas[6,7]也利用这种方法制备了兔抗体与辣根过氧化物酶的偶联物，证实其具有活性。戊二醛偶联反应是最温和的偶联反应之一，可在4-40℃温度范围，pH6.0-8.0的缓冲溶液中进行，但是缓冲组分中不得含有氨基化合物[8]。戊二醛标记又可以分为一步法和两步法。一步法[9]主要是将酶、抗体和戊二醛同时混合直接作用。此法虽然简单，但因酶的活性氨基少，而抗体的活性氨基多，在戊二醛的作用下，容易形成免疫球蛋白的聚合物和酶蛋白的聚合物。因而，形成标记抗体的比例较少，同时抗体和酶的活性丧失较多，结合物的酶活性较低。两步法[7]中则是先用过量的戊二醛与酶作用，是戊二醛上的一个活性醛基先与酶3华中科技大学硕士学位论文蛋白上的氨基结合后，除去过量的戊二醛，然后，再加入抗体球蛋白，使之与酶-戊二醛复合物反应，形成酶结合物。这一方法的优点在于能生成均一的结合物，大多可使一个酶分子与一个抗体球蛋白作用，抗体和酶的活性损失较少，所得酶结合物活性比一步法高10倍左右。骆加理等认为虽然两步法要优于一步法，但其对酶的利用率也仅有5%左右，大部分酶未被利用[10]。1.2.2过碘酸钠氧化法糖基或含糖基化合物分子中的邻二醇结构可被过碘酸钠氧化为醛基，然后与蛋白分子中的氨基形成Schiff氏碱：Nakane和Kawaoi最早将过碘酸盐氧化法用于HRP的偶联[11]。首先用氟代二硝基苯（FDNB）封闭HRP表面的游离氨基，也可用甲醛或戊二醛来封闭，从而提高酶结合抗体球蛋白的能力，避免酶自身的交联。然后用过碘酸钠来氧化HRP表面的糖链使成醛基，最后用硼氢酸钠还原，是HRP表面醛基能充分与球蛋白上的氨基反4华中科技大学硕士学位论文应，形成稳定结合物。薛采芳等对戊二醛法与过碘酸钠氧化法进行比较，将HRP与羊抗兔IgG偶联，并对偶联物偶联率、活性进行鉴定发现，过碘酸钠氧化法比戊二醛两步法具有更多的优点，如酶耗量低，产量高，操作简单，纯化容易等，如条件控制适当，重复性很稳定[12]。过碘酸钠氧化法[12]虽然提高了酶和抗体的利用率，但发生自身交联的HRP仍高达35%，FDNB封闭氨基时产生HF对酶活性有一定影响，且pH8.0能减弱过碘酸钠的氧化作用。张尚明[13]等对过碘酸钠氧化法进行改进，通过调整pH至4.4后，不需封闭氨基，而HRP的自身交联率仅为5%左右，且pH4.4为过碘酸钠氧化的合适条件，最终得到满意的效果，当标记抗体稀释4096倍时，吸光值仍高于1.0。1.2.3碳二亚胺法碳二亚胺是一类很强的脱水剂，能使羧基和氨基脱水形成酰胺键。在反应时，一种分子中的羧基先与碳二亚胺反应生成一个加成中间产物，再与另一分子上的氨基反应形成酰胺键，实现两者的偶联：除戊二醛外，碳二亚胺是常见的一类偶联试剂，主要用于羧基和氨基的偶联，最早用于药物化学和有机化学领域。脂溶性的二环己基碳二亚胺至今仍被广泛用于多肽合成领域，但其反应必须在有机溶剂中进行，不适用于蛋白质偶联。水溶性的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）等的出现，使这一缩合反应成功地应用于蛋白质偶联中。杨春洪[14]等以表面带羧基的聚丙烯酰胺固相微球为载体，利用EDC活化、偶联黄曲霉毒素B1抗体，结果表明最适偶联pH为6～6.5，最适反应时间为17～20h，最佳EDC加入量为5～15mg/10mg微球，抗体偶联率可达60.4%，为利用聚丙烯酰胺微球建立黄曲霉毒素快速检测技术奠定了基础。但是，由于碳二亚胺的缩合反应没有选择性，易于形成蛋白分子间的自身聚合，5华中科技大学硕士学位论文产生非均一性产物；先将含羧基的物质与EDC反应，活化羧基后，再加入蛋白反应物，可以减少蛋白分子间的交联[15]。EDC与带有羧基的物质反应后形成一个活性中间体，这个中间体极不稳定，其活性酯基容易水解，并且这一中间体与氨基反应速度较慢。因此在实际应用中，EDC常和NHS一起使用，加入NHS后可显著提高活性中间体的溶解性和稳定性。类似戊二醛、碳二亚胺这种同功能偶联剂，虽然偶联方法简单，但均易形成自身交联，大大降低了酶和抗体的利用率，偶联物活性也较低。1.2.4马来酰亚胺基类活泼酯法为了克服同功能偶联剂的不足，人们发展了异性双功能偶联剂，马来酰亚胺基类活泼酯就是其中应用较普遍的一种，包括有N-羟基琥珀酰亚胺基-间-（N-马来酰亚胺基）-苯甲酸酯（SMB）[16]、N-羟基琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)[17]、4-（N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）[18]等。马来酰亚胺基结构中的双键比较活泼，可与游离巯基进行选择性加成反应，马来酰亚胺基取代衍生物的N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂与含有氨基的药物或蛋白反应，引入马来酰亚胺基，与另一含有游离巯基的分子通过巯基对双键的加成反应连接起来。在这些偶联剂中，以SMCC最为稳定。Ishikawa[19,20]等报道过，在中性环境下，将其置于30℃中2小时后，只有约4%的马来酰亚胺基水解，他们认为，由于马来酰亚胺邻位环己烷的立体空间效应所致，使其稳定性增加。基于SMCC的高稳定性，其反应过程的中间产物具有长寿命、高活性的特点，因此，应用最为广泛，包括有葡萄糖氧化酶与兔IgG的偶联[21]、辣根过氧化物酶与抗体Fab片段的偶联[22,23]、抗地高辛抗体F（ab′）2片段与β-半乳糖甘酶的偶联[24,25]等。6华中科技大学硕士学位论文SMCC难溶于水，因此在进行蛋白修饰前必须先将SMCC溶于有机溶剂如DMSO或DMF中，在有些情况下，即使加入少量的有机溶剂也会对蛋白活性造成影响，一般情况下，有机溶剂不能超过水相介质的10%，否则会对蛋白或药物活性产生影响。而其磺化后的衍生物，sulfo-SMCC，则可以避免加入有机溶剂，由于其在琥珀酰亚胺环上拥有一个带负电荷的磺酸基，增加了水溶性，室温下，其溶解度可达到10mg/mL,从而可以避免有机溶剂的影响。经SMCC活化的物质（通常是载体或酶）可与另一含有巯基的分子结合。有些情况下，待偶联的的物质本身不含有游离巯基，这就需要引入巯基以实现与SMCC活化后的中间体的偶联。目前引入巯基主要有以下三种方法：1)Traut’s试剂修饰Traut’s试剂，即为2-亚氨基硫烷盐酸盐，最早由Traut[26]合成，它可以与带有氨基的物质通过开环反应引入末端巯基。因此，抗体经过Traut’s试剂修饰后即带有可与马来酰胺活化的酶结合的巯基。这种方法不同于二硫键还原法，这种方法较好的保持了抗体的二价结构。但是，这种方法的氨基修饰可能发生在蛋白的任一个赖氨7华中科技大学硕士学位论文酸ε-氨基位点处，导致引入的巯基将会随机分布在免疫球蛋白结构上。当酶结合到抗体上后，其分布的随机性可能会阻碍甚至封闭抗体上的抗原结合位点。比起偶联过程中抗体与酶的投料比，抗体上的巯基数量对于酶标记物的形成更为重要，因此，必须使用过量的Traut’s试剂以获得带有足够数量巯基的抗体分子。2)SATA修饰SATA是一种巯醇试剂，它可以通过末端NHS酯键与蛋白的氨基结合，而乙酰化的巯基通过羟胺的作用脱乙酰化而暴露巯基，进而与马来酰亚胺活化的酶结合。不同于其他的巯基化过程，这种方法不是马上引入巯基，而是需要一个脱乙酰化的过程，从而保护了巯基使其能够长期的保存而不被再氧化。尽管巯基化的过程也是通过氨基反应进行的，但这种巯基化过程不会对抗原结合活性产生影响。Duncan[27]等通过实验表明，即使一个抗体分子上修饰了6个SATA也不会影响到抗体的活性，甚至有助于其活性的保持。另外，Sykaluk[28]的实验 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ，随着SATA投入量的增加，可用于偶联修饰的巯基量也随之增加。3)还原法抗体是由两条重链和两条轻链组成，各链间均有二硫键连接。当反应中有适宜浓度的还原剂如DTT、TCEP、MEA时，连接两条重链间的二硫键会断裂，而重链和轻链间的二硫键则不被破坏。Sun[29]等对不同的强还原剂进行了对比实验，结果表明，打开重链间的二硫键，DTT投入的摩尔量应是抗体投入量的3.25倍，而TCEP则只需2.7倍。这种方法不仅保持了抗体的活性，同时提供了用于偶联的游离巯基。在这三种方法中，前两种方法在偶联过程中仍具有随机性，理论上，只有通过还原法才能实现定向偶联。1.3SMCC法在抗体偶联中的应用在这种定向偶联方法中，主要利用了抗体独特的自身结构。抗体由两条重链与两条轻链组成，重链与重链之间、重链与轻链之间都存在着二硫键，这为SMCC定8华中科技大学硕士学位论文向偶联提供了基础。偶联过程中，只需利用一种还原剂将重链间的二硫键打开形成游离巯基，与被SMCC活化后的标记物质进行偶联，从而实现定向偶联。SMCC法偶联的过程较复杂，流程图如下，整个过程大概需要4～5h。Yoshitake[21]较早的应用SMCC，将从黑曲霉中提取的葡萄糖氧化酶GO与兔IgG偶联。GO经SMCC活化后引入了马来酰亚胺基，与被还原后的IgG结合。结果表明约有40％的IgG和酶偶联成功而不会形成自身交联，而酶的活性只降低了约26％，9华中科技大学硕士学位论文并且结合物中的抗原结合位点保持较好。随后Yoshitake对实验进行改进，首先用胃蛋白酶水解IgG，水解后的抗体主要产生F(ab’)2片段，F(ab’)2片段还原后可得到单价的含有游离巯基的Fab片段，并且不同的还原剂所得到的巯基数量不同。37℃时，在pH为6的条件下用10mmol/L的2-巯基乙胺还原F(ab’)2片段1.5小时，所得巯基与Fab片段比约为0.97-1.1。而室温下，在pH为8.2的条件下用10mmol/L的2-巯基乙醇还原F(ab’)2片段1小时，所得巯基与Fab片段比约为1.6。这种方法中，约有98％的酶连接到Fab片段上，而90％的抗体连接到酶上，合成均一性较高的偶联物。在夹心法检测铁蛋白时，用这种方法制备的偶联物检测的灵敏度要高出传统方法制备的偶联物的10-100倍[30]。在免疫球蛋白单体结构中有2个抗原结合位点，位于其高变区的N末端，也是其活性的重要组成部分。免疫球蛋白与抗原分子的结合只由重链与轻链中不连续氨基酸参与的非共价键引起，换句话说，结合位点不是严格的由线性的氨基酸序列组成，而是由它们独特的三级结构而形成。这些结合位点通过范德华力，离子键，疏水键，氢键等与特定抗原进行高亲和力的结合。抗体分子具有一系列可用于偶联的官能团，如赖氨酸的ε-氨基或末端氨基，天冬氨酸与谷氨酸的游离羧基等。由于这些官能基团在抗体三级结构中的均匀分布，使得偶联反应随机地发生在抗体结构的任何部位，抗体的随机取向导致抗原结合位点被隐藏甚至占据，这样就降低了抗体的抗原结合活性。因此抗体的定向成为人们研究的重点。众所周知，抗体铰链区的二硫键主要用于连接重链和轻链，如果利用还原剂（如MEA、DTT、TCEP等）将其二硫键打开，形成两条75KD的链，每条单链均含有一个抗原结合位点[31,32]。铰链区的巯基可用于与其他分子或探针偶联，并且结合部位远离抗原结合位点，保持了抗体活性，SMCC偶联方法也正是利用这一原理，以此实现定向偶联。在SMCC偶联中，引入巯基的多种方法中，以还原抗体这种方法制备的偶联物定向效果最佳。Ji[33]在抗体与量子点的偶联中将DTT还原法与Traut’s试剂修饰法进行比较，抗体被还原后，铰链区的巯基更容易与量子点结合，而Traut’s试剂修饰后10华中科技大学硕士学位论文抗体与量子点的结合仍是不可控的。因此，人们普遍认为以还原剂还原抗体，SMCC活化载体是一种能定向偶联的方法，因为重链间的二硫键在铰链区，远离抗原结合位点。Ishikawa[34]利用SMCC将HRP与抗体Fab片段偶联，HRP可以定向的偶联到Fab的铰链区。他认为这种方法不会导致抗体聚合，而且抗体和酶的活性不易受到破坏。Hong和Nisonoff[35]对重链与轻链及重链与重链间的二硫键的稳定性进行了比较，其结果表明当还原剂浓度较低时，还原剂会优先还原重链间的二硫键。目前，已有多种SMCC法的偶联试剂盒上市，如美国Invitrogen公司[36]的Qdot®AntibodyConjugationKit，该试剂盒用SMCC作为偶联剂，以DTT还原抗体，抗体与量子点偶联后用巯基乙醇终止偶联反应，整个反应耗时约4.5小时。目前这种SMCC定向偶联方法存在一些问题，首先，不同文献报道的DTT投加量区别较大，Ji[34]在文献中对已报道的DTT投加量进行总结发现，DTT投料比由10～7500不等。而且，对于DTT还原抗体的结果也没有统一的结论。SmitaPathak[37]在NANOLETTERS上发表的一篇文章，通过SDS-PAGE对不同DTT投入量时抗体的还原结果进行验证，结果表明，抗体经DTT还原后产生的多为25KD和50KD的片段，而几乎没有75KD的片段。一些文献报道，当DTT投料比在150～1000之间，抗体间的二硫键几乎完全破坏[38,39]。Ji[33]通过SDS-Page发现，DTT不仅可以还原重链间的二硫键，同样可以破坏重链与轻链间的二硫键。Hong[40]则通过实验证明了在DTT还原条件下，抗体重链与轻链间的二硫键比重链间的先断裂，他认为轻链所处位置有利于DTT还原，并且在重链与轻链间只有一条二硫键，而重链间往往有两条以上的二硫键。而Sears[41]则认为，不同二硫键的反应活性主要取决于DTT还原条件，因为巯基极不稳定，因此在无氧条件和有氧条件下DTT还原结果是不一样的。在有氧条件下，中间产物的形成主要取决于DTT与蛋白质的投料比和蛋白质浓度，而在无氧条件下，DTT还原则是一个随机过程。1.4本研究的目的和意义SMCC法是目前应用较广泛的抗体偶联技术，也是最有希望实现抗体定向偶联11华中科技大学硕士学位论文的技术之一。但是由于目前SMCC中抗体还原过程还没有明确的结论，不同文献对其还原机制有不同的看法。因此，必须明确抗体的还原过程，优化偶联条件，从而实现抗体的定向偶联。本文从DTT投料比、DTT还原反应温度和反应时间对还原后抗体的结构与活性进行研究，确定了SMCC法偶联的条件。研究的主要内容包括：1)氯霉素单克隆抗体原料的制备：利用体内诱生腹水法制备腹水，并用ProteinG亲和层析柱进行纯化，随后对其进行活性测定，建立竞争曲线。2)DTT还原对免疫球蛋白的影响：从投料比、反应温度、反应时间三个方面对还原反应进行分析，研究其对免疫球蛋白的结构、活性等方面的影响。3)将SMCC法用于氯霉素单抗与HRP的偶联，并对偶联物活性进行测定。12华中科技大学硕士学位论文2.氯霉素单克隆抗体的制备本章工作将氯霉素杂交瘤细胞株进行传代培养，采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，并用ProteinG亲和柱对其进行纯化，随后对其活性进行测定，包括效价、IC50、IC80，并建立竞争曲线。具备活性的单抗则可用于后续偶联实验。2.1仪器试剂2.1.1仪器设备表2-1主要仪器名称型号来源超净工作台SW-CJ-1Cμ苏州净化设备有限公司CO2培养箱HERAThermoScientific公司台式离心机TDL-5-A上海安亭科学仪器厂超低温冰箱U410美国NewBrunswickScientific公司紫外可见分光光度计TU-1901北京普析通用仪器有限公司数字式酸度仪PHS-3C上海雷磁仪器厂酶标仪318C上海三科仪器有限公司水浴锅DKB-600BBuLepaid公司ProteinG亲和层析柱5mlPierce公司2.1.2试剂表2-2主要试剂名称规格生产厂商氯霉素单克隆细胞株–武汉百仕康公司RPMI-1640培养基–GBICO公司胎牛血清FBS–GBICO公司二甲基亚砜DMSO分析纯Amresco公司HEPES分析纯武汉凌飞科技有限公司石蜡油–Fluka公司Tween-20分析纯国药集团化学试剂有限公司工业酒精95%国药集团化学试剂有限公司13华中科技大学硕士学位论文HRP标记羊抗小鼠IgG–北京博奥森公司牛血清白蛋白（BSA）98%Seebio公司碳酸钠分析纯国药集团化学试剂有限公司碳酸氢钠分析纯国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯汕头市金砂化工厂磷酸氢二钠分析纯汕头市金砂化工厂氯化钾分析纯汕头市金砂化工厂氯化钠分析纯汕头市金砂化工厂TMB显色液（A+B）–武汉百仕康公司乙酸钠分析纯上海试一化学试剂有限公司甘氨酸99.9%武汉飞羿科技有限公司Tris99.99%GenerayBiotech叠氮钠分析纯Sigma公司浓硫酸98%国药集团化学试剂有限公司2.1.3实验动物雌性BALB/c小鼠（8～12周龄）购自武汉疾病控制中心，寄养于武汉军区医院SPF级实验室。2.1.4溶液的配制RPMI1640不完全培养基：取RPMI1640干粉培养基一袋，加约900mL超纯水溶解，另称取2.0gNaHCO3，2.38gHEPES溶于溶液中，混匀后调其pH至7.0～7.2，定容至1000mL，在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤，分装备用。RPMI1640完全培养基：在无菌条件下将FBS加入不完全培养基中，浓度控制在10%～15%，混匀备用。0.05mol/L碳酸盐缓冲液：称取0.159gNa2CO3，0.293gNaHCO3，加约90mL超纯水溶解，调其pH至9.6，定容至100mL，过滤备用。0.01mol/LPBS缓冲液：称取0.2gKH2PO4，0.2gKCL，2.9gNa2HPO4·12H2O，8.0gNaCl，加约900mL超纯水溶解，测其pH约在7.4左右，定容至1000mL，过滤备用。PBST：取0.5mLTween-20，加PBS定容至1000mL，混匀后备用。0.1mol/LpH5.0的乙酸-乙酸钠溶液：称取8.2g无水乙酸钠，加约900mL超纯水14华中科技大学硕士学位论文溶解，用乙酸调节pH至4.9-5.1，加水定容至1000mL，过滤备用。0.1mol/LpH2.0-3.0的甘氨酸-盐酸溶液：称取7.5g甘氨酸，加约900mL超纯水溶解，用盐酸调节pH至2.0-3.0，加水定容至1000mL，过滤备用。1mol/LpH8.0-9.0的Tris-HcL缓冲液：称取12.1gTris，加约90mL超纯水溶解，用盐酸调节pH至8.0-9.0，加水定容至100mL，过滤备用。封闭液：称取0.3gBSA溶于30mLPBST中，溶解后备用。0.02%叠氮钠：称取20.00mg叠氮钠，加超纯水溶解，然后再定容至100mL。1mol/LH2SO4：取3mL浓硫酸加到51mL的超纯水中，混匀后备用。2.2实验方法2.2.1细胞复苏从液氮中取出冻存管，迅速投入37~38℃温水中，并充分摇动（用手快速摇动冻存管）使其快速融化。无菌条件下打开冻存管，轻轻吹打混匀，将细胞吸入10mL无菌离心管中，再加5mL培养基于离心管中，混匀后1500r/min离心8min。倒掉上清后另加入7mL培养基，轻轻吹打混匀。将细胞悬液移至培养瓶中，置于CO2培养箱培养，次日更换培养液后继续培养。2.2.2腹水的制备订购8~12周龄的雌性BALB/c小鼠，养于SPF级实验室，2~3天后腹腔注射0.5mL已灭菌的石蜡油。1周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞/只，接种细胞7后开始逐日观察小鼠腹水生长情况，等腹水量足够大时（小鼠行动缓慢，全身的毛竖起），处死小鼠，吸取腹水，收集于离心管中，1500r/min离心10min。取上清液于EP管，置于-4℃冰箱中暂时保存，以备后一步纯化。2.2.3单抗的纯化1)用5mL乙酸-乙酸钠溶液平衡proteinG柱，使溶液浸润整个柱子。15华中科技大学硕士学位论文2)上样前用乙酸-乙酸钠溶液1：1稀释样品，以达到选择性结合的最适离子强度和pH值。若稀释后，样品溶液变浑浊，则5000r/min离心10min。3)上样（上样量不能超过柱容量的80%），用15mL乙酸-乙酸钠溶液冲洗柱子，以洗去杂质和未结合的样品（可重复上样），收集洗脱液，每管收集1mL，并测定280nm处吸光度值，最后管吸光度值应低于0.01。否则，继续用结合缓冲液冲洗，直至其吸光度值低于0.01。4)用5mL甘氨酸-盐酸溶液洗脱，收集洗脱液，1mL/管，然后马上加入100μLTris-HCl缓冲液，使其pH接近7.0，测定各管溶液280nm处吸光度值，并将出现峰值管的溶液集合在一起。5)用12mL乙酸-乙酸钠溶液平衡proteinG柱。6)用5mL0.02%叠氮钠冲洗proteinG柱，当大约有3mL溶液剩余时，盖上盖子，4℃垂直放置保存。2.2.4单抗的鉴定2.2.4.1单抗浓度的测定取适量制备好的单抗，用缓冲液稀释后置于微量石英比色皿中，在UV-Vis光度计上测260nm和280nm处的吸光度。根据经验公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度(mg/mL)=1.45A280nm－0.74A260nm2.2.4.2单抗效价的鉴定1)包板：用包被缓冲液将CAP-BSA稀释后，100μL/孔加入到酶标板中，4℃冰箱中过夜。2)封闭：倒掉酶标板中的包被液，用300μL/孔洗涤液洗板5次，拍干后加入300μL/孔封闭液，37℃水浴1.5h后洗涤5次，拍干备用。如不是立即使用，将酶标板封好后4℃冰箱保存。16华中科技大学硕士学位论文3)加抗体和竞争抗原：将抗体从1:100起做梯度稀释，配制一系列单抗溶液，横向加入酶标板中，50μL/孔；配制浓度为0ng/mL和4ng/mL的氯霉素 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 溶均液，每一抗体稀释倍数均设置0ng/mL和4ng/mL对照点，50μL/孔，25℃下温育30min。4)加酶标二抗：倒掉酶标板中的溶液，洗板5次，拍干后，加入100μL/孔的酶标二抗(1：4000稀释)，25℃下温育30min。5)显色：倒掉酶标板中的溶液，洗板5次，拍干后，分别加入50μL/孔的显色液A和50μL/孔的显色液B，25℃避光温育30min。6)终止反应：加入50μL/孔的终止液，振荡摇匀后，立即在酶标仪上测量A450nm。2.2.4.3竞争曲线的建立根据实验筛选出的最佳单抗稀释倍数绘制ELISA标准曲线。配制0、0.05、0.1、0.3、0.5、1、2、4ng/mL氯霉素标准溶液，实验步骤同2.2.4.2。以竞争抗原浓度为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线。2.3结果与讨论2.3.1单抗浓度测定10只小鼠中有2只死亡，一只没有腹水反应，剩余7只老鼠共提取6.4mL腹水，其中2.2mL为溶血腹水。对这两种腹水分别进行亲和纯化，结果如表2-3和2-4。表2-3溶血单抗纯化后吸光值管号123﹡45OD2600.0070.0210.4960.2790.018OD2800.0320.0580.8570.5120.069单抗含量//1.75mg0.54mg/﹡注：3号管为稀释2倍后的吸光值17华中科技大学硕士学位论文表2-4未溶血单抗纯化后吸光值管号123﹡45OD2600.0180.0130.4450.3430.049OD2800.20.0170.8450.5890.083单抗含量//3.6mg0.6mg/﹡注：3号管为稀释4倍后的吸光值根据经验公式，第一批纯化后的单抗总量为2.2mg，第二批纯化后的总量为4.2mg，共计获得单抗6.4mg。2.3.2单抗效价鉴定取两批纯化后的高浓度管进行对比实验，通过棋盘实验确定各自效价，结果如图2-1和2-2。如果竞争抗原浓度为0ng/mL和4ng/mL的两组A450nm值有明显差别，则可初步判定单抗具有反应活性。一般选取在0浓度下A450nm值接近1.5～2.0，且P/N值尽量较高的那个稀释倍数为单抗的最佳稀释倍数。从图2-1和2-2可选择溶血型单抗效价为15000，未溶血型单抗效价为35000。0ng/ml(P)24ng/ml(N)61.8P/N(右坐标轴)51.61.441.213A4500.820.60.410.2005000100001500020000稀释倍数18华中科技大学硕士学位论文图2-1溶血型单抗效价鉴定0ng/ml(P)2.54ng/ml(N)7P/N(右坐标轴)6251.54A4503120.510025000300003500040000稀释倍数图2-2未溶血型单抗效价鉴定2.3.3竞争曲线的建立分别配制0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL的CAP标准溶液，用竞争ELISA方法建立竞争曲线，结果如下图。100%90%80%70%60%50%B/B040%30%20%10%0%0.010.1110竞争CAP浓度（ng/ml）图2-3溶血型单抗竞争曲线(n=2)19华中科技大学硕士学位论文120.00%100.00%80.00%60.00%40.00%y=-1.1798x+0.9948R2=0.976920.00%0.00%00.10.20.30.40.50.6图2-4溶血型单抗线性回归曲线溶血型单抗其效价为15000，线性范围为0.05ng/mL～0.5ng/mL，IC50=0.41ng/mL，IC80=0.16ng/mL。100%90%80%70%60%50%B/B040%30%20%10%0%0.010.1110竞争CAP浓度(ng/ml)图2-5未溶血单抗竞争曲线(n=2)20华中科技大学硕士学位论文120.00%100.00%80.00%60.00%40.00%y=-0.7679x+1.0665220.00%R=0.96980.00%00.20.40.60.811.2图2-6未溶血型单抗线性回归曲线未溶血型单抗其效价为35000，线性范围为0.1ng/mL～1ng/mL，IC50=0.73ng/mL，IC80=0.34ng/mL。2.4本章小结1)本次实验通过体内诱生腹水法制备氯霉素单克隆抗体，利用ProteinG亲和层析柱对其进行纯化，通过经验公式估算得到约6.4mg的单抗。2)此次制备的单抗有部分溶血的现象，可能是由于注射或腹水提取时操作不当导致，通过对溶血型单抗和未溶血型单抗的比较发现，溶血对单抗产量及活性均影响不大。3)采用间接竞争ELISA法判定两种单抗均具有反应活性，可用于后续的标记免疫分析实验。溶血单抗效价为15000，线性范围为0.05ng/mL～0.5ng/mL，IC50=0.41ng/mL，IC80=0.16ng/mL；未溶血单抗效价为35000，线性范围为0.1ng/mL～1ng/mL，IC50=0.73ng/mL，IC80=0.34ng/mL。21华中科技大学硕士学位论文3.DTT还原条件的探索在SMCC法偶联中，抗体中二硫键的还原不仅提供了偶联反应必须的巯基，还是定向偶联的关键步骤。抗体还原不足时，抗体利用率较低，偶联物活性不高；抗体还原过度则会导致抗体活性丧失。因此，必须对DTT还原条件进行优化。本章从DTT投料比、DTT反应温度、反应时间对还原条件进行探索，并采用凝胶层析、电泳、ELISA等方法对产物结构与活性进行鉴定。3.1还原产物鉴定方法的研究3.1.1仪器与试剂3.1.1.1仪器表3-1主要仪器名称型号来源紫外可见分光光度计TU-1901北京普析通用仪器有限公司数字式酸度仪PHS-3C上海雷磁仪器厂电泳仪DYY-7C北京市六一仪器厂AKTA蛋白纯化仪Purifier100GEhealthcareHistrapdesaltingG255mLGEhealthcareSuperdex20024mlGEhealthcare恒温箱SP060上海实验仪器有限公司水浴锅DKB-600BBuLepaid公司分析天平BS110S北京Satrorius仪器系统有限公司22华中科技大学硕士学位论文3.1.1.2试剂表3-2主要试剂名称规格生产厂商DTT99%Sigma公司牛血清白蛋白（BSA）98%Seebio公司DTNB99%Sigma公司GSH98%Sigma进口分装碘乙酰胺（IAAm）98%Sigma进口分装Tween-20分析纯国药集团化学试剂有限公司γ-球蛋白99%Sigma进口分装卵清蛋白（OVA）98%Biogreen分装3.1.2实验方法3.1.2.1巯基含量的测定1)取100μL10mg/mLγ-球蛋白于EP管中，按一定的偶联比加入DTT，25℃反应30min。2)用HistrapdesaltingG25在AKTApurifier100上进行脱盐，缓冲液为PBS，流速为5mL/min，检测样品280nm处吸收峰，收集样品。3)取50μL收集的样品与50μL1mg/mLDTNB反应，测412nm处的吸光值。3.1.2.2巯基的封闭1)取100μL10mg/mLγ-球蛋白于EP管中，按一定的偶联比加入DTT，25℃反应30min。2)配置浓度为70mg/mL的IAAm溶液，按一定比例加入IAAm溶液，反应一段时间以封闭游离巯基，然后测412nm处得吸光值。3.1.2.3产物凝胶层析分析1)取100μL10mg/mLγ-球蛋白于EP管中，按一定的偶联比加入DTT，25℃反应30min。2)反应物经IAAm处理后4000r/min离心8min后，用Superdex200在AKTApurifier23华中科技大学硕士学位论文100上进行层析分析，洗脱缓冲液为PBS，流速为1mL/min，收集洗脱液，1mL/管，并观察不同条件下产物的组成。3.1.2.4产物电泳分析1)取100μL10mg/mLγ-球蛋白于EP管中，按一定投偶联比加入DTT，25℃反应30min。2)反应物经IAAm处理后稀释至约0.5～1mg/mL的浓度后上样，电泳缓冲液的配制及电泳方法参照[42]。3.1.3结果与讨论3.1.3.1巯基含量测定方法的优化Ellman试剂[43]，也称为DTNB，该试剂是一种通用的定量溶液中自由巯基的水溶性化合物。反应原理如下图，该化合物的溶液与巯基反应会产生黄色的化合物（TNB），这种化合物可以通过测定其412nm处的吸光值定量。在样品测定之前，先利用已知含量的巯基化合物绘制一条标准曲线，然后将测量值与标准曲线进行比较即可测定样品中的巯基的量。图3-1DTNB检测巯基反应原理图3.1.3.1.1DTNB加入量的确定取1mg/mL的γ-球蛋白溶液300μL于EP管中，加入6μL1mol/L的DTT溶液，室温反应30min，反应后的产物用HistrapDesaLting脱盐，收集约1mL溶液，取其中200μL测定巯基含量。分别按体积比4：1、2：1、1：1、1：2加入1mg/mLDTNB反应，测412nm的吸光值，结果如表3-3。24华中科技大学硕士学位论文表3-3不同DTNB加入量时反应物的吸光值（投料比为3000）200uL收集物DTNB50uL100uL200uL400uLA412nm0.1450.1870.2370.245由实验结果可知，由于蛋白质浓度较低，吸光值整体偏低，变化趋势不明显。另外，本实验没有考虑到DTNB自身吸光值的影响，需进一步改进实验方案。3.1.3.1.2DTNB自身吸光值的影响实验室条件下，配制DTNB饱和溶液为1mg/mL，因此只能在1mg/mL浓度以下选择一些浓度，因此分别配置0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL、25μg/mL的DTNB溶液，取50μL各浓度反应液，与等量的PBS混合后测其412nm吸光值，结果如图3-2。此曲线可用于测量过程中DTNB自身背景的扣除。0.180.16y=0.3181x-0.002R2=0.98780.140.120.1OD4120.080.060.040.02000.10.20.30.40.50.6DNTB浓度（mg/ml）图3-2不同浓度DTNB的吸光值3.1.3.1.3提高γ-球蛋白浓度后DTNB加入量的确定将γ-球蛋白浓度由1mg/mL提高到10mg/mL，取100μL加入12μL1mol/L的DTT溶液，其他步骤同错误！未找到引用源。，结果如图3-3。由图可知，当DTNB浓度大于31.25μg/mL时，DTNB是过量的，可用于DTT投加量小于12μmol/mgIgG样品的巯基含量测定。为便于配制试剂，后续实验中均使用0.25mg/mL的DTNB。25华中科技大学硕士学位论文0.70.60.50.4OD4120.30.20.10100050025012562.531.251684DTNB浓度(ug/ml)图3-3不同浓度DTNB检测样品时吸光值的变化图（投料比1200，已扣除DTNB自身背景吸收）3.1.3.1.4稳定性分析1)DTNB的稳定性取100μL1mg/mLDTNB溶液，在412nm处做时间扫描，时间为30min，结果如图3-4，在30min内，吸光值保持在0.36左右，因此，DTNB在30min内是稳定的。图3-4DTNB时间扫描图谱26华中科技大学硕士学位论文2)显色产物的稳定性取100μL100μg/mLγ-球蛋白于EP管中，加入12μL1mol/L的DTT溶液，25℃反应30min脱盐后，取50μL反应液加入等量0.25mg/mL的DTNB，在412nm处做时间扫描，时间30min，吸光值由0.728变至0.715（扣除DTNB吸光值0.04），可认为混合后的反应物在30min内是比较稳定的。3.1.3.2巯基封闭条件的优化3.1.3.2.1封闭剂的选择巯基是极不稳定，具有较高的亲核反应活性，因此，为了避免巯基变化对实验造成影响，必须先将巯基封闭。目前的巯基保护剂分两种：可逆型和永久型，本实验以氧化型GSH和碘乙酰胺为代表物来研究其巯基封闭效果的差异。取100μL100ug/mLγ-球蛋白于EP管中，加入4μL1mol/L的DTT溶液（投料比为600），25℃反应30min，按封闭剂/含巯基物质为10:1加入巯基保护剂（GSH终浓度为10mmol/L、IAAm浓度为70mg/mL），25℃反应30min(GSH反应1h)，反应完后用Superdex200在AKTApurifier100上进行分离，结果如图3-5。DABC图3-5两种封闭剂封闭后层析图谱，A:10mg/mLγ-球蛋白；B:GSH封闭；C:IAAm封闭；D：电导图谱27华中科技大学硕士学位论文如图3-5所示，GSH封闭后的结果与未经DTT还原的IgG差别不大，而经过IAAm封闭后可明显看出IgG被DTT还原成不同程度的片段，表明IAAm可有效阻止DTT还原生成的巯基重新结合生成二硫键。因此，后续实验中选择IAAm作为巯基封闭剂。3.1.3.2.2IAAm加入量的优化为简化实验过程，以还原型GSH代替IgG还原产物进行实验，优化IAAm封闭巯基的实验条件。1)取0.05mg/mL的GSH溶液100uL，加100uL不同浓度的IAAm溶液，IAAm与GSH投料比分别为10：1、20：1、50：1、100：1。2)取50μL0.25mg/mLDTNB溶液加入上述反应液中，测412nm处吸光值，结果见图3-6。0.50.450.40.350.30.25OD4120.20.150.10.050102050100IAAm/GSH图3-6碘乙酰胺加入量对巯基封闭效果的影响实验结果表明，封闭效果随碘乙酰胺加入量有所提高，当碘乙酰胺与GSH的摩尔比大于50后，封闭率基本恒定。3.1.3.2.3封闭时间的优化步骤同3.1.3.2.2，IAAm封闭时间依次为15min、30min、45min、60min、90min、120min，比较不同反应时间下OD412的变化，结果见图3-7。从结果看，延长碘乙28华中科技大学硕士学位论文酰胺封闭巯基的反应时间，有利于巯基的封闭。0.90.80.70.60.5OD4120.40.30.20.10020406080100120140时间(分)图3-7碘乙酰胺封闭时间对封闭效果的影响3.1.3.2.4封闭温度的优化控制IAAm封闭反应的温度分别为25℃和37℃，考察温度对反应的影响，结果见图3-8。在37℃条件下，反应速度较快，封闭效果较好，因此，提高温度有利于巯基封闭。70%60%50%40%30%封闭率(％)20%10%0%2537温度(℃)图3-8碘乙酰胺反应温度对封闭效果的影响(n=2)3.1.3.2.5pH的优化由于DTT还原的适宜pH范围为7.0-8.1，所以在这一范围附近优化pH条件，29华中科技大学硕士学位论文选择pH为7.3、7.7、8.1、8.4，结果如图3-9。提高反应的pH有利于巯基封闭，根据DTT反应的适宜pH可选择pH8为最终反应pH。80%70%60%50%40%30%巯基封闭率(％)20%10%0%7.37.78.18.4pH图3-9pH对封闭效果的影响3.1.3.2.6巯基封闭时间曲线的建立选择IAAm作为封闭剂，反应温度为37℃，pH为8，IAAm与GSH投料比分别为10：1和50：1，作时间曲线。由图可见，当含巯基物质的量一定时，碘乙酰胺封闭反应完全后，混合物的OD412最终达到一个相同的平台期，由于碘乙