【doc】从患“红脖子病”甲鱼体分离到虹彩病毒

【doc】从患“红脖子病”甲鱼体分离到虹彩病毒 从患“红脖子病”甲鱼体分离到虹彩病毒 l一|?3, 第18卷第2期 1998年3月 中国兽医 ChineseJournalofVeterinaryScience V0I.18, March N0.2 1998 从患"红脖子病"甲鱼体分离到虹彩病毒 陈在贤郜育林黜鼬物检疫局主实螅剐. 摘要从探圳某甲鱼场患红脖子病"的甲鱼体内分离到一株病毒.谈病毒于15,30?能在CO,FHM,CK, GCK等细胞中增殖,其中在CO细胞中的滴度最高.最适复制温度为25~30?,此时2dCPE可在9O以 上.在感染病毒的CO细胞单层上覆盖琼脂后2,3d能形成直径1,1.5mm的空斑.病毒对氯仿,pH3,pH9 敏感,DNA抑制剂(IUDR)能抑制其复制过程,提示该病毒为有囊膜的DNA病毒病毒提纯后经负染电镜 观察,可见到大量直径120~160nm的有囊膜的球形颗粒,放大后呈多面体.在感染病毒的细胞切片中,可见 到六角形的病毒颗粒存在于细胞核和细胞质内,并可见到病毒从细胞膜获得囊膜以上结果提示谈病毒属虹 彩病毒科,建议命名为甲鱼虹彩病毒(STIV).人工感染试验显示,该病毒对甲鱼有中等毒力,与传染性胰坏 死症病毒(IPNV),草鱼出血病病毒(GCRV),大马哈鱼呼肠孤病毒(CSV)在血清学上 投有相关性 生流行病,每天死亡10只左右,高峰时达70~80 只,其中有的出现"红脖子"症状.我们从患"红脖 子病"的甲鱼体内分离到一种虹彩病毒,并对其部 分特性进行了研究. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1病料来源患病甲鱼为深圳市某甲鱼养殖 场约1月龄甲鱼苗.该场甲鱼苗发生流行病而引 起大批死亡.从濒死的甲鱼苗中发现一些患"红脖 子病"的甲鱼,取数只于一20?保存. 1.2病毒分离 1.2.1细胞系CO(草鱼卵巢细胞),FHM(一 种鲤科鱼细胞),PG(狗鱼性腺细胞),CHSE(鲑鱼 囊胚细胞),R1(虹鳟鱼肝细胞),RTG-2(虹鳟鱼 性腺细胞),EPC(鲤鱼上皮瘤细胞),CK(草鱼肾 细胞).细胞均在含10%小牛血清的199培养液 中培养. 1.2.2病毒分离将冷冻保存的病甲鱼,体表用 酒精消毒后,剪开外壳,取出肝脏并剪碎匀浆,加 入每毫升含1000U青霉素和1000g链霉素的 本文收到日期l1997—10-06 199培养液,充分悬浮后4?过夜以释放病毒,然 后低速离心,去掉沉淀后上清过滤和不过滤,分别 接种于不同细胞系,25?培养,逐日观察细胞病变 (CPE). 1.2.3病毒的滴定病毒滴度用50终点稀释 法计算.病毒悬液按10倍系列稀释后,接种于长 满cO细胞单层的96孔板中,每稀释度3孔,每 孔0.1mL,于25?下培养并观察CPE出现情况. 7d后用甲醛固定,结晶紫染色计数.病毒量用 TCIDs.(半数细胞病变剂量)表示. 1.2.4空斑试验病毒悬液以10倍系列稀释 后,接种于长满CO细胞单层的24孔板中,每稀 释度3孔,每孔0.1mL,25~C吸附1h后吸去孔 内液体,加入50?预温的1营养琼脂0.5mL 覆盖,于25?下培养并观察CPE出现情况.7d 后用甲醛固定,结晶紫染色计数. 1.3病毒理化特性测定 1.3.1脂溶剂敏感,巨试验按照文献[13的方 法,每毫升病毒悬液中加入氯仿0.5mL,对照加 入199培养液0.5mL,振荡10min后低速离心 分离氯仿,小心吸取上层水相.处理样品和未处理 对照分别作TCIDs.测定. 1.3.2pH稳定性试验病毒悬液分别用1 mol/LHa和1mol/LNaOH词到pH3和pH9, 136中国兽医1998年 于20?保持1h后,再调回到pH7,然后和未处理 病毒分别作TCID测定. 1.3.3热稳定性试验病毒悬液置于56?水浴 1h,对照则置于20?,然后分别作TCIDs.测定. 1.3,4DNA抑制试验cO细胞传人96孔板, 长成单层后用50mg/L的IUDR处理12h,然后 测定用IUDR处理过的病毒的TCIDs.,同时以未 用IUDR处理的cO细胞作对照,并设立GCRV (草鱼出血病病毒)为RNA病毒对照口]. 1.4病毒形态学观察 1.4.1负染观察病毒接种于c0细胞,25?培 养,cPE完全后,冻融1伏,低速离心去掉细胞碎 片,上清经80000g离心2h,沉淀重悬于少量 Tris—HCI缓冲液中,经负染后电镜观察. 1.4.2切片观察离心收集刚开始出现CPE的 C0细胞,按常规方法固定,包埋,切片和染色,在 电镜下观察 1.5病毒的生物学特性测定 1.5.1宿主范围把CO,FHM,EPC,CHSE, R1,PG,RTG一2,CK,GCK等细胞接种于24孔 板,长成单层后每孔接种0.1mL病毒悬液,于 25?培养并逐日观察CPE.7d后收集上清,在 c0细胞中作TCIDso测定. 1.5.2生长温度在4个长满CO细胞单层的 小方瓶中各接种0.1mL病毒悬液,分别在15, 20,25,30?条件下培养,逐日观察cPE7d后收 集上清,在C0细胞中作TcID5.测定. 1.5.3感染试验将21只小甲鱼(体重4,6g) 分为3组:第1组每只腹腔注射病毒悬液0.1 mL,第2组后腿用针头划伤后在浓度为1O TCID5o/mL的病毒液中畏泡2h,第3组作正常 对照.' 1.6病毒的血清学鉴定将病毒悬液用199培 养液1O倍系列稀释后,分别加入等体积的1:50 稀释的兔抗IPN血清,兔抗GCRV血清和兔抗 CsV血清,对照病毒刚加入等体积的199培养 液.混匀后于25?作用1h,再接种到长满cO细 胞单层的96孔板,每稀释度3孔,每孔0.1mL,7 d后染色观察CPE出现情况,按照Rovozzo等口 的方法计算中和指数. 2结果 2.1病毒分离病甲鱼外部症状为颈部皮下出 血,形成典型的"红脖子"症状,烂嘴巴.解剖内脏 发现肝肿大,出血,有一些针尖大的出血点(附图 1). 肝脏制备的上清液接种到细胞后2,3d,在 CO,FHM,CK和GcK等细胞上出现CPECPE 的主要特征是先形成空洞,然后迅速变多,扩大, 直至整个细胞单层破坏(附图2).把有CPE的细 胞上清过滤后再接种到新的C0细胞,同一形态 的CPE能重复出现. 接种病毒的细胞单层用1的琼脂覆盖后, 可形成直径1,1.5mill,边缘比较清晰的空斑 (附图3).在玻片上培养成单层的cO细胞感染 该病毒后,用Giemsa染色未发现有包涵体,合胞 体或巨大细胞产生. 2.2病毒的理化特性见表1.结果显示,分离 到的病毒对热,pH3和pH9不稳定,对脂溶剂敏 感,表明病毒可能有囊膜. GCRV(RNA病毒)在试验中不受DNA抑 制剂(IUDR)的影响,而分离的病毒在有DNA抑 制剂存在的条件下受到抑制而不能增殖,提示其 核酸可能是DNA. 表1病毒对各种理化因子的敏感性 TCIDsn/0.1mL 2.3电镜观察病毒提纯后负染电镜观察,可见 到直径120,160IllTI有囊膜的球形颗粒,放大后 星多面体形状(附图4). 在感染病毒的细胞切片中可见到六角形的病 毒颗粒存在于细胞核和细胞质内,有些病毒通过 空泡向细胞膜移动和释放到细胞以外,并可见到 病毒从细胞膜获得囊膜(附图4,8).该病毒在负 染和切片中的形态特征都与典型的虹彩病毒形态 相似. 2.4病毒的生物学特性 2.4.1宿主范围病毒能在cO,FHM,CK, GCK等细胞中增殖,但不能在CHSE,R1,PG细 胞中产生CPE.其中在CO细胞中的滴度最高. CPE出现也较快. 第2期陈在贤等:从患红脖子病甲鱼体分离到虹彩病毒137 2.4.2温度特性病毒能在15,30"C范围内于 C0细胞中增殖并产生CPE,最适温度为25, 30"C,此时2dCPE可在9O以上,病毒最高滴 度可达10TCI./0.1mL(表2) 附图1.患病甲鱼(箭头示红脖子区域);CO细胞感染病毒后出现的CPEl3.病毒在 CO细胞单层上形成的空 斑;病毒提纯后负染的电镜照片(示有囊膜的球形颗粒);5.细胞切片(示六角形病毒 顸粒);6.细胞切片 (示细胞校中的病毒颗粒);7.细胞切片(示细胞质中大量的病毒颗粒)}8.细胞切片 (示病毒通过细胞膜向外 释放并获得囊膜) 138中国兽医1998年 表2病毒在不同温度下于CO细胞中的增殖 2.5人工感染试验2个感染组在1个月内均 出现程度不同的发病和死亡,其中注射感染组部 分有红脖子,脖子肿大和底板充血等症状.其他死 亡时有皮下出血症状,病死率3/7;浸泡感染组有 底板充血,烂底板等症状,病死率2/7.对照组甲 鱼无发病与死亡 2.6血清学鉴定当病毒对照为1O时,加人 抗IPNV,GCRV,CSV的抗血清后滴度下降不到 1个滴度.而这些抗血清对各自对应的病毒效价 都在1;8000以上,显示该病毒和上述3种病毒 之间在抗原性方面不相关. 3讨论 在甲鱼养殖场流行病学调查中,我们发现并 非所有患病或死亡的甲鱼都有"红脖子"症状.只 有少部分病甲鱼会出现"红脖子",即红脖子不是 该病特有的临床症状.人工感染试验的结果也显 示了选一点.因此,"红脖子"是否作为该病的特有 症状还值得考虑. 本研究分离的病毒,在形态结构,理化特性等 方面都与虹彩病毒的特性十分相似,我们认为该 病毒是一种虹彩病毒,建议命名为甲鱼虹彩病毒 (sT?).该病毒在虹彩病毒科中的地位还有待进 一 步研究.人工感染结果显示.该病毒对甲鱼有中 等毒力而在养殖场,由于存在环境压力和混合感 染等情况.有时可能f起较高的死亡率. 自6O年代以来.世界各地从鱼类,两栖类和 爬行类动物中分离到的虹彩病毒有6O种左右.其 中爬行类2种,鱼类10多种.两栖类4O多 种.j.有些有很强的血清学交叉反应,形态学 上也很相似.故有人认为它们可能是同种病毒的 不同血清型,但大多数尚未进行详细的比较目前 发现的有代表性的几种水生动物虹彩病毒是 Ranavirus属的蛙瘤病毒(FV一3),淋巴囊肿病毒 属的鱼淋巴囊肿病毒(LcDV一2)和金鱼病毒I型 样病毒属(GFV一1).另外,研究较多的有病毒性红 细胞坏死病毒(vENV)和流行性造血器官坏死病 毒(EHNV),但尚未确定它们属虹彩病毒科中哪 一 属.除了EHNv等少数几种外,上述大多数病 毒都不致病或仅引起少量宿主死亡.这可能是由 于这些病毒能引起宿主致病的范围很窄,但又易 被许多动物所携带的缘故 (本文电镜照片由华南农学院电镜室仑旋提供.特致 谢意) 参考文献 1FeldmanH—WangS.~nsitivityofvariousvirusesto chtoroformPressSocBioIMed.1961,106:736, 738 2AhneW.JiangYulin.Th0mso~lnI.Anewvirusiso— latedfr0mculturedgrasscarp(C,删0. idella).DiseasesofAquaticOrganism,1987,3(3): 18l,186 3Rovoz~oGC.BurkeCN.AiTlanuaIofhasictech— niques.Prence—HallInc+Englew~eedclefts.Jersey. 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Theviruswasprovedtobenotstabletochloroformtreatment,pH3andpH9,treatmentwith5-iodo一 2-deoxyuridineinhibiteditsreplicationindicatingthepresenceofDNAgenome.Underelectronmicro— scope,theinfectedC0culturefluidrevealedthesphericalparticlesmeasuring120to160nmindiame— ter.Observationofthin-sectionshowednumeroushexagonalviralparticlesinthecytoplasmandnu— clearofthecells.Infectiontestsshowedthisviruspossessedamediumvirulencetoturtle.Therewere norelationshipbetweenthisvirusandIPNV,GCRV,CSVinserology.Wewouldsuggestthatthis viruscouldbenamedassoft-shelledturtleiridovirus(STIV). Kel'wordsS0ft—shelledturtledisease;viraldiseases;iridovirus 带有人类基因的克隆绵羊诞生 英国苏格兰罗斯林研究所的科学家在世界上首次培育了2头带有人类基因的克 隆绵羊"莫利"和 "多利".这一成果可使人们在几年之内培育出太批同样的绵羊,并从它们的奶中廉 价获得大量药物或其 他化告物 罗斯林研究所的科学家1997年曾经用成年绵羊的体细胞培育出克隆绵羊"多利", 而"莫利"和"波 剌"是由绵羊胎儿的细胞培育成的.它们之间更重要的区剐是,"莫利"和"波利"带有 人类基因.这种带 有人类基因的克隆绵羊分泌的奶中会含有治疗血友病的蛋白质因子. 培育这2只绵羊的方法是"细胞核转移法".这与当初培育"多利"的方法一样.科学家用绵羊胎儿 的细胞核替换一头母绵羊的卵细胞核,然后把这个新合成的卵细胞植入另一头作为"代理母亲"的绵羊 子宫内,使其发育成台有植入基因的新一代.负责产生蛋白质因子的人类基因就移植在绵羊胎儿的细胞 核中 "莫剃"和"波利"再过几个月就能够产奶,届时科学家们就知道所移植的人类基因是否得到了表达. (摘自1998年1,El1日中国科)