【doc】渗透压调节基因proBA的融合表达对大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响

【doc】渗透压调节基因proBA的融合 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达对大肠杆菌耐高渗胁迫能力的影响 渗透压调节基因proBA的融合表达对大肠 杆菌耐高渗胁迫能力的影响 45卷1期 2005年2月 微生物 ActaMicrobiologicaSinica Vo1.45No.1 February2005 渗透压调节基因proBA的融合表达对大肠杆菌 耐高渗胁迫能力的影响 刘瑞杰陈婷曹军卫 (武汉大学生命科学学院武汉430072) 摘要:枯草芽孢杆菌93151的渗透压调节基因proB和proA以重叠基因的方式组织,但是表达两个单独的蛋白质 ProB和ProA.通过引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 ,在抗脯氨酸反馈抑制耐盐突变菌株93151-14的proBA基因重叠区引入一个限制性酶 切位点,分别扩增出proB和proA基因,并构建融合的proBA基因.SDS—PAGE 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 显示有一条新的分子质量约为 85kD的蛋白带出现.相对于表达未融合的proB和proA,proBA融合基因的表达明显提高了宿主菌大肠杆菌JM83 胞内游离脯氨酸含量和其耐高渗胁迫能力. 关键词:枯草芽孢杆菌,脯氨酸,融合基因,耐高渗胁迫能力 中图分类号:093文献标识码:A文章编号:0001—6209(2005)Ol一0023—04 脯氨酸是许多生物(如细菌…,藻类,以及高 等植物)为适应胞外水势的降低而在胞内积累的 相容溶质.微生物在高渗胁迫条件下,既可以利用 胞外吸收,也可以通过胞内从头合成的方式积累脯 氨酸.其合成以谷氨酸为底物,经一谷氨酸激酶(一 GK或ProB,EC2.7.2.11),一谷氨酸磷酸还原酶(一 GPR或ProA,EC1.2.1.41)和吡咯啉一5一羧酸还原酶 (P5CR或ProC,EC1.5.1.2)3种酶催化合成,它们分 别由proB,proA和proC基因编码….高等植物中, 脯氨酸的合成也以谷氨酸为底物,由吡咯琳一5一羧酸 合成酶(A.pyrroline.5一carboxylatesynthetase,P5CS)和 吡咯琳.5一羧酸还原酶(A一pyrroline一5.carboxylate reductase,P5CR)催化合成,其中P5CS具有细菌中 . GK和一GPR的双重功能.P5CS在转基因植物 中的表达,显着提高了植物的耐高渗胁迫能力. 在大多数的细菌中,proB和proA基因在基因组 中紧密连锁,组成了一个操纵子,由proB基因的启 动子负责proBA基因的转录.不同的微生物中, proB和proA基因的组织方式是不同的,一般以长度 不同的连接区或者部分重叠的方式组织.如大肠杆 菌的proB和proA基因相隔11个碱基,而在单核 细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)中,proB 与proA基因重叠了17个碱基.这种重叠的基因 组织方式可能有利于一GK和一GPR相互靠近,以 复合体的形式共同起作用. 本室获得了枯草芽孢杆菌抗脯氨酸结构类似物 耐盐突变株93151-14,克隆出其proBA基因,发现 proB和proA是以重叠基因的方式组织的,proB基因 终止密码子(TGA)的前两个碱基TG与其上游第1 个碱基A组成了proA基因的起始密码子,且proB 基因第781位由T突变为A.尽管proBA基因是 以重叠的方式组织的,但仍以分离的方式表达ProB 和ProA两个蛋白.同时发现突变株的proBA基因 在大肠杆菌JM83中表达,显着提高了宿主菌耐高渗 胁迫能力.为获得融合的proBA基因,以研究其 表达对宿主菌耐高渗胁迫能力的影响,本研究通过 在proB和proA基因重叠区添加酶切位点的方法,去 掉proB的终止密码子,将proB和proA基因连接起 来,表达了一个大的融合蛋白.并分析了融合基因 的表达对大肠杆菌(Escherichiacoli)耐盐能力的影响 和胞内游离脯氨酸积累之间的关系,为proBA融合 基因转基因植物研究工作打下了基础. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1菌株和质粒:枯草芽孢杆菌93151—14为本实 验室已获得的抗脯氨酸结构类似物耐盐突变株?; 大肠杆菌(Escherichiacoli)JM83(proBA')由德国 Skerra_】教授赠送;pBE2表达载体由武汉大学沈 萍教授赠送;pBV220热诱导表达载体由湖北大学马 立新教授赠送. 1.1.2主要试剂:连接酶,限制性内切酶购自TaKaRa 公司.酶,DNA回收试剂盒为MBI公司产品. 1.1.3培养基:LB培养基配制方法参照文献[13]; MM(MinimalMedium)培养基采用Fiedlerl】的方法配 制 基金项目:武汉大学科技创新基金(204270023) 通讯作者.l:86—27—87872137;E-mail:caojw@whu.edu.ca 作者简介:刘瑞杰(1978一),男,山东临沂人,硕士研究生,研究方向为嗜极微生物分 子生物学.E-mail:ruijie.97@163tom 收稿日期:2004.06.14.修回日期:2004.09.23 24微生物 1.2proB基因终止密码子的去除与基因克隆 在设计引物扩增proB基因时,在其最后一个氨 基酸密码子AAA和proA基因起始密码子ATG之间 添加一个nI限制性酶切位点,将其终止密码子 去掉.上游引物为:5.GGCCTGCAGACGGAGGAG AAAcTA.3(含,I酶切位点),下游引物为:5. GGCTCTAGArITrrG瑚CCCCCTC.3(含XbaI酶切位 点).PCR反应体系(25L):10×buffer2.5L, MgC1,2mmol/L,dNTPs各0.2mmol/L,上下游引物各 10~mol/L,Taq酶1.3U.以下反应体系各物质的浓 度相同.PCR反应条件:95oC5rain;94?30s,55oC 1min,72oC3min,共30个循环;72cc10min.PCR产 物纯化后经,I和XbaI双酶切,连接到同样双酶 切并纯化的pBE2载体上,转化大肠杆菌JM83 (proBA一),涂布Amp抗性的LB平板上37cC培养. 提取重组质粒,经双酶切筛选出阳性转化子. 1.3proA基因的克隆和含融合基因的重组质粒的 构建 扩增proA基因的上游引物添加了与proB基因 下游引物同样的XbaI酶切位点.proA基因PCR产 物经双酶切连接到proB基因的下游,构建成含融合 基因的重组质粒.上游引物为5.GGCTCTAGAAT GAGTGAAGTATI'G-3(含XbaI酶切位点),下游引 物为5.GGCGAGCTCATCGTCAATCTCCCCGCACA.3 (含SacI酶切位点).PCR反应条件除退火温度为 51oC外同上.PCR产物纯化后经XbaI和SacI双 酶切,连接到同样双酶切的已经插入proB基因的 pBE2.proB质粒上,转化大肠杆菌JM83,涂布Amp抗 性平板37cc培养.质粒经双酶切和DNA测序确认 筛选出含有proBA融合基因重组质粒的阳性转化 子,命名为JM83(pBE2.proBA/MF). 1.4proBA融合基因的功能互补鉴定 挑取JM83(pBE2.proBA/MF)单菌落划线接种到 MM培养基平板上,37cc培养.待菌落长出后,重新 划线接种到MM培养基上,以进一步鉴定. 1.5proBA融合基因的克隆和表达产物的SDS. PAGE分析 以质粒pBE2-proBA/MFDNA为DNA模板,扩增 proBA融合基因.上游引物为:5.GGCGGATCCG AAACTATGAAAAAG.3(含BamHI酶切位点),下游 弓I物:5.AGCCTGCAGCTTAAAAAGACTATAC.3(含 ,I酶切位点).PCR反应条件除退火温度为53cc 外同1.4节.PCR产物经日nmHI和PstI双酶切 并纯化后,连接到经同样双酶切并纯化的表达载体 pBV220上,转化大肠杆菌JM83(proBA一).提取质 粒,双酶切鉴定出阳性转化子,命名为JM83 (pBV220.proBA/MF). 胞内蛋白质样品制备参照翟超等"的方法. 挑取JM83(pBV220.proBA/MF)和已经构建的含有突 变株proBA基因的转化子JM83(pBV220-proBA/ M)?单菌落,接种到含有Amp的LB液体培养基 中,30cc过夜培养后,按1%接种量转接.培养至 OD值约0.4时,立即转到热诱导温度42cc,继续 培养4h后,离心收集菌体,加入lOOt~L1×上样缓冲 液重悬菌体,100oC煮沸5min,lO000r/min离心,取上 清进行SDS.PAGE分析. 1.6JM83转化子耐高渗胁迫能力的测定 分别挑取JM83(pBE2.proBA/M)和JM83(pBE2. proBA/MF)单菌落,接种到含有Amp抗性的LB液体 培养基中,37cc培养10h,离心收集菌体,用MM培养 基洗涤两次后,转接到MM液体培养基中,37cc培养 至对数生长后期,再按适当比例转接到含不同NaC1 浓度(0.3,0.4,0.5,0.6mol/L)的MM培养基中, 使初始OD值约为0.03,37oC,220r/rain震荡培养. 每2h测定一次OD值,以培养时间为横坐标,以 OD值为纵坐标,绘制生长曲线.转化子的最高耐 盐能力定义为:转化子在上述振荡培养时若48h内 OD值没有变化说明在此盐浓度下不能生长,同其 他盐梯度的生长情况对比,我们就可以初步确定最 高耐盐能力. 1.7胞内游离脯氨酸含量的测定 按Whatmore15]的方法测定大肠杆菌JM83转化 子胞内的游离脯氨酸含量. 2结果和讨论 2.1proBA融合基因的构建 在前期的研究工作中,我们发现proB和proA首 尾重叠.proB基因终止密码子(TGA)的前两个碱基 TG与其上游第1个碱基A组成了proA基因的起始 密码子….尽管proBA基因以重叠的方式组织,但 仍以分离的方式表达ProB和ProA两个蛋白.其中 proB基因为ll13bp,编码一个由370个氨基酸组成 的蛋白质分子10],proA基因为l248bp,编码一个由 415个氨基酸组成的蛋白质….为获得proBA融合 基因,本研究在设计下游引物扩增proB基因时,经 在其最后一个氨基酸密码子AAA末端插入7个核 苷酸ATCTAGA,即引入一个限制性酶切位点舳nI. 以扩增出没有终止密码子TGA的proB基因.proA基 因上游引物同样添加了Xbal酶切位点.这样 XbaI酶切位点做为一个Linker(编码丝氨酸和精氨 酸)将proB和proA基因连接起来置于pBE2载体 SP6启动子的下游. 实验中,以突变株93151.14基因组为模板,第 一 次克隆出proB基因,将proB基因连接到pBE2表 娟瑞杰等:渗透压垌节基田proBA的融台表达科大厮什苗耐高渗聃迫能力的影响 选栽伴上重组质粒(pBE2一p几)经PstI和??I 双酶}玎,能够划F约11kb(proB基)的片段,说『IJ1 ,基因已连接到IlBE2表达载怍L然后将扩增 的proA基阂连接到已经含有prol3崮的重组质粒 pBE2一proB,重组质粒rpBE2一proB,4)经6nl和 能下一条约1.2kb(proA基)大小 S-I双酶切, 的带.同时采用Pstl和Sat-I驳酶圳,挠得_,?条 约24kb的产物【proBA融合基因).说明proBA基 因已经战功的连接到pBE2表达载I卓上:经删序鉴 定.表明酶切位点已经如所设计的方式成功地插^, 将两个基困连接起米,井凡没有瓮堂产生 2.2proBA融合基因的功能互补鉴定 利用功能瓦补的方法来凝定proBA融合基因表 达产物的活性将JM83(pBE2一proB.4/MF)划线接种 到不含脯氯酸的M3.'1培养基上37培养.经过I2h 就能长出菌落一第二次划线8h祧能长出菌蒋说 明融合以看的proBA壁能够表达有活性的产物, 从而矬化台成脯氨酸.使JM83菌株:幕奉培养挂中 获得很好的生 2.3融合基因表达产物的SDS.PAGE分析 为了验证获得的proBA融台基匹l是雨表达为融 台的Pn~BA蛋白.将proBA融台基因范隆到B220 表达载体上.在大肠杆苗JM83内进行了表达表达 产物经SDS—PAGE分析(图1Iq见含有非融合基 因重组质粒的JM83(pBV220proBA,M)表达出『埘种 蛋白.分子量分别约为40kD(.R)和45kD【Pr4,A) (图1.津道2,3)I而表达proBA融合基的细胞显 示有一条约85kD的新蛋白带产生(嘲I.淋道1j, 40kD处的PmB蛋白质带消失.怛45kD处ProA的蛋 白质带仍旧存在过晚明融台的pr+刖基确实能 够表达一个太的副!台蛋rI40k1)处ProB蚩白质 带消失.是由于proB因被去除了终止密子.不 能仙表达.这也验了我们肘proB基因终止密码 的推测...而pro:l嬉网之所以仉能表达.是眭】于 其些周和推测的虹)序列均没有做改变之敞 图iJM83【pBV220-proBA/MF}表选产物的SDS-PAGE FigISD:~IAGI:-T】v…If?【…Il】utIMS?t'pL~.220 n'/M? 1.IM83(pIlV220-pr~IB,%,'MFii.2amt3.151t+3'pBk220…B^,? 4JM83(pBV2~)):5Pmt+qttm埘kPt 2.4proBA融合基因的表达对大肠杆菌JM83耐 高渗胁迫能力和胞内游离脯氨酸积累的影响 为了解proBA融台羹的丧达对宿主茁耐高渗 胁迫能的影响,测定JM83cpl~.E2一tm~BA/MF)在 不NaCI浓睦液体MM培养基小的,K(图2) 图2不同盐浓度下n183IpBE2?proB.4/MF)和JM船 cpBE2-proBAIM】的生长比较 }(……"…nl…"]b1"83Il—H^'m1r1]Mg3 LpBF;2一',M】in,lir-lNaGI-…lt… 【十lrth,kixlka~M83(pBE2-pmB..IMP:llll,l1H).1?JMl lI,BE2一pmRA,M0 从图2可看出,随着盐浓度上升.JM83 pBE2一pn~BA/MF)和JM83(pBE2proBA,M)q长旧延 迟期和到达稳定期的时间都延长lj在J一盐浓度 FJM83(pBE2一proBAIMF)均比J?83(PBE2一proBAf M)}毛的延迟期和达到稳定期的时问要短,说『啊其 i乇更快,代时要短住进一步的骗I}i,.IM83 fpBE2一proB.'t/MF)最高耐盐能力为06ntol/LN"CI. .IM83(pBE2一proBAIM)最高,,r-i能耐0.5mol/LNaCI 与1E融台基因的表达相比,融合基的表达使龠主 细胞的耐盐能力提高了20%,说明构建的融合基 确实提高了JM83宿主细胞的耐高渗胁迫能力 将JM83(pBE2proB.4/MF)1D:183fI,BE2一 :+roBA/~.'1)细胞分别接种干(),5ll|l,l/I.aCI的MM 培养基小培养12h,删定r其胞内的晰离脯氧陂含 垃..JM83(pBE2-proBA/MF)的胞内游离脯氨酸禽量 为2(H).63rtgf细胞.而】M83(pBE2一/tr~/M1仪为 l303. ,,f:细胞与表达非融台基I宿丰细胞 相比.融合基因的表达使JYI83宿细胞胞内游离脯 氨酸含提高丁54.3%,这种融『,游离脯氯酸舍 赶的差肄,是JM83(pBE2一proB^/MIHK决,能耐更 高谬透压胁迫的原因'. 尢高渗环境下.枯草芽孢杆菌细胞I'q台成脯赵 酸途径中nq第?个中『'日j产物各氨酰磷酸培很不稳定 [1勺.如7-【K和7-C:PR能够中盯互靠近.1'复合体fl勺 形式共同起作用,则可以尽快的将件氯酰磷酸催化 进一步合成脯氨酸.提高脯氮酸台成的地率"奉 研究发现,帖草芽孢杆菌93151的proBA肇因尽管 …… 26微生物45卷 是一个天然的重叠基因,但仍旧表达出两个单独的 蛋白质?.本研究成功构建了融合的proBA基因. 这样使表达的融合蛋白一GK/y—GPR相互靠近,更有 利于生物体在高渗胁迫下脯氨酸的快速合成,从而 提高了细胞抵御渗透压胁迫的能力.由于在设计中 没有改变proA基因的起始密码子和推测的SD序 列,所以proA基因仍旧会单独表达.由于在真核细 胞内,翻译过程不需要识别SD序列,所以如果在真 核细胞内表达proBA融合基因,则不会表达单独的 ProA蛋白.因此本研究构建的proBA融合基因可以 用于转基因植物研究,提高植物的耐高渗胁迫能力. 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ConstructionoffusedosmoregulationproBAgenefromasalt— tolerantmutantofBacillussubtilis anditsinfluenceontheosmotoleranceofEscherichiacoli LIURui—jieCHENTingCAOJun—wei (CollegeofLifeSciences,WuhanUniversity,Wuhan430072,China) Abstract:TheosmoregulationproBandproAgenesfromBacillussubtilis93151areoverlappinggenes,whichencode twoproteinsProBandProA.ArestrictionenzymesitewasinsertedintheoverlappingregionofproBandproAgenesfrom asalt— tolerantmutantofB.subtilis93151,andafusiongenewasconstructedbycloningproBandDroAgenes respectively.SDS— PAGEanalysisshowedthatanovelproteinwithmolecularmassof85kDwasobserved.When expressedinE.coli,enhancedintracellularconcentrationsoffreeprolineandosmotoleranceofthestraincarryingthe fusiongenewereobserved,comparedwiththecontrolhostcellharbouringaplasmidencodingtheseparateProBand ProA. Keywords:Bacillussubtilis,Proline,Fusiongene,Osmotolerance Foundationitem:ScientificTechnologyFoundationofWuhanUniversity(204270023) Correspondingauthor.Tel:86-27-87872137;E-mail:caojw@whu.edu.cn Receiveddate:06.14.2004