为什么pcr扩增得到的目的基因不能直接用于连接反应
2009-04-18 22:30wanglan099 等2人 | 分类:生物学 | 浏览1101次
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2009-04-18 22:36网友采纳
johnny王子 | 六级
因为有很多杂带不纯，需要先纯化连接T载体测序，还有就是PCR之后两头都带有a碱基，这就是为社么能直接连接T载体的原因，
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2010-10-24 21:21jinrongyu613 | 十四级
原因很多，引物没有设计好，模板浓度过低等等
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2009-04-20 18:30热心网友
因为PCR产物不一定带有连接需要的粘性末端~~~
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2009-04-25 09:42wenkop301 | 三级
不同的反应是在不同的缓冲反应体系下进行，所以分子实验的一个原则是，在进行下步实验时，要经可能将上步实验中残留的缓冲体系去除干净，否则残留的缓冲体系将会影响后续反应体系的缓冲能力，干扰后续实验。补充一下。是否产物为粘性末端和平末端并不重要，因为对于两种产物都有不同的载体进行连接。 评论 | 2 0
2009-04-25 11:31wwwguoweinet | 四级
谁说不可以,我一直嫌回收纯化目的条带麻烦，所以我一直用PCR产物连接T载体，没问题
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2010-10-25 09:55songbocui66 | 五级
1.引物
引物设计出现问题的话，可能会出现引物二聚体，不能同模板结合，也就扩增不出基因片段。
2.温度
要选择适宜的退火温度，温度太高影响引物同模板结合效果。 3.DNA模板
DNA模板浓度不能太低，但这个条件不是影响PCR反应的决定性因素。 4.仪器出现故障
我曾经遇见过PCR仪器出现故障导致扩增失败的现象。
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2010-10-27 14:33olivia2010lm | 三级
1.引物:引物设计是否合理
2.PCR条件的摸索:温度，时间的选择。酶、稀释液的浓度等等 评论 | 0 0
2010-11-02 23:43wen1heng | 三级
PCR 反应的关键环节有?模板核酸的制备，?引物的质量与特异性，?酶的质量及， ?PCR 循环条件。寻找原
因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:?模板中含有杂蛋白质，?模板中含有Taq 酶抑制剂，?模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中
的组蛋白，?在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。?模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增
带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应
固定不宜随意更改。
酶失活:需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是
有时忘加Taq 酶或溴乙锭。
引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见
原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为:
?选定一个好的引物合成单 位。?引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物
原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引
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物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR 有可能失败，应
和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。?引物应高浓度小量分
装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。?引物设计不合理，如引物长度不够，引
物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特 异性，浓度过低则影
响PCR 扩增产量甚至使PCR 扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变:通常进行PCR 扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR 扩
增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失
败。
物理原因:变性对PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，
可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR 扩增效率。有时还有必要
用
标准
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的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。
靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去
互补序列，其PCR 扩增是不会成功的。
浙公网安备 33021202002483