Q-PCR重复性实验的时候常常面临一个问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
:重复性。那么如何才能做好样品之间的重复,在实验过程中我们要注意那么方面,下面展开讨论。1:合格重复性 重复性标准为:3个重复样品的任何两个样品CT值之差不能大于0.5。举例如下:重复样品 1 2 3合格CT 18.49 18.56 18.32不合格CT 18.03 18.79 18.72 18.79-18.03=0.76>0.5因为重复2-重复1>0.5,所以三个重复不合格,需要重做。2:做好重复性流程 假设做1个目的基因9个样品,操作步骤如下:2.1为了得到良好重复性我们可以每个样品做4个重复,这样假如4个里面有一个不好,还有合格的3个重复数据,另外这样做还可以避免反应过程中的边缘效应。2.2 先配制混合液。实验过程体系如下: PCR反应体系 1×SYBYMIX 5µLPrimerF/R(5P) 0.5µLDNA 2µLddH2O 2µlTotal 10µL注意:在配置混合液的过程中一般每9个反应,多加一个。 模板DNA需要单独加入 9个样品,每个样品4个重复。理论需要配制36个反应液,我们实际需要配制40个反应体系反应总体系如下:PCR反应体系SYBYMIX 200µLPrimerF/R(5P) 20µLDNA 2µLddH2O 80µL 2.3配制好混合液后放进4℃备用2.4拿出5排八连管(或者PCR反应板) 操作必须在冰上进行。(可以根据情况购买反应冰盒或者自行制备)加模板(模板必须完全相同,不能为相同样品,放在不同管中)必须用同一个枪头加4个重复。(也就是说只需要用9个枪头)模板要加到反应管的底部,并且不要产生气泡。2.5加完模板后,用一个枪头加反应液。反应液要加在反应孔壁上,这个时候如果是好的反应耗材,可以明显的看到液体顺着管壁流下,不会有任何残留。(只需要一个枪头)当然此过程中如果感觉枪头使用次数过多造成了稍许的挂壁现象,可以更换,但必须保证4个重复不更换枪头。2.6加好样品后,盖上盖子或者是封板模,一定保证封好口。2.7进行离心,转速不要超过2000.2.8进行上机反应。2.9结果分析。3.实验中关键点:1:必须保证1个月对移液器进行校正。如果使用频率比较高可半月校正一次。2:实验中移液器必须专用。3:规范用移液器,禁止用力下磕移液器使枪头固定在移液器上,正确的使用
方法
快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载
是转动移液器使枪头固定。4:实验仪器进行定期检查,维护。避免有反应孔不合格。5:实验过程中必须选择Real-TimePCR专业枪头和反应板或者八连排(这个很重要)因为普通的枪头或者反应板没有经过特殊处理会发生挂壁现象,这对重复性是致命的。推荐使用Crystalgen公司耗材产品,基诺莱普生物技术有限公司2×SYBRGreenqPCRMix我们实验室一直再用此产品,性价比很高。完全可以替代Axygen产品。