碱性脂肪酶

碱性脂肪酶[键入文字][键入文字][键入文字]3实验部分3.1样品的采集采集学校周围餐馆附近的土壤；按三角形分布形状采取三处土样（一，二，三），将采集的样品置于采样袋中带回实验室备用。3.2仪器与试剂3.2.1主要仪器ZHWY-1102型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；水浴恒温振荡器（上海亚荣生化仪器厂）；SW-CJ-1Cμ型双人单面洁化工作台（苏州净化）；AR2140型分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；离心机（无锡瑞江）；XFLS-50MA高压灭菌锅（浙江新丰医疗器械）；303-0型台式培养箱...

[键入文字][键入文字][键入文字]3实验部分3.1样品的采集采集学校周围餐馆附近的土壤；按三角形分布形状采取三处土样（一，二，三），将采集的样品置于采样袋中带回实验室备用。3.2仪器与试剂3.2.1主要仪器ZHWY-1102型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；水浴恒温振荡器（上海亚荣生化仪器厂）；SW-CJ-1Cμ型双人单面洁化工作台（苏州净化）；AR2140型分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；离心机（无锡瑞江）；XFLS-50MA高压灭菌锅（浙江新丰医疗器械）；303-0型台式培养箱（北京永光明医疗仪器）；JY98-3D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。3.2.2主要试剂及配制橄榄油（oliveoilCR）为上海毕高化学试剂公司产品；聚乙烯醇（PVA、CR）、溴甲酚紫（pH5.2(黄)～6.8（紫））为国药集团化学试剂有限公司产品；95%乙醇（AR）、蔗糖（AR）、氯化钾（AR）、硫酸镁（AR）、硫酸铵（AR）为天津科密欧化学试剂有限公司；蛋白胨（BR）为北京奥博星生物技术公司产品；甘氨酸（AR）为中国惠兴生化试剂有限公司产品。（1）2%聚乙烯醇（PVA）溶液：称取20g聚乙烯醇（PVA）加入去离子水800mL，在沸水浴中加热不断搅拌，直至全部溶解，冷却后用0.2mol/LNaOH调pH值为8.2，再定容至1000mL。（2）聚乙烯醇（PVA）橄榄油乳化液：取2%聚乙烯醇溶液150mL，加50mL橄榄油，用高速组织捣碎机搅拌6min，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下备用。（3）溴甲酚紫溶液（100mg/100mL）：准确称取0.01g溴甲酚紫加8mL蒸馏水搅拌溶解，转入10mL容量瓶中，定容至10mL，备用。（4）0.05mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液：称取1.88g甘氨酸，加入480ml水，用6mol/LNaOH调pH8.0，定容至500mL，备用，需新鲜配制。（5）0.05mol/LNaOH标准溶液：称取NaOH4.0g，用蒸馏水溶解定容至1000mL,用邻苯二甲酸氢钾标定,使用时再用蒸馏水稀释1倍，即为0.05mol/L的NaOH溶液。（6）1%酚酞指示剂：称取1.0g酚酞，溶于100mL95%乙醇溶剂中。3.3培养基（1）富集培养基（g/L）：蛋白胨4.0，酵母粉0.5，硫酸镁0.1，橄榄油乳化液4mL/L，pH值8.0～10.0。（2）平板分离培养基（g/L）：硫酸铵1.0，磷酸氢二钾1.0，氯化钾0.5，硫酸镁0.5，琼脂15，橄榄油乳化液75mL，溴甲酚紫10mL，pH值8.0～10.0。（3）马铃薯琼脂营养培养基（PDA）200g土豆洗净去皮切小块，加水1000mL煮沸半个小时,趁热纱布过滤后加水至IL，加葡萄糖20g，再加入20g琼脂，pH自然。（4）复筛培养基（g/L）：蛋白胨4.0，酵母粉0.5，蔗糖0.5，硫酸铵0.1，硫酸镁0.1，磷酸二氢钾0.1，橄榄油乳化液4mL，pH值8.0～10.0。3.4实验步骤3.4.1产脂肪酶微生物的筛选（1）富集培养：称5g土样于灭菌的100mL三角瓶中，每瓶中装45mL生理盐水，搅拌均匀，静置半个小时吸取样品悬液5mL于装有50mL富集培养基的250mL三角瓶中，28℃摇床培养48h。（2）初筛：吸取富集培养液1mL于9mL无菌生理盐水中，使其呈101的稀释液，同法继续稀释至10-5，取10-3、10-4、10-5三个稀释度菌悬液200µL涂布到平板分离培养基上(pH8～10)。28℃培养72h以获得产脂肪酶的菌株。观察培养基上是否有透明圈，根据产生透明圈的早晚和透明圈直径与菌落直径比值的大小，选取比值较大的菌株于PDA斜面培养基4℃保存，以备进一步复筛。（3）复筛：初筛分离后的菌株挑取适量(1～2环)转接到装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中，28℃条件下摇床培养48h，取2mL培养液，10000r/min离心20min，取上清液测定酶活。3.4.2酶活测定方法（1）脂肪酶活力的定义在40℃，pH值8.0条件下，每1min催化底物（橄榄油）产1μmoL脂肪酸所需的酶量定义为1个活力单位（U）。（2）脂肪酶活测定的方法采用碱滴定法测定酶活，50mL的三角瓶中加入4mLpH8.0的甘氨酸-NaOH缓冲液，5mL聚乙烯醇橄榄油乳化液，将其放置40℃水浴预热5min，然后精确加入1mL酶液，保温10min，立即加入15mL乙醇终止反应，加入酚酞指示剂2滴，用0.05mol/LNaOH滴定至红色为终点。计算公式如下：QUOTEV1—测试酶溶液滴定消耗的NaOH体积；V2—对照滴定消耗的NaOH体积；0.05—标准NaOH摩尔数（mol/L）；t—为反应时间，min；n—稀释倍数。

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