3、毒理学第三讲 长期毒性试验

长期毒性作用及其试验方法第一节基本概念和目的一、定义：药物以一定的等级剂量连续多日给予受试动物的有害作用，为观察这种有害作用而设计的毒理学试验称之为长期毒性试验。二、分类亚慢性毒性试验长期毒性试验：慢性毒性试验（根据给药期限长短）终生毒性试验/数代毒性试验亚慢性毒性(subchronictoxicity)是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化合物所引起的毒性效应。慢性毒性(chronictoxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。•一般地说，亚慢性毒性试验给药期限不超过90天或不超过试验动物平均寿命的10％；•凡超过90天或平均寿命10％的都可认为是慢性毒性试验。三、长期毒性试验与急性毒性试验的根本差异1.给药的期限不同急性毒性试验为一次性给药或24h内多次给药。长期毒性试验为连续多日接触一定剂量给药，给药期限可以从数天至终生甚至数代，一般为临床用药的3-4倍。表3-1常用实验动物的平均寿命及长期毒性试验给药期限试验动物平均寿命（年）亚慢性试验给药期限（月）慢性试验给药期限（月）大白鼠2.53＞3家兔67＞7狗1012＞12猴1518＞182.给药的剂量范围不同长期毒性试验的给药剂量比急性毒性要小得多。--急性毒性试验为一次性大剂量给药；长期毒性试验为低剂量长期积累。急性试验无毒的药物，长期反复给药后，虽然在较低的剂量水平，但是由于量与质上的积累作用，可能会导致生理内环境的紊乱，产生毒性反应。蓄积毒性作用药物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。蓄积毒性作用的分类物质蓄积(materialaccumulation)：指机体少量反复多次接触毒物后，该毒物在机体内逐渐积累。可以用一定的分析方法测得体内该化合物或其代谢产物的增加过程。这种蓄积随着时间延长而含量增加,当达到中毒阈值时而产生毒性作用。功能蓄积(functionalaccumulation)：指机体少量反复多次接触毒物，每次引起的轻微功能损害逐渐蓄积，当积累到一定程度时出现毒性效应，而这时用 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 手段却查不出机体内毒物的存在或增加。3.所观察的毒效应不同急性毒性试验；以死亡为效应的质反应过程；长期毒性试验：一般毒性的量反应指标，如体重、摄食量、血液学、血液生化指标等四、长期毒性试验的试验目的1、发现在急性毒性试验中未发现的毒作用，为受试物的毒作用研究提供新的信息；2、描述毒反应的性质和程度；3、研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；4、研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量—反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值；5、研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性；6、探讨可能的毒作用机制；7、确定不同动物物种对受试物长期毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。第二节长期毒性试验设计一、一般原则和要求1.剂量组：至少高、中、低三个剂量组，高剂量组应充分反映药物的毒性，低剂量组不出现毒性反应。同时应设溶剂或者已知药物的毒性对照组。2.动物：应是年轻健康、来源清楚，对药物敏感、与人类代谢相类似的动物。3.给药途径：与临床拟用途径一致。4.观察指标：应能反映实验动物功能及结构的完整性是否受到损害。一般是以药政部门的技术要求 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 为核心，同时兼顾给药时限和给药剂量这两个重要因素，对整个长期毒性试验做一个较为合理的安排和设计，力争高效率、全面地了解药物长期给药所造成的有害反应及量效关系。二、实验动物选择1.动物的品种和品系两种种属的动物啮齿类：大鼠、小鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：犬、猴根据不同接触途径和试验要求，选择不同的物种。原则：对受试药物敏感；与人体的生物转化相近；易于获得且便于饲养和管理；毒理学研究背景资料较多。•SD大鼠•生长快，繁育性能好，大多用于安全性试验及营养与生长发育有关的研究。•该品系对性激素敏感，对呼吸道疾病有较强的抵抗力。广泛用于药理、毒理、药效及GLP实验。•比格犬（Beagle）来源：原产英国，是猎犬中较小的一种。由于体型适中、性情温顺、遗传性状稳定、实验结果重复性好、适应性强等优点，被广泛应用于生命科学领域。在以犬为实验动物的研究成果中，只有应用Beagle才能被国际公认。•猕猴•猕猴（Rhesusmonkey；MacacamulattaZimmermann）属哺乳纲，灵长目，猴科，猕猴属动物。•猕猴是猕猴属猴的总称，共有12个种系，其中恒河猴分布最广，数量最多，应用最广，猕猴作为灵长类动物，是人类的近属动物，在组织结构、生理和代谢功能等方面同人类相似，最易解决人类相似的疾病及其发病机制，有些人类疾病只有用猕猴做实验才能成功，是其它实验动物不可替代的。•包括猕猴在内的非人灵长类与人类的遗传物质有75%~98.5%的同源性，显示了许多相似的生物学和行为学特征，成为解决人类健康问题的疾病问题的基础研究和临床前研究的理想动物模型。实验动物按微生物控制 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的分级一级普通动物（CV），系指微生物不受特殊控制的一般动物。要求排除人兽共患病的病原体和极少数的实验动物烈性传染病的病原体。用于教学。二级清洁动物（CL），要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。用于一般动物实验。三级无特殊病原体动物（SpecificPathogenfree,SPF)，要求到二级外，还要排除一些规定的病原体。四级无菌动物（Germfree,GF），要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。此类动物系在无菌条件下剖宫产出，又饲养在无菌、恒温、恒湿的隔离屏障内。五级悉生动物（Gnorobioticanimal,GN），在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。2、起始月（周）龄多选择较年轻或正处于生长发育阶段的动物，原因：1)长期试验的给药期限较长；2)处于生长发育阶段的动物对药物的毒性反应较敏感；3)年龄较大的动物反应性降低，存在较多自发性疾病干扰试验结果。•大鼠：4~9周龄beagle犬：4~9月龄（6月）•动物的起始体重应在平均体重的20%范围之内3、性别与数量4、动物的饲养管理•温度：啮齿类动物18～27℃（70～72°F）•湿度：相对湿度为40～70％。空气中水分太少，动物的粘膜和眼睛易干燥，湿度太大，又适宜细菌和真菌生长，容易造成动物呼吸道和皮肤等处感染，尿液和排泌物不易蒸发干，增加饲养室内的异味；•光照：持续12小时明亮，12小时黑暗，有利于刺激动物甲状腺激素、促肾上腺皮质激素和生长激素的分泌；•通风条件：•饮水质量：亚慢性毒性试验年龄：大鼠80~100g狗8~12月小鼠10~15g数量：小动物≥20大动物≥6性别：雌雄各半慢性毒性试验年龄：大鼠50~70g狗<8月小鼠初断乳数量：小动物≥40大动物≥8性别：雌雄各半•饲料配方：所用饲料应符合动物的营养标准，若用自已配制的饲料，应提供配方及营养成分含量的检测 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 ，若是购买的饲料，应注明生产单位。•大鼠雌雄应分开饲养，每笼不宜超过5只，实验前至少饲养观察一周。•狗要求单笼饲养，定量喂食，Beagle狗实验前至少训养1～2周；杂种狗应先检疫，打预防针，驱虫，实验前训养3～4周，观察记录动物的行为活动、饮食、体重、精神状况、心电图，检测心、肝、肾功能两次，选择正常、健康、雌性无孕的动物作为受试动物。三、给药期限•工业毒理学——3－6个月•食品毒理学——6个月~1年•环境毒理学——6个月~1年•药物毒理学——临床疗程的3~4倍•致癌试验——接近或等于动物的预期寿命创新药物试验周期不少于90天，超过180天的新药可以在试验开始90天后同时进行I期临床试验。（p153表14-2我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定）四、剂量水平的选择高剂量组：足以引起明显的或严重的毒性反应，但又不能造成太多动物中毒死亡，死亡率应控制在10%以内的剂量；低剂量组：不引起毒性作用的剂量；中间剂量组：为表明毒性作用的量-效关系，在上述两个剂量之间按照一定的倍比关系至少插入一个中间剂量组。溶剂对照组：给予与高剂量组相同体积的溶剂。在选择合适的剂量时还应考虑到：（p154）①供试药物在体内的生物蓄积作用：测定有关的蓄积参数，有助于了解药物的蓄积性。对于高蓄积性药物应适当减少剂量；②供试药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被供试药物本身所诱导或抑制。例如，某些药物如果抑制与其本身代谢或解毒有关的酶，则该药物的给药剂量应酌情减少。③供试物在消化道中的稳定性，与胃肠道内容物有亲和性的药物，应酌情增加剂量。补充蓄积毒性试验方法及其 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 •化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。•蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。亚慢性毒性的剂量选择•阴性对照组•低剂量组•中剂量组•高剂量组急性毒性的阈剂量1/20~1/5LD50•组距：3~10倍，最低不小于2倍慢性毒性的剂量选择•阴性对照组•低剂量组•中剂量组•高剂量组亚慢性阈剂量或其1/5~1/2、1/10LD50•组距：2~5倍，最低不小于2倍蓄积系数(accumulationcoefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即：K＝ED50(n)/ED50(1)K＝LD50(n)/LD50(1)表蓄积系数分级标准蓄积系数（K）蓄积毒性分级＜1高度蓄积1~明显蓄积3~中等蓄积5~轻度蓄积1.固定剂量法：常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出LD50，然后选取相同条件的40只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。试验组在1/20～l/50LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量[LD50(n)]，根据公式计算K值，进行评价。但若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。2.剂量递增法：在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD50，即K＞5。使用本方法时要注意染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物的染毒绝对量。3.剂量固定的20天蓄积法：通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20LD50、l/10LD50、1/5LD50和1/2LD50四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。试验结束时根据下列标准进行评定：①蓄积性不明显：各剂量组均无死亡；②弱蓄积性：仅1/2LD50剂量组有死亡，其他组均无死亡；③中等蓄积性：1/20LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系；④强蓄积性：1/20LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系。剂量设定方法1.半数致死量法1/10LD50、1/50LD50和1/100LD50三个剂量组2.短期蓄积试验过渡法急性毒性试验3.临床拟用剂量法（ACD）•根据同类型药物或国外资料或临床拟用剂量推算，一般3个月长期毒性试验时，大鼠高、中、低剂量组可分别采用50-100倍、25-50倍和10-20倍临床剂量，狗可分别采用30-50倍、15-25倍和5-10倍临床剂量，猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量。4.等效剂量法：•根据人和动物的等效剂量比值，再按照一定倍数扩大。体表面积法补充背景知识：早在十九世纪末年，生理学家Voit氏等发现虽然不同种类的动物每kg体重单位时间内的散热量相差悬殊，但都如折算成每m2体表面积的散热量，则基本一致。例如马、猪、狗、大鼠和人的每m2体表面积每24小时的散热量都在1000kCal左右。药理学家研究药物在体内的作用时则习惯于以mg/kg或g/kg等方式来计算药物的剂量。这种办法行之于同种动物的不同个体时，问题似乎不大；但用于不同种类动物时，常常会出现严重偏小或偏大，以致无法完成实验。1958年Pinkle氏报告6-MP等抗肿瘤药物在小鼠、大鼠、狗和人身上的治疗剂量，按mg/kg计算时差距甚大，但如改为按mg/m2体表面积计算，就都非常接近，此后，按体表面积计算剂量的概念逐渐为药理学家接受，被认为尤其适用于不同动物之间剂量的换算。1)A=K*（W2/3/10000）--Meeh-Rubner公式A为体表面积(以m2计算)，W为体重（以克计算），K为常数（随动物种类而不同，小鼠、大鼠是9.1、豚鼠9.8、家兔10.1、猫9.8、狗11.2、猴11.8、人11.6）表3-3不同种类动物间剂量换算时的常用数据动物种类Meeh-Rubner公式的K值体重（kg）体表面积（m2）mg/kg-mg/m2转换因子每kg体重占有体表面积相对比值小白鼠（20g）9.10.0200.00673.01.0大白鼠（200g）9.10.200.03115.80.47豚鼠（400g）9.80.400.05327.50.40家兔（2kg）10.12.000.160812.40.24猫（2.5kg）2.500.132413.70.22犬（10.0kg）11.210.000.519919.20.16猴（3.0kg）11.83.000.245512.20.24人（50kg）10.550.001.438634.80.082)转换因子（mg/kg转换成mg/m2）乙动物的适用剂量（mg/kg）=甲动物剂量（mg/kg）×甲动物转换因子/乙动物转换因子3）每kg体重占有体表面积相对比值（方法3）、4）、5）见下例题详述）4）体表面积折算的等效剂量比值5）每公斤体重剂量折算系数蓄积毒性试验和/或7天短期重复给药试验90天重复给药试验180天或更长期重复给药试验例：某利尿药大白鼠灌胃给药时的剂量为250mg/kg左右，试粗略估计犬灌胃给药时可以试用的剂量。解1--直接计算法：实验用大白鼠的体重一般在200g左右，其体表面积（A）为：A=9.1×(2002/3/10000)=0.0311m2。250mg/kg的剂量如改以mg/m2表示，即为（250×0.2）/0.0311=1608mg/m2实验用犬的体重一般在10kg左右，其体表面积（A）为：A=11.2×100002/3/10000=0.5198m2于是：1608×0.5198/10=84mg/kg(犬的适当试用剂量)。解2--按mg/kg折算mg/m2转换因子计算：mg/kg-mg/m2转换因子见表3-3。250×5.8（大鼠的转换因子）/19.2(犬的转换因子)=75mg/kg(犬的适当试用剂量)解3--按每kg体重占有体表面积相对比值计算：各种动物的“每kg体重占有体表面积相对比值（简称体表面积比值）”见表3-3。250×0.16（犬的体表面积比值）/0.47（大鼠的体表面积比值）=85mg/kg解4--按人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表计算：见表3-4，12kg犬的体表面积为200g大白鼠的17.8倍。该药大白鼠需给药250×0.2=50mg于是，犬的适当试用剂量为50×17.8/12=74mg/kg表3-4人和动物间按体表面折算的等效剂量比值表动物小白鼠（20g）大白鼠(200g)豚鼠(400g)家兔(1.5kg）猫(2.0kg)猴(4.0kg)犬(12kg)人(70kg)小白鼠（20g）1.07.012.2527.829.764.1124.2387.9大鼠(200g)0.141.01.743.94.29.217.856.0豚鼠(400g)0.080.571.02.252.45.24.231.5家兔(1.5kg)0.040.250.441.01.082.44.514.2猫(2.0kg)0.030.230.410.921.02.24.113.0猴(4.0kg)0.0160.110.190.420.451.01.96.1犬(12kg)0.0080.060.100.220.230.521.08.1人(70kg)0.00260.0180.0310.070.0780.160.321.0解5--按人与各种动物以及各种动物之间用药剂量换算：分析：已知A种动物每kg体重用药量，欲估B种动物每kg体重用药剂量时，可查表3-5，找出折算系数（W），再按下式计算：B种动物的剂量（mg/kg）=W×A种动物的剂量（mg/kg）。则：查A种动物为大鼠，B种动物为犬，交叉点为折算系数W=0.28，故犬用药量为0.28×250mg/kg=70mg/kg。表3-5动物与人体的每千克体重剂量折算系数表折算系数WA种动物或成人小鼠0.02kg大鼠0.2kg豚鼠0.4kg兔1.5kg猫2.0kg犬12kg成人60kgB种动物小鼠0.02kg1.01.41.62.73.24.89.01大鼠0.2kg0.71.01.141.882.33.66.25豚鼠0.4kg0.610.871.01.652.053.05.55兔1.5kg0.370.520.61.01.231.762.30或成人猫2.0kg0.300.420.480.811.01.442.70犬12kg0.210.280.340.560.681.01.88成人60kg0.110.160.180.3040.3710.5311.0五、给药方法一般应尽量与预期临床使用的途径相一致；对于试验周期长需要静脉或肌注给药有困难时，可用腹腔或皮下注射代替。①经消化道②经呼吸道③经皮肤④经口给药经口给药：•对非啮齿类大动物，如狗、猴可采用经胃管灌胃或片剂、胶囊给药，也可以将药物混于动物喜食的饲料中一次给予。•啮齿类动物口服可采用灌胃或拌在食物中给药。饲喂法：•优点：符合自然进食，没有外界刺激。•缺点：给药剂量和给药时间不易掌握。•按每公斤体重计算，月龄小的动物食耗往往比较大。为了在整个试验过程中确保剂量的一致性，必须每周或每两周调整一次饲料中药物的量，一直进行到动物成年或食耗率稳定。灌胃法：•优点：给药剂量精确，给药时间易于掌握。•缺点：技术要求较高，误灌或呛入气管会造成动物死亡，从而影响试验结果的正确性；是一种外界刺激，容易造成一些假象；有人证明用金属胃管灌胃6-12个月可使大鼠胸腺萎缩,，在这一点上将供试物拌入饲料中给药有其一定优越性。（P157计算与实例）预计第3周动物体重(w)：W3rd=W2nd+1/2(W2nd-W1st)W1st、W2nd分别为实测的第1、2周动物的组平均体重。W3rd为预计第3周动物的组平均体重；预计第3周食耗(Fc)：FC3rd=FC2nd+1/2(FC2nd-FC1st)FC1st、FC2nd分别为实测的第1、2周动物的组平均食耗，FC3rd为预计第3周的组平均食耗。预计的第3周食耗率：R3rd=FC3rd/W3rd=g饲料/kg体重/动物/天第3周饲料中的药物浓度应为：C3rd=给药剂量(mg/kg体重/动物/天)/R3rd(g饲料/kg体重/动物/天)实例：在本周一，实验人员想知道从本周四至下周四期间，20只大鼠以10mg/kg/天的剂量水平给药，所需制备的饲料中含药的浓度和总药量。已知前两周动物的组平均重为150和250g，组平均食耗为20及30g/个动物/天，则:W3rd=250+(250—150)/2=0.3kg/动物FC3rd=30+(30—20)/2=35g/动物/天R3rd=35(g/动物/天)/0.3(kg/动物)=116.67(g饲料/天/Kg体重)饲料中的药物浓度应为：C3rd=10（mg受试物/kg体重/天）/116.67(g饲料/天/kg体重)=0.086(mg受试物/g饲料)=86mg/kg饲料因为预计的平均食耗为35g/动物/天，则20个动物、7天至少需要饲料4.9kg，35g×20×7=4900g=4.9kg86mg/kg×4.9=421.4mg，将这些供试物与4.9kg的饲料充分混匀即可。注意点：1.确保受试物与食物充分地混匀。2.应尽量避免因供试物异味而造成的实验动物拒食的情况。（split-platepalatabilitytest)3.对饲料中的供试物浓度必须作阶段性检查，以分析在室温下存放的时间与给药时间一致的残留样品，以确保供试物在饲料中的稳定性。4.供试物在饲料中的含量不应超过5%，如超过10%仍不能反映供试物的毒性，一方面应考虑动物实际营养物摄入的不足，另一方面只能考虑改用灌胃给药。六、观察及测定指标动物至少应被驯养观察1-2周，应对试验动物进行外观体征、行为活动、摄食量和体重检查；非啮齿类动物还至少应进行2次体温、心电图、有关血液学和血液生化学指标的检测。1.一般综合性观察指标：外观体征、行为活动、体重、食物利用率2.一般化验指标3.系统尸解和病理学检查：（1）脏器湿重、脏器系数（脏/体比值）（如肝/体比，即(全肝湿重/体重)×100）（2）病理学检查4.特异性指标（一）生长率•生长率是动物对连续的食物及饮水供给的反应，以一个固定的时间表记录食耗与体重，饮水量至少应半定量或定性地在组间作出较。体重增长资料结合食耗可表明食欲的变化及食物利用率的变化。•这两个参数对化学异物的反应十分敏感，通常成为某些低毒化学异物仅有的毒性现象。•在整个实验过程每周称一次体重。•生长率变化的表示可将给药组与对照组同期体重绝对增长的重量加以比较并进行统计学处理。也可将给药组与对照组同期体重百分增长率(以给药开始时动物体重为100％)进行比较，并进行统计学处理。（二）食耗•食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率，即单位体重增长的食物需求的影响。•食耗的计算通常是将加入供食器具中饲料的重量减去剩余的饲料重量再除以给食天数而得到。（三）器官重量器官重量：对动物器官的重量进行组间比较，可以揭示受试物毒作用的特异靶器官。器官重量降低，表示该器官萎缩或发育不良，器官重量增加提示可能有充血、水肿、增生、肥大、酶诱导变化或新生物等。•将动物处死后取出上述器官，除去附着的组织、除尽余血后立即称重。•器官重量在进行统计学处理时常表达为单位体重的重量，即器官系数(器官重量/体重)。长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官脑心脏肝脏肺脏脾脏肾脏肾上腺胸腺睾丸附睾子宫卵巢（四）血液学指标●红细胞计数●血红蛋白●红细胞容积●平均红细胞容积●平均红细胞血红蛋白●平均红细胞血红蛋白浓度●网织红细胞计数●白细胞计数及其分类●血小板计数●凝血时间1、红细胞计数1)参考范围男性（4.09~5.74）×1012/L女性(3.68～5.74)×1012/L新生儿(6.0～7.0)×1012/L儿童(4.0～4.5)×1012/L2）红细胞增多相对性增多各种原因所致大量失水，血液浓缩绝对性增多生理性：高原生存、新生儿、剧烈运动病理代偿性和继发性：各种导致机体组织缺氧的疾病，肺气肿、肿瘤真性红细胞增多3）红细胞减少造血物质缺乏（如营养不良引起）脊髓造血功能低下（白血病）红细胞破坏或丢失过多（溶血性贫血、出血等）继发性贫血（如各种炎症、结缔组织病、内分泌病）外周血红细胞计数在反映溶血和红系造血功能方面都不灵敏，特别是对试验周期较短的长期毒性试验来说，单靠RBC计数来判断受试物对红系的影响可能会导致错误结论，因为RBC寿命长，平均为120天。在此期限内，即使骨髓红系造血功能受到抑制，外周血象却还没有表现出明显的变化。在溶血的情况下，机体可以从贮存库中将RBC动员出来，使外周血的RBC不致明显下降。血液网织红细胞计数是一个非常敏感的指标，其计数下降提示红系造血障碍，增高提示溶血现象。2、白细胞计数1）参考范围成人末梢血（4.0~10.0）×109/L成人静脉血(3.5～10.0)×109/L新生儿(15.0～20.0)×109/L6个月-2岁儿童(5.0～12.0)×109/L2）白细胞增多生理性病理性各种感染（尤其是金葡菌、肺炎链球菌等化脓性感染）糖尿病酮症酸中毒白血病、恶性肿瘤、尿毒症有机磷、催眠药中毒3）白细胞减少疾病：主要见于流行性感冒、麻疹、再生障碍性贫血用药：磺胺药、解热镇痛药、抗甲状腺药、抗肿瘤药特殊感染：革兰阴性菌感染(伤寒、副伤寒)、结核分枝杆菌感染、病毒感染(风疹、肝炎)、寄生虫感染(疟疾)。4）白细胞分类计数中性粒细胞0.50～0.70(50%～70%)嗜酸性粒细胞0.01～0.05(1%～5%)嗜碱性粒细胞0～0.01(0%～1%)淋巴细胞0.20～0.40(20%～40%)单核细胞0.03～0.08(3%～8%)（五）血液生化学指标●天门冬氨酸氨基转换酶（AST）●丙氨酸氨基转换酶（ALT）●碱性磷酸酶（ALP）●肌酸磷酸激酶●尿素氮（BUN）●肌酐（Crea）●总蛋白（TP）●白蛋白（ALB）●血糖（Glu）●总胆红素（T-BIL）●总胆固醇（T-CHO）●甘油三酯（TG）1）氨基转移酶：氨基转移酶又称为转氨酶，广泛存在于机体组织细胞内，尤其以肝、心肌、肾等细胞内活力最强。其作用为催化氨基酸的α-氨基和α-酮酸的氨基互换，在氨基酸的合成和分解中起重要作用。ALT（GPT，谷丙转氨酶）存在于细胞质可溶部分，肝组织中含量为血清中的10倍，当肝细胞发生炎症或坏死时，肝细胞内的GPT可进入血液导致血中含量增高，血清中GPT含量增加与肝细胞的病变程度大致平行，故对判断肝脏损害有较重要的意义。正常成人ALT＜40U/LAST（GOT，谷草转氨酶）在心肌中含量较高，当心肌炎、心肌梗塞等病变时，AST可明显升高。正常成人AST＜40U/L肝脏疾病：急性或轻型肝炎：AST升幅不高于ALT（AST/ALT＜1）慢性肝炎（尤其肝硬化）：AST的升幅高于ALTAST/ALT比值有助于肝病的鉴别诊断2）总胆红素：胆红素由红细胞裂解而转化释出，血中大部分胆红素与白蛋白相结合，称为游离胆红素，胆红素在肝脏中与葡萄糖醛酸相结合成水溶性的结合物，称为结合胆红素，通过胆小管进入到胆汁中，两者合称为总胆红素。在肝胆管堵塞或肝细胞损伤的情况下，胆红素返流入血液出现高胆红素血症而使组织黄染。该指标对大鼠和狗来说，不如对人那样有意义。因为狗和大鼠的胆红素肾阈值都较低，可大量从尿排出，正常动物尿胆红素可达＋＋，而血胆红素不会升到很高的水平。3）碱性磷酸酶（ALP）：存在于骨、肝和肾脏中，也存在同功酶。该酶催化磷酸基团向适宜的受体羟基上转移。成骨细胞活性增强、肝功能损伤、胆汁淤积时该酶的活性升高，而营养缺乏时，该酶活力下降。4）总蛋白：血浆总蛋白含量一般都是随白蛋白减少而下降，但常又为滞后的代偿性球蛋白增加所复杂化。总蛋白检查是主要检测肝功能代谢能力的试验，反映肝脏的储备能力。5）白蛋白：血清中白蛋白全部由肝细胞制造，具有维持胶体渗透压的功能，当降低至3g％时，一般均会出现全身性水肿，常见于蛋白质摄入不足、合成功能不全（如肝脏实质性病变）、消耗或丢失过多等情况。白蛋白/球蛋白比值小于1，提示有慢性肝炎、肝硬化、肝实质性损害、肾病综合征。6）非蛋白氮（NPN）：尿素、肌酸、肌酐、尿酸和氨基酸等统称为非蛋白氮，为蛋白质代谢的中间或终产物，均经肾小球滤过随尿排出体外。其中尿素氮约占非蛋白氮的一半，当肾毒性、肾小球病变而致滤过率降低（如急性肾小球肾炎）、肾血流量减少、泌尿道阻塞肾组织压力增加以及蛋白质分解代谢增加时，血清尿素氮含量升高，过分饮水和严重肝损伤时则有所下降。肌酐是存在于循环中的废物，肾功能发生严重损伤时，肌酐才开始增高。7）葡萄糖：是存在于血液中的营养性物质，可被体内包括红细胞在内的各种细胞所利用。为此，在采血后应尽快地进行测定，以免血糖值偏低。当胰岛素不足、肾上腺皮质功能亢进、肾上腺素过多等情况下，血清葡萄糖水平升高，而胰岛素过多、糖皮质激素不足、甲状腺素不足、肝脏疾病、饥饿等情况下，血清葡萄糖含量降低。8）肌酸磷酸激酶：该酶在ATP存在下催化肌酸转化为磷酸肌酸，存在于心脏、骨骼肌、脑和睾丸中，但不存在于肝脏中。肌肉异常、心肌梗塞、肺循环异常时该酶增高。操作时应注意的问题1.采血时从各组中随机捉取动，样本不能溶血；2.使用足够数量的动物；3.采样前禁食12小时；4.使用合适的统计学分析方法，注意剂量－反应关系；5.将所得资料和数据与同种、同龄、同性别、同生理状况的实验动物的文件资料加以比较分析。（六）尿液分析指标非啮齿类动物尿液分析指标●尿液外观●比重●pH值●尿糖●尿蛋白●尿胆红素●尿胆原●酮体●尿液沉渣的显微镜观察1）酮体尿：酮体包括三种物质，即丙酮、乙酰乙酸和β-羟丁酸，为脂肪代谢未完成的产物。当糖氧化减少时，使脂肪的氧化呈代偿性地增加，所产生的酮体超过组织所能利用时，积聚体内，可引起代谢性酸中毒。尿中亦含大量酮体，称为酮体尿。出现于饥饿和低碳水化合物饮食的情况下，并与能量代谢异常有关。尿酮体增高•非糖尿病酮尿婴儿、儿童急性发热，伴呕吐、腹泻中毒甲状腺功能亢进、肾上腺皮质激素分泌过度伤寒、麻疹、肺炎等•糖尿病酮尿糖尿病尚未控制或未曾治疗，持续出现酮尿提示有酮症酸中毒。2）蛋白尿：全身或局部病变均可引起病理性蛋白尿，高分子量蛋白质通常不能经肾小球滤过，因此若尿中出现这种蛋白质可说明肾小球的损害。但仅肾小球毛细血管有病变而肾小管健全时，尿中蛋白含量不会过多，因肾小管对蛋白质有重吸收功能。低分子量蛋白质经肾小球滤过后又被近曲小管重吸收，如果这段肾小管功能受损，那么这种蛋白就出现在尿中。正常大鼠的尿可含有少量蛋白质，因此给药组动物须与对照组进行比较。病理性蛋白尿①肾小球性蛋白尿：见于急、慢性肾小球肾炎、肾盂肾炎、肾病综合征②肾小管性蛋白尿：通常以低分子蛋白质为主（β-微球蛋白），常见于间质性肾炎、活动性肾盂肾炎、肾小管性酸中毒等③混合性蛋白尿：肾小球、肾小管同时受损。见于慢性肾炎、慢性肾盂肾炎、肾病综合征、糖尿病肾病、狼疮性肾炎等④溢出性蛋白尿：肾脏正常，而血液中有多量异常蛋白质，见于多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等2）糖尿：葡萄糖为肾内阈性物质，一般在血液中含量超过160mg％时，可出现糖尿。糖尿可分为二种情况：一是血糖过高性葡萄糖尿，此时血糖过高，肾排糖阈正常，需被重吸收的葡萄糖量超过肾脏的“最大转运值”，葡萄糖从尿中排出；二是血糖正常性葡萄糖尿，此时血糖正常，但肾排糖阈降低，肾小球滤液中的葡萄糖不能被肾小管完全重吸收而从尿中排出，这是肾小管功能不良的指征。3）尿胆原：是胆红素在肠道内为细菌所代谢的产物，部分被重吸收。在肝毒性或肝脏病变时（如肝硬化、肝炎）和体内红细胞破坏过多（如溶血性黄疸、各种内出血等）尿胆原可大量出现于尿中。4）尿淀粉酶：尿淀粉酶增高见于急性胰腺炎、流行性腮腺炎、胃溃疡穿孔等，减少见于重症肝病、严重烧伤等。（七）病理学检查啮齿类动物组织病理学检查●脑（大脑、小脑、脑干）●脊髓（颈、胸、腰段）●垂体●胸腺●甲状腺●甲状旁腺●食管●唾液腺●胃●小肠和大肠●肝脏●胰腺●肾脏●肾上腺●脾脏●心脏●气管●肺脏●主动脉●睾丸●附睾●子宫●卵巢●乳腺●前列腺●膀胱●坐骨神经●骨髓●给药局部●淋巴结（包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结）非啮齿类动物组织病理学检查●脑（大脑、小脑、脑干）●脊髓（颈、胸、腰段）●垂体●胸腺●甲状腺●甲状旁腺●食管●唾液腺●胃●小肠和大肠●肝脏●胆囊●肾脏●肾上腺●脾脏●胰腺●气管●肺脏●主动脉●心脏●附睾●睾丸●卵巢●子宫●前列腺●乳腺●坐骨神经●膀胱●眼（眼科检查发现异常时）●视神经●给药局部●骨髓●淋巴结（包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结）