脲酶活性&蛋白溶解度测定方法

出口大豆饼粕脲酶活性测定方法pH增值法、盐酸中和法1.适用范围本方法适用于大豆饼粕类脲酶活性的测定。2.方法一2.1.术语脲酶活性：在规定的操作条件下，使试样中的脲酶分解尿素释放出氨基氮，以溶液pH值的变量表示。2.2.原理概要将研细的试样与缓冲尿素溶液混合，在30℃作用30min后，测定溶液的pH值。2.3.主要试剂和仪器2.3.1.主要试剂磷酸缓冲溶液：将3.403gKH2PO4和4.355gK2HPO4溶解并稀释至1000mL。临用前，以强酸或强碱调节其pH至7.0，其使用期限不超过90d；缓冲的尿素溶液：溶15g尿素（NH2CONH2）于500mL磷酸缓冲溶液中。加入5mL甲苯，用于防腐和防止霉菌生长。按上法调节其pH至7.0。2.3.2.仪器 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 天平：感量0.1mg；研磨器：易于清理，研磨过程中不发热，并能达到要求的磨粉细度；恒温水浴：能控制于30±0.5℃；pH计：备有玻璃电极和甘汞电极，灵敏度不低于±0.02pH单位，同时附有温度补偿；试管：直径22mm，长150mm，具橡胶塞；烧杯：容量10mL；单刻度移液管：10mL；精密计时器；标准筛。2.4.试样的制备用研磨器将约10g的样品，在不升高温度的条件下尽可能研细，使其通过60目标准筛的量不少于60％。收集全部磨碎物于广口瓶中，小心混合并立即进行分析。2.5.过程简述准确称取试样0.200g，放入试管内，加10mL缓冲的尿素溶液，塞好橡胶塞，混匀。置于30±0.5℃水浴中，记下时间。隔5min放入第二个与此相同的试管作重复试验。另称试样0.200g，放另一试管内，加10mL磷酸缓冲溶液，塞好橡胶塞，混匀，作为空白试验。与上管间隔5min置于同一水浴中。在消化过程中，每隔5min将试管内容物都摇匀一次。每个试管都在消化30min后，从水浴中取出，倒出上清液于小烧杯中。并在从水浴中取出后恰好5min时，测定pH值读数。注意：pH计测定前须预热30min以上，玻璃电极须在蒸馏水中浸泡活化24h以上，方可使用；防止所有玻璃容器或电极的污染。如果pH计不能迅速给出稳定的读数，即应查清故障。甘汞电极的多孔组织如蒙上了大豆的可溶性成分，常可引起偶然故障。2.6.结果计算将主体试验的pH值减去空白试验的pH值，其差值作为脲酶活性。2.7.允许差对于蒸熟的或未经蒸熟的产品来说，同一实验室内的双试验结果允许差各自为0.03和0.10pH单位。3.方法二3.1.术语脲酶活性：指在下述操作条件下，试样的脲酶分解尿素释放氨基氮的量，以每克样品每分钟释放的氨基氮的毫克数表示。3.2.原理概要将研细的试样与缓冲尿素溶液混匀，在30℃静置30min后，加入过量盐酸溶液中和所释放的氨，然后用氢氧化钠标准溶液反滴。3.3.主要试剂和仪器3.3.1.主要试剂缓冲尿素溶液：pH6.9～pH7.0。将4.45g二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）和3.40g磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于水，稀释至1000mL制得缓冲溶液。溶30g尿素（NH2CONH2）于缓冲液。这样制备的缓冲尿素溶液保存期为一个月；盐酸标准溶液：c（HCl）＝0.1mol／L；氢氧化钠标准溶液：c（NaOH）＝0.1mol／L。3.3.2.仪器标准筛；电势滴定器或pH计：感量为0.02pH单位，备有自动滴定管和电磁搅拌器；滴定瓶或50mL烧杯；试管：直径18mm，长150mm，配有磨口内塞。其他仪器见2.3.2条。3.4.样品的制备用碾磨器将样品约10g碾至颗粒能全部通过孔径为80目的筛层。在产品特殊的情况下（如高水分和含有高挥发性物质的产品），可先在室温下进行预干燥处理后，再研磨。并在计算结果时，把由于预干燥处理而造成的质量损失考虑在内。3.5.试样的抽取于试管中称取试样约0.2g，准确至0.1mg。对于酶活性非常高的样品，试样可减至0.05g。3.6.过程简述用移液管加入10mL缓冲尿素溶液于盛有试样的试管中，迅速加塞并用力振摇，立即将试管放入30±0.5℃的恒温水浴中，保持30min，用精密计时器计时，立即用移液管加入10mL盐酸溶液，迅速冷却至20℃，并将试管中的内容物无损失地移入滴定瓶中，把试管用每份5mL的蒸馏水冲洗两次。迅速用氢氧化钠标准溶液回滴至pH4.70，最好用电势滴定器。隔5min放入第二个与此相同的试管作重复试验。另取同样试管，加入与主体试验等量的样品，再加入10mL盐酸溶液和10mL缓冲尿素溶液，作为空白试验。立刻加塞并用力振摇。随即放入同一水浴中，与主体试验同样的方法，恒温保持30min，冷却至20℃，移内容物于滴定瓶，用氢氧化钠标准溶液滴定至pH4.70。3.7.结果计算按式（1）计算脲酶活性U（mgN／min·g样品）：U＝（V0－V1）×14×T……………………………………（1）30×m式中：V0——空白试验所耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V1——主体试验所耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；T——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol／L；M——试样的质量，g。用式（2）换算其以干态基础计的脲酶活性Um：Um＝U……………………（2）1－M式中：M——按照ZBX14017测定的水分和挥发物的质量百分率。3.8.允许差同一实验室的双试验结果不得超过平均值的10％。饲料脲酶活性的测定方法(定性)1适用范围适用于豆粕、膨化大豆粉.2原理尿素在脲酶的作用下,放出氨气,氨气溶于水中使得溶液pH上升,品红显红色.3试剂3.1结晶尿素3.2酚红试剂:0.62g苯酚红溶于60mL酒精中,溶解后再加水至100mL,静置数天后使用,使用时要震荡.4测定方法取0.2g样品置于30mL试管中,加入0.02g结晶尿素,加入二滴酚红指示剂,加和20mL蒸馏水,振荡10秒钟,观察首先呈现红色于样品或溶液的时间.5结果判定1min内呈色者－活力很强1～5min内呈色者-活力强5～15min内呈色者-有点活力15min以上呈色者-没有活力10min内不呈现红色的大豆相关产品即认为合格豆粕中蛋白质溶解度测定蛋白质溶解度（PS）：鉴定豆粕过熟的方法是在0.2%的氢氧化钾溶液中测定豆粕的蛋白溶解度。因为高温使赖氨酸、胱氨酸、蛋氨酸及其他必须氨基酸发生美拉德反应（美拉德反应的产物呈现棕色，故又称棕色反应），因而降低了蛋白质溶解度。近年来，美国豆粕由于技术改进，蛋白溶解度有增高趋势。1主要试剂氢氧化钾（KOH）溶液：0.2%，pH为12.5。称取3.360g氢氧化钾，置于1000mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度。其他试剂为凯氏定氮时所用的标准试剂。2 测定步骤称取经研细（60目）后的1.5g大豆（饼粕）粉于250mL烧杯中，加入75mL,0.2%KOH溶液，在磁力搅拌器中搅拌20min。再将50mL液体转至离心管中，用每分钟2700r速度离心10分钟。吸取上清液15mL，用凯氏定氮法测定其中的蛋白质含量。此含量相当于0.3克原样本中溶解的蛋白质量。3 蛋白质溶解度计算蛋白质溶解度（PS）按下式计算：PS（%）=(V-V0)*C*0.014*6.25/0.3*100%    式中：PS——蛋白质溶解度，%；C——盐酸标准溶液浓度，mol/L；V——滴定试样时所需标准酸溶液体积（mL）V0——滴定空白时所需标准酸溶液体积（mL）；结果分析生大豆饼粕的PS可达到100%。日常分析中，当PS＞85%时，则认为大豆饼粕过生，加热处理不足；而当PS＜75%时，则认为大豆饼粕过熟，加热处理过度；而PS在75%～85%左右时，则认为大豆饼粕的质量较好。粒度大小对蛋白质溶解度有影响，因此比较不同大豆饼（粕）样品时，要注意颗粒大小的可比性。