[农业]MS培养基及配制注意事项
一、MS培养基母液的配制
母液 浓缩 母液 配制1升
成 分 规定量 倍数 称取量体积培养基吸编种
(mg) (ml) 取量定容 号 类
KNO3 1900 10 19000 大
1000 量NH4NO3 1650 10 16500 1 100 元370 10 3700 MgSO4?7H2O
素 KH2PO4 170 10 1700 2 440 10 4400 1000 100 CaCl?2H2O 2
22.3 100 2230 MnSO4?4H2O
8.6 100 860 ZnSO4?7H2O
3 微H3BO3 6.2 100 620
1000 10 量KI 0.83 100 83
元0.25 100 25 Na2MoO4?7H2O
素 CuSO4.5H2O4 0.025 100 2.5
CoCL2.6H2O 0.025 100 2.5 4 Na2-EDTA 37.3 100 3730 1000 10 铁
盐 FeSO4.4H2O 27.8 100 2780
2.0 100 100 甘氨酸
5 有0.5 100 25 盐酸吡哆醇
500 10 机0.1 100 5 盐酸硫铵素
物 0.5 100 25 烟酸
6 100 100 5000 500 10 肌酸
注意:1(大量元素按照使用时高10倍的数值称取,分别将各种化合物称量后,除
CaCl?2HO单独配制外,其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解,用玻璃棒搅22
拌促溶,倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,置小口瓶中保存,贴上标签注明化合
物名称(或编号),浓缩倍数,配制日期和配制者姓名,CaCl?2HO配制同上置于另一小口22瓶中。
2(微量元素母液的配制
按要求浓缩100倍的数值称取,分别将各种化合物称量除铁盐(FeSO?7HO和42
Na-EDTA.2HO)作为一组单独配制外,其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后,22
定容在1000ml容量瓶中,置小口瓶中保存,贴上标签。
3(铁盐配制将FeSO?7HO和Na-EDTA.2HO分别溶于450ml蒸馏水中,加热,(很重要)4222
不断搅拌,溶解后,两液混合,调PH至5.5加水定容至1000ml,置于小口瓶中,贴上标签。 4(有机物母液配制,按母液要求浓缩50倍,除蔗糖按3%单独临时称量外,其余分别称量后,溶解,定容在500ml容量瓶中,置于小口瓶中保存,贴上标签。
5(母液最好在2~4?的冰箱中贮存,特别是有机类物质,贮存时间不宜过长,无机盐母液最好在一个月内用完,如发现有霉菌和沉淀产生,就不能再使用。
1( 制备母液和营养培养基时,所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求,化学药品必须是
高纯度的(分析纯)。
2( 称量药物采用高灵敏度的天平,每种药品专用一药匙。
(生长调节剂母液配制:
为了操作方便,节约时间,生长调节剂也可如同配制母液一样,先配成原液,这样配制培养基时只要稍加计算,按需要量取即可。
不同药品在配制时若不溶于水,可用少量不同的溶剂先溶解,萘乙酸(NAA),吲哚乙酸(IAA),赤霉素(GA),2,4-D等生长素和玉米素(ZT)可先用少量95%酒精溶解,然3
后加水,如溶解不完全再加热。激动素(KT)和6-苄基嘌呤(BA)可溶于少量1mol/L的盐酸中,叶酸需用少量稀氨水溶解。
称取50mg生长调节物质,溶解后,在100ml的容量瓶中定容,配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg,配制后一般要求在低温(0~4?)保存,配制培养基时如每升(1000ml)需添加的生长调节剂物质为0.5mg时,则取1ml母液即可。
二、培养基配制和灭菌
一(养培养基配制程序
(一).母液吸取量的计算
配制培养基的升数
公式1:母液吸取量= 母液体积(CC)×——————————
母液浓缩倍数
培养基要求的含量
公式2:母液吸取量= ———————————(各种生长调节剂)
母液每CC的含量
(二) 各种母液按顺序编号排列
A. 大量元素;B.CaCl.2HO; C.微量元素 ;D.铁盐; E.有机物; 22
F(生长素萘乙酸(NAA):配制0.5mg/ml的NAA称取50mg , NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml;G..细胞分裂素、激动素(KT)配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
(三) 配制培养基(1000ml)
1. 琼脂: 称取5~7g琼脂,加入300ml蒸馏水,加热溶解直至完全溶解为止.
2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替,称取30g白糖,溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水中。
3. 各种母液的吸取(培养基1L)
(1) 用50ml量筒量取大量元素母液(A)和CaCl?2HO母液(B)各100ml 22
(2) 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素(C),铁盐(D)母液各10ml
(3) 用10ml移液管或吸管吸取有机物(H)10ml
(4) 移取激素
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中,混合均匀后,加热至80?左右,用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0,过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。
二(分装:用一个接有胶管的分装器趁热装培养基,1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中,每个三角瓶约30ml左右(一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右)注:培养基勿碰瓶壁。
三. 包装:分装好的三角瓶用封口膜包扎好,标明培养基代号即可进行灭菌。
用具清理和洗涤:各种母液按原位置摆整齐,用过的量筒,移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净,然后按次序放回原处。
三、高压蒸汽灭菌锅的使用方法
具体操作步骤:
1. 高压锅放水至平把架;
2. 把包扎好的培养基装入高压锅;
3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.
4. 然后接通电源.
5. 压力计升至0.05MPa时,打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。
6. 排除冷空气后,关闭放气阀,待压力升到0.11MPa位置时,开始计算灭菌时间,具体方法:当压力锅指针升至0.12MPa时,关闭电源,待指针下降至0.11MPa时接通电源,不断重复此操作过程,维持20分钟。
7. 灭菌时间达到20分钟后,除去电源,打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后,打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。 8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长,应尽早使用,但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染,可将培养基置于25?下保存4天,如果培养基需要贮存较长时间,可在4?低温下保存。
灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格,无论哪种型号,操作的步骤都很相近。
进水?放进培养基?盖紧锅盖?关上放汽阀?检查安全阀?接上加热源?待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气,关上放气阀?0.11MPa(121?)下灭菌20~25分钟,保持稳定压力?除热源?逐渐打开放气阀?锅内空气排除完后?开放锅盖?稍冷后取出培养基。
四、无菌操作技术
(一)植物材料
表
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面——消毒剂灭菌
从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种。
1.接种步骤:
第一步:清理材料??流水冲洗??加入吐温(或洗衣粉)清洗
??自来水冲洗
第二步:对材料的表面浸润灭菌 : 70%酒精浸10-30秒??无菌水
第三步:灭菌剂处理?? 0.1-1%升汞5-8 min(或其他灭菌剂)
第四步:无菌水进行冲洗
注意事项:
,.灭菌剂一般要临时配制,现配现用(升汞可以短期储存(
,.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗,-,次,升汞一般,-,次,每次不少于,min ,.灭菌时要轻轻的搅拌,消除气泡,使消毒更彻底(
,.灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。
,.灭菌液要充分浸没材料
2.无菌操作可按以下步骤进行:
(1)在接种3天前用甲醛熏蒸接种室,并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌; (2)在接种前20分钟,打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯;
(3)接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿拖鞋等;
(4)上工作台后,用酒精棉球搽拭双手,特别是指甲处。然后搽拭工作台面; (5)先用酒精棉球搽拭接种工具,再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干;
(6)接种时,接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等;
2材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割。(如叶片切成0.5cm的小块;茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基)在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
(7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外线灯灭菌30分钟,若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。
常用植物激素
类别 名 称 缩写词 分子量 使用浓度范围 母液配制 说 明
2,4,二氯苯氧乙酸 2,4,D 221.0 0.001,10mg/L 生长素通常IAA易被植物生 用NaOH溶细胞所氧化。
α,萘乙酸 NAA 186.2 0.001,10mg/L 长 液滴至溶解故培养基中很素 成溶液。 少单独使用。 吲哚,3,乙酸 IAA 175.2 0.001,10mg/L 能溶于乙醇
吲哚,3,丁酸 IBA 203.2 0.001,10mg/L
6,苄基氨基嘌呤 BA 225.2 分裂素通常玉米素不耐细 能溶于稀热,不能高压
6,糠基氨基嘌呤 KT 215.2 胞 NaOH,含水灭菌。 分 乙醇或稀盐
N,异戊烯氨基嘌呤 ZT 219.2 裂 酸
(玉米素)
赤霉素 GA 346.4 能溶于乙醇 不耐热不能高3
赤 压灭菌在愈伤霉 组织和悬浮培素 养物的启动和
保持生长时才
需要有时小植
株再生时也需
要
四、常用药品的配置方法
1.1mol/L HCl的配制:根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19克/毫升,假设要配制1000ml 1mol/L HCl,则需要盐酸的物质的量为1mol,所以需要量取37%的盐酸为1*36.5/37%/1.19=82ml
2.1mol/L的NaOH的配制:称40gNaOH,然后融于1000ml的蒸馏水中。(定容到100ml) 3.95%的酒精配制成75%的酒精:用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸馏水即可得到75%的酒精。
如果用无水酒精配制75%的酒精,则量取750ml的无水酒精,再加水250ml。 4.0.1%的升汞配制:先称取1克升汞粉末,然后用蒸馏水溶解最后定容到1000ml。 5. 1mg/ml的2.4-D的配制:称取0.1g2.4-D,用少量1mol/LnaOH或酒精助溶,然后定容到100ml。
6.1 mg/ml的6-BA的配制:称取0.1g6-BA,用少量1mol/L HCl或1mol/LNaOH助溶,然后定容到100ml。
7.0.5mg/ml的NAA的配制:称取0.05gNAA,用少量95%酒精助溶,然后定容到100ml。