【实验目的】
(1)熟悉小鼠结构,了解小鼠肠系膜的剪取
方法
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。
(2)熟悉并掌握苏丹三染色的原理及操作。
【实验原理】
脂肪是体内储存能量和供给能量的重要物质,根据其性质可以分为中性脂肪、脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等。很多细胞都含有脂肪,游离状态的脂肪呈小滴状悬浮于细胞质内,比较显著的如肝细胞。脂肪小滴可以集合,将细胞质及细胞核挤到一旁,如脂肪细胞。如果组织中脂肪过多,将会影响其正常功能。如脂肪肝。
脂肪不溶于水,易溶于浓乙醇、苯、氯仿和乙醚等,因此制作脂类标本一般不用石蜡切片,而用冰冻切片或者铺片法以保存脂类,固定多用甲醛类固定液。其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法和特异染色法等。
脂溶性染料显示法利用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV或者苏丹黑等溶于脂类,而使脂类显色的原理显示脂类,使用时,要注意选择溶剂,要求既要溶解苏丹染料,又不溶掉脂肪。
苏丹染料是偶氮染料,它对脂类的显示是一种简单的物理变化。
苏丹染料是一种脂溶性染料,易溶于乙醇但更易溶于脂肪,所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时,苏丹染料即脱离乙醇而溶于该含脂肪结构中而使其显色。
脂肪染料一般选用有机溶剂做溶剂,丙酮和乙醇对染料和脂肪都是很好的溶剂,这样可以染色大的脂肪积累块,但是小的脂肪滴会溶解。60%异丙醇当溶剂,可以减轻脂类的溶解。丙二醇或磷酸三乙酯不会溶解脂类物质,但是能溶解染料,是比较理想的溶剂。用这些溶剂配的染料溶液要过滤以去掉沉淀,防止蒸发,因蒸发会引起染料在材料中积累。常用相同溶剂洗掉多余的染料,然后再用水洗,可以防止多余的染料在材料中沉淀。
肠系膜是腹膜的双层膜,它在腹部的后壁连接着空肠和回肠,也就是说,它一般连接着多种腹腔的组成部分。
在本实验中,主要通过小鼠的肠系膜染色观察脂肪细胞,用断头法直接将小鼠杀死,分离小鼠的的腹腔处的肠系膜,经染色后,在显微镜下观察。
【实验材料】
器材:
镊子两把 显微镜 托盘一个 剪刀一把 滴管一支 小鼠一只
盖玻片载玻片各两片
试剂:
苏丹三染液 蒸馏水 70%乙醇 甲醛钙溶液
【实验步骤】
1、 检查实验所许多的试剂以及仪器是否齐全,准备实验;
2、 杀死小鼠:
1) 取一只小鼠置于解剖盘中,抓住小鼠的尾巴,确保小鼠的前爪在解剖盘中,慢慢的使小鼠安静下来;
2) 用剪刀紧紧的按住小鼠的颈的后部,使劲的向后拉小鼠的尾巴;
3) 按住剪刀几分钟,确保小鼠已经死亡;
3、 将小鼠的脸部朝上,用蒸馏水将小鼠的腹部湿润,用剪刀轻轻拉起小鼠的外皮,用剪刀在水平位置剪开一个小伤口,再用手扯开外皮,使肌肉层暴露,然后用剪刀轻轻的剪一个V字型的伤口,暴露腹腔;
4、 用剪刀轻轻的拉起小鼠的小肠,我们可以看到几乎透明的肠系膜,将肠系膜轻轻的展开,将一块5mm长宽的小的盖玻片粘附在接近血管处的肠系膜上;
5、 用剪刀轻轻的将盖玻片上的肠系膜剪断,小心操作,以免损坏肠系膜;
6、 将粘附有肠系膜的盖玻片放在载玻片上,用蒸馏水先进行润湿,吸干之后,再用甲醛钙固定20min,固定之后对细胞染色效果更好;
7、 用蒸馏水冲洗在盖玻片和载玻片之间的肠系膜,在载玻片的一端滴一滴蒸馏水,在另一端用吸水纸吸收蒸馏水;
8、 用同样的方法再用70%的乙醇冲洗;
9、 用少量的苏丹Ⅲ染液染色30min,染色后可以看到肠系膜上明显的变黄色;
10、用吸水纸吸干多于的染液,用蒸馏水清洗干净载玻片的底面和边缘,以及盖玻片的表面,之后在显微镜下观察;
【实验结果】
镜检照片
脂肪细胞
血管
图 1 低倍镜下脂肪染色(10×10)
脂肪细胞
血管
图 2 高倍镜下脂肪染色(10×40)
图 3 脂肪染色局部放大截图
【结果分析】
以上三幅图可看出观察到的脂肪细胞呈圆球形,内充满橘色脂类物质,并可以观察到小鼠肠系膜上脂肪细胞附着的血管。
但从图中也可看出,脂肪细胞多层叠在一起,且染色并不充分,细胞没有呈现出明显的桔红色,而是一种呈一种偏淡黄的颜色。造成这种现象可能的原因为:铺片时,没有将肠系膜铺的足够充分,导致脂肪细胞重叠,影响观察,进而影响了染色,因为细胞层数多,染液很难进入到细胞中,30min后,细胞依然没有呈现出桔红色。
在铺片时应掌握好力度,若用力过大,则肠系膜容易被撕破,铺片不成功;若用力过小,则细胞不能被铺呈单层,影响染色及观察。
【实验注意事项】
1.在抓握小鼠时,应迅速掐住其两耳之间的皮肤,使其头部不可扭动,并用同一只手掐住其背部至尾巴的皮肤,使小鼠整个腹部皮肤紧绷,不能反击。
2.铺片时尽量使细胞铺成单层,且要使小肠包围盖玻片大半部分,以防止肠系膜收缩,使细胞叠成多层。
3.找肠系膜时应尽量小心,以免将肠系膜扯破,且要找有血管的肠系膜,因为血管周围一般有脂肪组织保护,制作装片时应尽量用盖玻片铺开肠系膜。
⒋染料溶液脂类而使其着色,使用时应注意选择溶剂,要求既要溶解染料,又不溶解脂肪。