酶膜生物反应器制备核苷酸研究（可编辑）

酶膜生物反应器制备核苷酸研究（可编辑） 酶膜生物反应器制备核苷酸研究 浙江工业大学 博士学位论文 酶膜生物反应器制备核苷酸的研究 姓名:石陆娥 申请学位级别:博士 专业:工业催化 指导教师:刘化章;应国清 20070401 浙江工业大学博士学位论文 酶膜生物反应器制备核苷酸的研究 摘要 5’(核苷酸广泛应用于医药及食品行业，在世界范围内核苷酸类 药品、制剂成为研究和投资的热点之一，需求量日益增长。国内仅个 别厂家能进行四种核苷酸生产，且产品纯度不高，产量不大，原料不 足的问题严重制约了我国核苷酸类药物和衍生物的开发。酶膜生物反 应器是在生物化工和膜分离技术的基础上发展起来的新型反应器，作 为生物反应分离耦合过程的一个具体应用，其有不可比拟的优越性， 在食品、生物化工、医药、环境等领域得到了越来越广泛的应用。为 此本课题开展了酶膜生物反应器制备核昔酸的研究。主要研究了核酸 酶P1的制备及分离纯化、游离及固定化酶膜生物反应器制各核苷酸、 核苷酸的分离纯化等。 利用正交及响应面法优化了培养基成分，并对培养条件进行了优 化，在最优条件下，可得到核酸酶P1最大酶活性354U,ml。通过热失 活、超滤、硫酸铵分级沉淀、疏水作用层析、离子交换层析以及凝胶 层析等生化分离手段提纯得到了电泳纯核酸酶P1，酶蛋白比活为1264 活作用;米氏常数K。为24(28mg,ml。 研究了游离酶膜通量衰减曲线，考察了温度、压力等对膜通量的 影响，优化了游离酶膜生物反应器的操作条件，并通过单因素及曲面 响应法确定了游离酶膜生物反应器制备核苷酸的最佳酶解工艺条件: mol,1。 量0(080 mg,ml、温度为65?、底物中醋酸缓冲液的浓度0(125 在最佳条件下制备的核苷酸收率为12(15 mg,ml，平均转化率为 97(2 ,。 考察了纸纤维为载体的共价偶联法、壳聚糖微球币I]DEAE纤维素 为载体的交联法等几种固定黛方法，获得较优的固定化条件。研究了 固定化核酸酶P1的酶学性质，与游离酶相比:最适pH提高0(5个单位， 耐酸碱性也得到了提高;以壳聚糖微球和纸纤维为载体的固定化酶最 适温度提高了10?，热稳定性、存储稳定性都得到了提高;纸纤维 固定化酶、壳聚糖微球固定化酶、DEAE纤维素固定化酶的米氏常数 ?分别为5(72、96(58、27(21mg,ml。 采用化学交联法和物理吸附法研究了以膜为载体的酶固定化方 法，结果表明化学交联法优于物理吸附法。同时考察了上述几种固定 化酶在膜生物反应器里的使用稳定性，相比较而言壳聚糖微球固定化 酶比较适合，使用十次后残留相对酶活为96,，核苷酸转化率为84 ,。通过单因素及曲面响应法确定了壳聚糖微球固定化酶在膜生物反 应器中制备核苷酸的最佳酶解工艺条件:底物浓度1(57,、锌离子浓 mg,ml、温度为72?、 度6(OxlO,mol,1、底物pH为5(4、加酶量0(080 mol,1。在最佳酶解工艺条件下可得到 底物中醋酸缓冲液的浓度0(125 最大核苷酸收率为14(52 mg,ml，转化率为92(5,。 对酶解产物5’(核苷酸进行了分离纯化，先用阳离子交换树脂 400分离 5’一啪和5’(CMP，考察了一k样量、缓冲液流速、洗脱浓度、离子强 度、pH值等因素对5’(核苷酸分离纯化工艺条件的影响，四种核苷酸 都得到了很好的分离，回收率在80,以上。 关键词:酶膜生物反应器，核苷酸，核酸酶Pl，分离纯化 II】 浙江工业大学博士学位论文 ENZY?【ATICPRODUCTION0F5’0哪CLEOTIDESUSING ENZY^4EM匝M旧RANEB10REACToR ABSTRACT 5'-nucleotideshavebeen usedin andfood widely pharmaceutical ofnucleotideshasbeenoneofhot moreandmore are nucleotides study spots(And neededinallkindsofindustries(Nowfour carlbe mononucleotides only produced by fewfactoriesatthesan'letime(Andthe of5'-nucleotidsistoo wellas purity low，as the is hasledtothe ofrawmaterial small，which andhas production shortage restrainedthe of 5'-nucleotides membranebioreactor industry(Enzyme development has wit 1the been ofbiochemical andmembrane developedprosperity engineering a useofthe bio― reaction separationtechniques(Aspractical theoryintegrated hasits virtues(EMBRhasbeen used separationprocess，EMBRoverwhelming widely infood andenvironmental industry、biochemical engineering、pharmaceuticsprocess( Thus ofthe of5'-nucleotides ofRNA study production byenzymatichydrolysisusing membranebioreactorhasbeen and of enzyme invested(Preparationpurification nuclease of5'-nucleotidesfreeandimmobilized P1，preparation by enzyme membranebioreactorand of5’-nucleotideswerestudiedinthis separation paper( Medium fornucteaseP1 fromPenicilliumcitrinumwas optimization production studiedone-factor―at―a―time methodand surface by mcthod，orthogonalresponse was354U,mIunderthe methodology(imumenzyme activity optimum to wa(s to SDS― PAGEthermal conditions(Enzymepurified homogeneityaccording by deactivation， ultrafiltration, NH4 2S04precipitation， phenylsepharose V 浙江工业大学博士学位论文 and filtration(This gel protocolgave chromatography，ion―exchangechromatography of1264 93(4一fold with U,mg(Theoptimum purificationspecificactivity below70。 Cand and5(4(Itshowed and ofnucleasel was69? stability pH p good 4(0(7(0(Its wasactivated inhibited Zn2+，K+and Cu2+，C02+， activity by strongly by pH forthe was24(28 withRNAassubstrate( A13+，SDS(Km mg,ml enzyme curveofmembrane fluxwasstudied(Variousfactors Thedeclination permeating as were thatinfluencedmembrane fluxsuch permeating were conditionsof membranebioreactor investigated(Operationalenzyme optimized( was of5'-nucleotidesfree membranebioreactorstudied by enzyme by Preparation methodand surface one―factor-at-a-time response methodology(Theoptimum wereasfollowed: substrateconcentration1(25,(zinc conditions enzymatic concentration0(080 concentration6(0x104 mol,1，substrate5(3，enzyme mg,ml， pH 25 65?(aceticacidbuffersolutionconcentration0。1 mol Under ,1( temperature concentrationwas12(15 andthe conditions，5'-nucleotides mg,ml optimized 。 conversionratewas97(2,( and cellulosewereselectedasthe Chitosan cellulose microsphere，DEAEpaper methodswere bettercarriers(Theimmobilizationconditionsofthese ofimmobilizednucleaseP1 werestudied(The Andthecharacteristics optimumpH wasincreased valueWas afterimmobilization(The temperature by changed optimum l0?(Thermaland werealso increased。? ofcellulose， storagestability paper celluloseimmobilizedwere chitosan enzyme microsphere，DEAE wasalsoimmobilizedonmembrane by mg,ml，respectively(Andenzyme onmembrane was andchemical immobilized bycross-linking cross-linking(Enzyme moresuitable( Theuse oftheaboveimmobilizedwasstudied(The stability enzyme enzyme wasmoresuitablefortheuseof immobilizedonchitosan microsphere was84, afterten ,andtheconverSionrate was96 bioreactor(Its relativelyactivity of5'-nucleotides immobilizedonchitosan times byenzyme usage(Preparation was in membranebioreactorstudied by enzyme microsphere were methodand surface conditions responsemethodology(Theoptimumenzymatic V 浙江工业大学博士学位论文 concentration asfollowed:substrateconcentration 6(0×10。4 1(57,，zinc tool,1， acid substrate concentrationO(080 5(4，enzyme 72?，acetic pH mg,ml，temperature buffersolutionconcentrationO(125mol,1(Under optimized concentration14(52 andtheconversionratewas92(5,( was mg,ml The of 5'-nucleotideswas separation products enzymatic resinIRAl20(5'-UMPand and5'-GMPWaS fromcationion separated exchange 5'-CMPwas fromanionion resinIRA400(Process separated exchange solution loaded andtheeluate amount，thevelocity including pH，nucleotides concen廿ationwere fournucleotideswere and separatedthoroughly optimized(The the wasover80,( averageyield and KEY membrane WORDS:enzyme P1 purification，nuclease 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，，也不含为获得浙 江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明 的法律责任。 作者签名:五商谢 日期:2叼年。乡月31日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 一 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l、保密口，在――年解密后适用本授权书。 2、不保密阢 请在以上相应方框内打“4” 作者签名:冠商朔‘ 日期:2卿年口s月弓f日 日期:哆年j-,q;7日 别程轹事晰 浙江工业大学博士学位论文 第一章文献综述 1(1酶膜生物反应器研究现状与进展 1(1(1酶膜生物反应器的发展 酶作为高效专一的催化剂，在生物转化过程中起到重要作用，而膜分离过程 在混合物分级浓缩纯化方面具有显著的技术优势。如果将酶促反应与膜分离这两 种过程有效集成，将具有很高的生产效率。基于上述设想，20世纪60年代末Blatt Membrane Bioreactor 的概念。酶膜生物 等人【l】提出了酶膜生物反应器 Enzyme 反应器就是采用适当孔径的膜将酶和底物与产物隔开，并使产物不断透过膜排出 的一种反应设备，即酶膜生物反应器是一种利用膜的分离功能，能同时完成反应 和分离过程的生化反应器。 酶膜生物反应器能将酶的催化特性与膜材料的优良分离性能相结合，使反应 和产品分离同时进行，有效地加速反应，突破化学平衡的限制，提高转化率。而 且，与一般化学催化剂相比，酶的催化反应效率高、条件温和、副产物少、立体 选择性强，己在生物、医药、化工、环境、食品工业等领域得到了越来越广泛的 应用。目前随着酶固定化技术和水平的提高，以及膜科学技术和工业的不断发展， 各种膜固定化酶反应器不断涌现，其克服了游离酶膜反应器的缺点，成为目前酶 工程领域的研究热点。然而国内对酶膜反应器的研究刚刚起步，为此对它的研究 将有助于推动我国酶工程学的发展。 - 1(1(2酶膜生物反应器的特点 集催化反应、产物分级分离与浓缩以及催化剂回收于一体的酶膜生物反应器 具有以下特点【2J。 1 与化学催化剂相比，酶的选择性和催化效率要高褥多。这些酶呈现出较高的 反应速率、更加温和的反应条件和更好的专一性。 2 膜可以使酶在类似生物膜的环境中高效地发挥作用。 3 对于产物抑制的反应系统，通过反应分离耦合，可降低反应液中产物浓度， 若反应可逆，可促进产物向平衡方向转化，提高原料的从而消除产物抑制。 转化 率和反应器的生产能力。 浙江工业大学博士学位论文 4 可实现对流传质代替自由扩散，强化了传质速率，提高了反应速率。 5 有效地富集产物，降低产品在下游加工中分离纯化的费用。 6 易于连续化和自动控制。 7 设备费和操作费均低，提高生产效率和经济效益。 但酶膜生物反应器也有缺点，酶膜生物反应器的催化和传质效率会随时间增 长而下降。这是因为除热失活外，酶的动力学稳定性还会受酶的大小、膜材选择、 膜孔径、酶的激活剂、搅拌等因素影响。酶膜生物反应器的另一个主要缺点也是 制约膜生物反应器大规模应用的瓶颈一膜污染，膜污染不仅导致反应器的传导或 扩散传质下降，而且缩短膜的使用寿命，增加了生产成本。 1(1(3酶膜生物反应器中膜的选择 对于酶膜生物反应器，在选择超滤膜时，不仅要考虑酶、底物、产物的分子 量大小，而且它们在溶液中的化学特性以及膜本身的特性也不容忽视。在筛选膜 溶质的截留率是一个十分重要的指标。理论上，对反应产物来说，的过程中， 截 留率应为0，而对酶的截留率应为100,，以确保酶完全留在反应体系中，对底物 来说同样如此。总之，选择超滤膜时必须考虑的因素有: 1 膜材料的形态、孔 度、孔径分布、截留分子量大小; 2 化学稳定性、适宜的pH值范围; 3 热稳定 性、耐压性; 4 膜材对酶活力的影响; 5 膜的价格; 6 具有适宜的膜通量。 (1(4酶膜生物反应器的分类 1 根据酶的存在状态、相数、膜组件型式、膜材料类型、耦合方式、传质推动 力等的不同，酶膜生物反应器主要有以下几种分类方式[„。 1 根据酶的存在状态，可以把酶膜生物反应器分为游离态和固定化酶膜生物反 应器。游离态酶膜生物反应器中，酶均匀地分布于反应物相中，酶促反应在等于 或接近于本征动力学的状态下进行，但酶容易发生剪切失活或泡沫变性，浓差极 化和膜污染显著影响着这类反应器的性能。固定化酶膜生物反应器中，酶通过吸 附、交联、包埋、化学键合等方式被束缚在膜上，酶的装填密度较高，反应器的 稳定性和生产能力大，产品纯度和质量高，废物生成量少。但酶的分布不均匀， 往较大。 传质阻力往 2 根据相数的不同，可以把酶膜生物反应器分为单液相 超滤式 和双液相酶膜生 物反应器。单液相酶膜生物反应器多用于底物相对分子质量比产物大得多，产物 和底物能够溶于一种溶3?tJ 具有类似的溶解行为 的场合。当酶促反应涉及两种或 浙江工业大学博士学位论文 两种以上底物，而底物之间或底物与产物之闻的溶解行为相差很大时，双液相酶 膜生物反应器较为适宜。 3 根据膜组件的型式不同，可以把酶膜生物反应器分为平板式、螺旋卷式、管 式和中空纤维式酶膜反应器。以上4种型式的组件在结构复杂性、装填密度、膜 的更换、抗污染能力、清洗难易、料液要求、成本等方面存在一定的差别，需要 根据具体情况选用。相比之下，中空纤维式与板框式酶膜生物反应器应用较多。 4 根据膜材料的不同，可以把酶膜生物反应器分为有机酶膜生物反应器和无机 酶膜生物反应器。有机膜材料种类多，制作方便，但物理化学稳定性差;无机膜 材料造价较高，脆性大，弹性小，但物理化学稳定性好，抗污染能力强。 5 根据反应与分离耦合方式的不同，可以把酶膜生物反应器分为一体式和循环 式酶膜反应器。在前一种应用方式中，系统通常包含一个搅拌槽式反应器加上一 个膜分离单元。在第二种应用方式中，膜既作为生物催化剂的载体，同时又构成 分离单元。 6 根据传质推动力的不同，可分为化学位差驱动和电位差驱动的酶膜生物反应 器。前者又可进一步分为压差驱动和浓差驱动两种形式。 另外，还可以根据膜的亲水疏水性以及膜的结构形态 对称膜、非对称膜、 复合膜 对酶膜生物反应器进行分类。 1(1(s酶膜生物反应器中酶的固定化方法 随着膜固定化技术的发展，特别是当半透膜除了用于分离外，还可被用作界 面催化剂的载体制备膜固定酶时，酶膜生物反应器的功能得到了拓展。因为 在反 应体系中多了一个固定相，可以进行更复杂的酶反应，例如可以实现多相酶反应 体系。将酶固定在膜上的方法有物理吸附法、化学交联法、共价结合法、定点固 定化等。 1(1(5(1物理吸附法 凝胶层固定化 膜 或经适当处理过的膜 对蛋白有较强的吸附作用，借助膜的这种特性将酶 溶液在膜反应器中循环一定时间后便可实现酶的固定化。酶溶液经膜过滤后，因 浓差极化而在膜表面形成一薄层酶蛋白凝胶层，这也属于吸附法固定酶的一种方 法 动态固定化 。酶被无催化活性的蛋白质包围在膜表面形成凝胶层，这种方法 称为共凝胶化固定法 静态固定化 。这种固定化方法由于酶处于微细环境 中，十 浙江工业大学博士学位论文 分稳定，酶的失活较小，并且胶层内酶浓度较高，因而反应物的转化率也较高。 但缺点是膜易被堵住。此法关键是选择有适当截留分子量的超滤膜和膜组件构 ,cm2，重复地进行吸附和脱附，酶的吸附量损失较加，最高可达135耻g 少。这种 反应器的应用见表1(1。 Table1-1 immobilized Enyme by adsorption【6】 physical 酶 反应物及用途 酸性磷酸酶 磷酸4(硝基苯脂水解 B一葡糖苷酶 纤维索二糖水解为葡萄糖 B。葡糖苷酶 4一硝基苯基葡糖苷 B(半乳糖脱氢酶 D(半乳糖的氧化 蔗糖酶 蔗糖 苹果酶 L(苹果酸转化为丙酮酸 脂肪酶 脂肪水嘏 脲酶 尿素分解 变构酶 dCMP的氨基水解 青霉素酰化酶 青霉素除去侧链成6-APA 1(1(5(2化学交联法 膜材料上不存在反应基团时，通过双功能或多功能试剂的架桥作用，使酶与 常用的试剂有戊二醛、双重氮苯胺和功能试剂形成共价键而实现酶固定化。 乙烯 一马来酸酐共聚物等。主要步骤为: 1 用硅烷化试剂活化膜; 2 用双功能试剂 与活化后的膜反应; 3 在低温下把酶固定在膜上。用这种方法可使酶牢固地固 定在载体上，不易漏失，但由于固定化过程中涉及酶分子的化学反应，因而酶失 (2。 活较为严重。其应用见表I Table1-2 immobilized Enzyme by CFOSS(1inking【7】 膜材料 酶 丝素 糖化酶 丝素 B一葡萄糖糖苷酶 丝蛋白 葡萄糖氧化酶 醋酸纤维素 胆固醇氧化酶 鸡蛋白 葡萄糖氧化酶 聚碳酸脂 葡萄糖氧化酶 PVC(硅石 ?淀粉酶 甲基丙烯酸甲酯,二甲基丙烯酸乙酯 胰脂肪酶 浙江工业大学博士学位论文 1(1(53共价偶联法 膜表面含有活性基团时，酶与基团以共价键方式结合，从而实现酶的固定化。 这种方法固定的酶，结合牢固，半衰期长，但对于常用的中空纤维膜 聚砜膜， 胺膜等 不太适用，还需对膜进行修饰。共价偶联法的缺点是对酶聚丙烯酰 的活 性影响较大。具体包括以下三种方法: 1 叠氮法:叠氮法适用于表面带羧基或 羧甲基的膜材料。如羧甲基纤维素经酯化后，用水合肼处理得到酰基肼，再用亚 硝酸处理制成叠氮衍生物，可与酶分子上的氨基、羟基等基团反应制成固定化酶 膜。 2 戊二醛法:戊二醛与膜材料上的氨基反应，生成具有醛功能的模板，再 与酶蛋白上的氨基作用实现酶的固定化。 3 共价固定法:除了以上提到的两种 方法以外，还有其它一些共价固定法也常被使用。如利用载体上的缩醛结构与酶 分子上的氨基缩合;利用载体活化后形成的异氰酸或异硫氰酸衍生物与酶分子共 价结合:利用溴化氰法、烷化法、碳二亚胺活化法固定化酶等。共价结合法固定 的酶稳定性高，但由于固定化过程反应激烈，酶失活较严重，且载体不易再 生。 其应用见表1(3。 Table1-3 immobilizedcovalent Enzyme by couplel7。9】 1(1(5(4包埋法 把酶或整个细胞包埋在膜的微孔结构内。即将酶混入铸膜液中，经相变形成 凝胶膜或呈多孔海绵结构的不对称膜，使酶包埋其中。也可将酶充填在中空纤维 膜的多孔区，然后再用复合膜使之封闭。该法中所使用的酶需要能够经受得住铸 膜工艺中温度及有机溶荆的影响，因而对于嗜热酶较为有利”ol。此外，也可通 浙江工业大学博士学位论文 过过滤，将酶包埋于不对称亲水膜和对称疏水膜的多孔层内。包埋法制备过 程简 单，条件温和，一般不涉及酶分子的化学变化，因而酶活力回收率高。但是，酶 容易漏失，催化反应受传质阻力的限制，不易催化大分子底物的反应。由于包埋 因而常和交联法以及上述的吸附法有时存在酶易从载体漏失或脱附的问题，法结 合在一起使用，以增强酶的稳定性。包埋一交联法和吸附(交联法都是常用的联用 固定化法。表1(4为包埋法固定化生物催化剂膜。 S] Table 1(4 immobilized Enzyme byentrapmentIH-I 膜材料 生物催化剂 醋酸纤维 氨基酰化酶 脲酶 醋酸纤维 丝素 糖化酶 聚乙烯醇 B(半乳糖苷酶 聚砜 转化酶 聚砜 硫化叶菌 caldariella 醋酸纤维素 acidophila 聚丙烯酰胺 天门冬氨酸酶 不对称毛细血管膜 延胡索酸酶 聚丙烯酰胺 天 门 冬氨酸酶与大 肠杆菌 聚亚安酯 精氨酸酶和天 门 冬酰胺酶 聚丙烯酰胺 青霉素酰化酶 1(1(5(5将酶固定于中空纤维膜组件的壳层内【l”2” 酶液或与交联剂一同在无菌条件下采用反冲的方法进入中空纤维膜组件的 壳层或膜的多孔壁中。反应物以扩散或以对流的形式进入膜中，在酶的催化作用 下进行反应，然后生成物再以扩散或对流形式离开膜。 1_1(5(6定点固定化技术 site(specificimmobilization t22j 传统的固定化方法一随机固定化 random 这主要是因为酶蛋白常常通过赖氨酸残基上的8(氨基与载体活性基团偶合，酶表 面分布有多个赖氨酸残基，与载体作用时可以采取多种空间取向，酶蛋白多 点附 着在载体上，结构变异，增加了底物接近酶活性中心时的空间位阻，使酶活下降; 同时，酶固定量受到限制。定点固定化技术借助分子生物学方法，能有效克服这 即通过酶蛋白上的特定位点与膜载体作用，在膜表面形成一种高度一弊端。 有序 的酶分子的二维阵列。酶蛋白上的作用位点远离催化活性中心，使底物能充分接 近活性中心。与随机固定化方法相比，酶的活力和固定量都有显著提高。定点固 定化方法主要有3种: 1 抗体偶联法; 2 生物素(亲和素亲和法。即将生物素融 6 浙江工业大学博士学位论文 合在酶的?-末端或c-末端，利用生物素(亲和素的亲和性，在固定有亲和 素的膜 材料上实现定点固定。Vishwanath等利用此法将伊半乳糖苷酶定点固定在聚醚砜 膜上，酶活力比随机固定化提高近20倍; 3 氨基酸置换法。即借助基因突变技 将半胱氨酸引入酶分子，利用半胱氨酸残基上的巯基在膜材料表面实现术， 定点 固定化。 1(1(5(7酶先固定在其他载体上，再放入酶膜反应器里进行反应?一24l 这种固定化方式在酶膜反应器里使用最为普遍，常见固定化酶的制备方法可 分为如下几类: 1 吸附法:主要包括物理吸附法、离子吸附法。酶直接吸附在载体上的方法称 为物理吸附法。常用的载体有:a有机载体，如面筋、淀粉等;b无机载体，如 氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛等。用此法 制成的固定化酶，活力损失少，但酶与载体的结合不牢固，易于脱落，很少有实 用价值。离子吸附法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合，酶吸附于 此法在工业上应用较广泛，常用的载体有:离子交换树腊载体上较为牢固。 及离 子交换纤维素。 2 包埋法:主要包括聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法和微 囊法等方法。包埋法是将酶包埋于凝胶或其他聚合体格子内，这种结构可以防止 酶渗出，但是底物能渗入格子内与酶相接触。此法的优点是适用范围广，许多种 酶都可用此法固定，工艺简便，酶分子仅仅是被包埋起来，固定化过程中酶 未参 与化学反应，故可得到活力较高的固定化酶。但是，用此法制成的固定化酶，不 能对大分子底物的生化反应起催化作用。 3 共价键结合法:主要包括重氮化法、烷基化和芳基化法、戊二醛处理法、钛 螯合法、硫醇(二硫化物互换反应法和四组分缩合反应法等方法。 a重氮化法:此法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮化物通过共价键相连接而固 定化。含有氨基的载体先与亚硝酸反应生成重氮化合物，再与酶蛋白反应，使酶 固定化。常用的载体有多糖类的芳香族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰 胺等。 b烷基化和芳基化法【25】:以卤素为功能团的载体与酶蛋白的氨基与巯基发生烷基 化或芳基化反应而成固定化酶。此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基 7 浙江工业大学博士学位论文 的衍生物。卤乙酰衍生物包括氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维素、碘乙酰纤维素等。 C戊二醛处理法:戊二醛与含有伯氨基的聚合物反应，可以生成具有醛功能的板 模。所用载体除氨基乙基纤维素外，也可用DEAE(纤维素、琼脂糖的氨基衍生 物、部分脱乙酰壳质、氨基乙基聚丙烯酰胺、多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。此 外，还可将酶用物理吸附法吸附于多孔物质上，或用离子吸附法使酶与用聚乙烯 亚胺处理的二氧化硅相结合后，再用戊二醛处理，来固定酶。 4 肽键结合法:主要包括酰基迭氮衍生物法、溴化氰活化的多糖法、碳酸纤维 素衍生物法、马来酐衍生物法、异氰衍生物法和硫酰胺结合法等。 5 交联法:交联法是利用有双功能团或多功能试剂与酶分子之间进行分子交联。 固定交联剂有多种，最常用的是戊二醛、异氰酸衍生物、双氮联苯、N，N 双碘 丙酮酰胺和N，N『-乙烯双马来酰胺，此法的缺点是可能使酶活性降低，很少单 独使用，一般与其它方法联合使用伫61。 各种方法各有其优缺点，因此固定化方法的选择应从方法的物理化学过程、 载体的选择范围、操作的经济性等方面考虑，结合实际情况，因地制宣地来确定。 1(1(6固定化酶的性质 酶固定化后引起的酶学性质的改变，一般认为其原因可能有两种:,是 酶本 身变化;二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。所谓酶本身的变化，主要 是由于活性中心的氨基酸残基、蛋白的高级结构和电荷状态等发生了变化;载体 的影响则主要体现在固定化酶的周围，能对底物产生影响的扩散层的形成，以及 静电的相互作用。 1 温度:酶被固定化后，其最适温度比游离酶高一些，一般因酶两异，大致 提高5-15?。 ( 2 稳定性:酶固定化后，稳定性有所增加，稳定性的提高包括对各种试剂的 稳定性、对蛋白酶的稳定性、贮存稳定性及操作稳定性等。 3 pH值:酶和细胞经固定化后，其最适pH及pH活性曲线有时发生变化。 1(1(7固定化酶膜的性质 酶分子经固定化以后，其结构和微环境发生了变化，因而某些性质与游离态 的酶相比也有不同程度的改变。 1(1(7(1膜材料的影晌 浙江工业大学博士学位论文 作为载体的膜材料能够影响酶催化反应的动力学。膜材料与酶分子问的相互 作用改变了酶的结构和所处的微环境，增加了底物向酶活性中心及产物向反应区 域以外扩散的阻力，使催化效率降低。Ariea等[271将脲酶固定在改性的聚甲基丙 烯酸(2(羟乙酯膜上催化脲的降解。反应动力学的研究显示，固定化酶和游离酶 mmol和18mmol，酶经固定化后，对底物的亲和力减 的米氏常数K。分别为34 小。膜材料的亲水性、孔径、表面积等因素都会影响酶的活性。Godjevargova等 渊分别将盐酸胼、N，H二乙基甲基丙烯酸(2(氨基乙酯、乙二胺、羟氨4种试剂 用于对丙烯腈共聚物膜改性，继而固定葡萄糖氧化酶。实验显示4种改性的膜材 料亲水性依次增强，且随着亲水性的提高，固定化酶的活性也相应地增加。Hicke 等鲫利用不同孔径的改性PET微孔膜固定果糖转移酶，催化制备多聚糖。实验 表明较大孔径的膜材料有利于产物分子的扩散提高催化效率。 1(1(7(2固定化方法的影响 前面已经提到了各类固定化方法对酶活性的影响。在共价固定法中，对膜材 料表面接枝活化时，常引入己二胺作为问隔臂，间隔臂能够延长酶分子与膜材料 间的距离，减少膜表面对酶分子构象及微环境的影响，减少底物接近酶分子时的 空间位阻，从而提高催化活性Bo-3n。此外，酶固定化过程中，酶分子有时会多点 附着在膜载体上，从而影响其活性。Masry等f32】分别用重氮法和戊二醛 - 法将B 半乳糖苷酶共价固定在改性的尼龙膜上，后者的活性明显低于前者，这可能是由 于戊二醛法固定的酶多点附着在膜载体上导致酶活性部位结构扭曲所致。除此以 外，酶的特性、酶固定量、催化反应条件及酶膜反应器构型等都能影响催化效率。 I,I(7(3稳定性 酶经固定化后，稳定性提高。例如固定化胰蛋白酶，其稳定性比游离酶高 1000倍，固定化的脂肪酶与可溶性酶相比，稳定性提高140倍。 ?? 1(1(7(4最适口H值 与游离酶相比，固定化酶催化反应的最适pH值常常会发生偏离。这主要是 effect 所致。载体带正电荷时，通过静电作用将 溶液本 由于分配效应 partitioning 体中的阴离子 如OH( 吸引到其表面，导致酶分子微环境中OH‘浓度的增加，而 本体溶液中的OH’浓度减少。实验中所测得的本体溶液pH僮偏低，使得最适pH 值向偏酸的一侧移动。反之，载体带负电荷时，向偏碱的一侧移动l驯。 9 浙江工业大学博士学位论文 1(1(8酶膜生物反应器的应用 采用酶膜生物反应器，可以实现反应的连续操作，提高产物得率。酶膜反应 器常用在大分子的水解，辅基再生系统的共轭反应，脂酶催化的水解与合成，逆 向胶团催化，污水处理，制药等方面。 1(I(8(1大分子的水解 主要是指蛋白、糖类 淀粉和纤维素 、肽类、麦芽糊精等大分子的水解。利 用膜的筛分作用，可以将相对分子质量较大的生物大分子与相对分子质量较小的 水解产物实现原位分离，以部分甚至全部消除产物抑制，这就要求采用超过滤型 反应器，使酶和底物直接接触。由于膜污染和产品附加值低，酶膜反应器在这方 面没有得到充分有效的利用。 这方面的应用实例多集中在农业(食品领域，包括: 1 通过果胶水解 来降低 果汁粘度【341; 2 通过将乳糖转化为可以消化的糖类来降低牛奶和乳清 中乳糖的 含量[35】; 3 通过多酚化合物和花色素的转化进行白酒的处理; 4 从牛奶 产品中 去除过氧化物等。酶膜反应器在大分子水解中的应用如表1-6所示。 Table1-6 membranereactor to macromolecules Enzyme appliedhydrolyze 酶反应体系 膜类型 链霉蛋白酶水解大豆蛋白 中空纤维膜 n(淀粉酶,葡萄糖淀粉酶水解谷物糖制麦芽糖 片状平 膜 纤维素酶水解、碱处理的黄柳 sallow 超淀膜 Alcalase水解牛血清蛋白 中空纤维膜 葡萄糖淀粉酶水解木薯淀粉 超滤膜 果胶酶水解果胶 尼龙膜 纤维素酶水解纤维素 超滤 膜 葡萄糖淀粉酶水解液化谷类淀粉 中空纤维膜 胰蛋白酶水解多肽和蛋白质制生物活性肽 卷式膜 蛋白酶水解鱼蛋白 中空纤维膜 D一淀粉酶和异淀粉酶同步水解淀粉 超滤膜 (1(8(2辅基再生系统的共轭反应 1 成共价键生成、能量传递、基团转移和氧化还原反应。但是，这些辅因子通常价 格昂贵，所以在实际生产中应用酶膜反应器来实现辅基的再生可较好地解决这一 问题。 根据反应器的构造和膜的多孔性，辅基可通过共价键结合到聚合物如PEG 上，使其截留在膜的一侧，通过分子筛或静电斥力固定或处于游离状态，NADP O 浙江工业大学博士学位论文 固定在PEG上，每一辅基分子循环利用可达500000次。 这种辅基再生反应器可用来合成NADPH、氨基酸、含氧酸、醇、酸、6(磷 酸葡萄糖、乙醛、乳酸酯和内酯等产品。以丙酮酸为底物，在L-丙氨酸脱 氢酶 的作用下制备。丙氨酸己大规模生产。酶膜反应器在辅酶再生体系应用如表 (7 1 所示。 to reactions Table1(7 membranereaGtor Enzyme cofactor-regenerating applied 酶反应体系 膜类型 亮氨酸酶法合成 中空纤维膜 LD乳酸变换生产L，乳酸 中空纤维膜 脱氢酶合成L和D一2羟基异己酸 中空纤维膜 酸酶和苹果酸酯脱氢酶合成L-乳酸 乳 超滤膜 脱氢酶生产氨基酸、羧酸、醇、酐和乳糖 平膜 甘露酵脱氢酶生产甘露酸 超滤膜 酒精脱氢酶合成DADPH 超滤膜 青霉素酰化酶和乳酸脱氢酶的研究 管膜 葡萄糖激酶合成葡萄糖磷酸酯 中空纤维膜 中空纤维膜 辅酶再生体系生产丙醇、乳糖和6(葡萄糖磷酸酯 丙氨酸脱氢酶合成L-丙氨酸 中空纤维膜 1(1(8(3脂酶催化的水解[36-37];I【]合成反应 脂酶的特殊结构和作用机制，即其在相界面激活起作用，使得其在酶膜反应 器尤其是在多褶酶膜反应器中脂酶的活性显著提高，因为这有利于酶和底物的界 面接触。这类反应器，膜的一侧是油相 有机相 ，另,侧缓冲液不停流动。疏水 的膜材被油相浸湿，亲水性的膜材被水相浸湿，反应在界面上发生。性 Tanigaki 改进这个方法，用两块分别是亲水的和疏水的膜隔离出一酶反应室。水通过亲水 膜进入反应室;大豆油通过疏水膜渗透入反应室，生成的甘油和脂肪酸重新通过 膜扩散回水相、油相再循环。 脂肪酶及酯酶、青霉素酰化酶和腺苷胶氨基酶可进行光学药物的合成。在制 备手性药物时，这些酶区别作用于外消旋对映体的特性使它们优于传统的化学合 成网。随着制药的发展，酶膜反应器必将在手性药物的大规模生产上发挥更大 作用。现已有采用中空纤维膜对脂肪酶催化的环氧丙基丁酸酯对映体迸行分离的 ―8所示。 报道。手性拆分与利用脂酶的两相反应如表1 to membranereactor and TableI-8 bylipase Enzyme appliedbydrolyzesynthesize 反应 膜 类型 中空纤 维膜 富马酸酶手性合成L苹果酸 毛细血 管膜 脂肪酶水解甘油三酯生产甘油和脂肪酸 浙江工业大学博士学位论文 脂肪酶水解橄榄油生产甘油和脂肪酸 片状平膜 磷酸酯酶D合成甘油磷脂 片状膜 脂肪酶合成甘油酯 片状膜 猪肝酯酶水解乙醇丁酯 中空纤维 脂肪酶水解甘油三醋酸酯 中空纤维 *胰凝乳蛋白酶拆分消旋N-苯甲酰酪氨酸乙酯 中空纤维 脂肪酶酯化山梨醇 中空纤维 脂肪酶合成单、双、三甘油酯 中空纤维 脂肪酶在含有两种膜的反应器中水解豆油 片状膜 1(1(8(4逆向胶团催化 通过逆向胶团体系将酶微胶囊化，采用酶膜反应器进行的酶反应，其主要限 制因素是反应体系中的表面活性剂带来的污染。这使产物的分离纯化及酶的回收 变得困难。利用酶膜反应器截留含酶逆向胶团及分离产物，已被公认为逆向胶团 91。 酶反应最有前途的工业化方法【3 超滤酶膜反应器的合成半透膜具有高效地截留反相胶团 含酶或不含酶 和 分离产物，同时保留逆向胶团体系的独特反应优点。但是，膜不能完全截留 表面 聚合，在酶膜反应器采用这样的酶体系，可避免表面活性剂对产物的污染，实现 产物分离。 1(1(8(5污水处理 Bodzek等研究了酶法去除可乐工业污水中的苯酚和氰化物。他们把酶固定 在超滤膜上，虽然处理时间比较长，但效果比较好。Edwards等‘40】研究了酚类混 合物 苯酚、甲氧基苯酚、甲酚等 的降解，通过把多酚氧化酶固定到聚砜毛细 管膜上，虽然固定化后，酶活有所降低，但酶膜生物反应器表现出了良好的氧化 能力，而且很容易把产物从污水中分离出来。Edwards等还将多酚氧化酶固定在 涂附有脱乙酰壳多糖胶层的聚砜膜上，在酶膜反应器内氧化水中的酚类化合 物。 脱乙酰壳多糖胶层不仅能够有效增加载酶量，减少反应产物对酶的抑制作用，从 而提高反应效率，而且还有利于水的脱色。Jolivalt等H1峙艮道了固定化漆酶在酶 研究发现固定化酶活力更加稳膜生物反应器中分解污水中苯基尿素杀虫剂， 定， 处理能力更强。还有用固定化酶膜生物反应器去除污水中的苯磷二酚和苯酚的报 道142由]。 1(1(8(6制药 浙江工业大学博士学位论文 不同反应系统的酶膜反应器已经应用在氨基酸类化合物，抗生素，抗炎症药 物，抗癌药物，维生素等的生产中嗍，具体应用见表1(9。 Table1-9 membranereactor tO Enzyme appliedphm'maceutics 1(1(9存在问题及发展方向 存在问题: 1 催化剂不均匀流动分布限制了酶膜反应器的应用，尤其在中 空纤维管道中，催化剂的分布很不均匀，例如在啤酒酵母的研究中，某些中空纤 维管道里几乎没有细胞。 2 酶或细胞间作用及其与膜的相容性及反应器中膜与 酶或细胞间的相互作用既与疏水性和表面电荷有关，也有可能是表面化学所引起 的。总结包埋酶的各种膜的影响，尚未发现指导膜材料选择的一般规律。如聚砜 膜可以使某些酶失活，如B(半乳糖苷酶、舡半乳糖苷酶和葡萄糖异构酶，而丙烯 酸膜不会使这些酶失活。但聚砜膜对蛋白酶和霉菌的乳糖酶却毫无影响。但对酵 母的乳糖酶有影响。这些问题都尚待解决。 3 长期生产中，膜的物理损伤很严 重，压力较大时容易使膜破裂或崩解， 4 进料中带入的悬浮物质，以胶体状存 在的物质以及微生物等都会在膜上形成覆盖层，导致膜污染，使膜反应器的应用 受到限制，这是酶膜生物反应器应用中的主要问题。因此应尽量减少或避免膜的 污染。常用方法有: 1 进料溶液的预处理:预处理技术主要有热处理、pH