CdS荧光技术在食品蛋白质检测中的应用研究

CdS荧光技术在食品蛋白质检测中的应用研究 烈 ’,‘蹲,、 、;、。,. :. // 关于学位论文独创声明和学术诚信 承诺 党员整改承诺书工程质量保证服务承诺书供货时间与服务承诺方案食品安全承诺书我公司的设计优势和服务承诺 本人向河南大学提出硕士学位申请.本人郑重声明:所呈交的学位论文是 本人在导师的指导下独立完成的,对所研究的课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 有新的见解.据我所知,除 文中特别加以说明、标注和致谢的地方外,论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的研究成果,也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而 使用过的材料.与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 在此本人郑重承诺:‘所呈交的学位论文不存在舞弊作伪行为,文责自负。 学位申请人学位论文作者签名:年乒月 关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者,本人完全 了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求,即河南大学有权向国家 图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文纸质文 本和电子文本以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校 学术发展和进行学术交流等目的,可以采取影印、缩印、扫描和拷贝等复制手 段保存、汇编学位论文纸质文本和电子文本。 涉及保密 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 的学位论文在解密后适用本授权书 学位获得者学位论文作者签名: 年午月.. 荔否芝 学位论文指导教师签名: 年牟月日 摘要 蛋白质是生命的物质基础,是构成生物体细胞组织的重要成分,是生物体发育及 修补组织的原料。蛋白质在维持人体内的酸碱平衡、传递遗传信息、调节代谢、催化 生物体内各种反应进行等方面都起着至关重要的作用。食品中蛋白质的分离、定性及 定量分析是食品检验中最重要的工作。随着分析手段的不断进步,对食品中 蛋白质含 量的测定方法也正向准确和快速的方向发展。 近年来,利用荧光试剂或有机染料与蛋白质作用,结合荧光光度法定量测定蛋白 质含量的方法得到了很大的发展,此方法具有灵敏度高,线性范围宽,检出限低,操 作简单、快速等特点,适用于常规分析。而新型荧光试剂量子点的出现,对该方法的 研究起了很大的推动作用,量子点具有激发光谱宽且连续分布、发射光谱窄而对称、 光谱可调谐、稳定性好、抗漂白能力强等优点,这些特殊的光学性质,使其在分子生 物学、细胞生物学、基因组学、药物筛选、生物大分子相互作用等研究中有极大的应 用前景,但是利用量子点测定食品中蛋白质含量的研究报道较少。 本文以荧光光度法为检测手段,合成具有优异光学性质的荧光试剂,使其与蛋白 质作用,探寻定量测定蛋白质更简单、更灵敏的方法,并用于样品检测。主要研究内 容包括: 一.综述了蛋白质测定方法,量子点合成及其在生物分子检测中的应用。 二.建立了.牛血清白蛋白荧光光度法测定蛋白质含量的新方法:在 为.的.缓冲溶液中,与作用,使本身的荧光强度显著增 强。该方法用于牛奶、蛋清中蛋白质含量的测定,并与双缩脲法作对照,结果 满意。 三.研究了多种表面活性剂对.体系荧光特性的影响:结果表明,阳离子表 面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵对体系有显著的增敏作用,而阴离 子表面活性剂如十二烷基硫酸钠有猝灭作用,且有乳状沉淀产生,非离子 表面活性剂如吐温.对体系的荧光强度影响较小,在此基础上选择与 .的硼酸.硼砂缓冲溶液 体系作用,建立了测定蛋白质含量的新方法。在中,的加入,可以使体系的荧 光峰显著增强。该方法可用于肉松、豆 浆中蛋白质含量的测定,与考马斯亮蓝法作对照,结果满意。 四.前文中基于能使荧光强度显著增强,建立了测定蛋白质的方法。但是 直接与作用,在使荧光强度增强的同时,其荧光吸收峰发生蓝 移,从而给测定结果造成一定的影响。本文经研究发现,先使.羟基喹啉与 .的硼酸一硼砂缓冲溶液,的荧光强度降低,且吸收峰蓝 作用 移至,然后再加入,体系的荧光吸收峰仍在处不变,荧光强 度显著增强,并且在一定浓度范围内,体系的荧光强度与的浓度呈良好的 线性关系,据此建立了.羟基喹啉荧光光度法测定蛋白质的新方法。该 法用于肉松、鸡精、奶粉等食品中蛋白质含量的测定,并与双缩脲法做对照, 结果满意。 五.实验以水溶法制备了具有核壳结构的/微粒,研究了该微粒与牛血清白 蛋白作用后体系的荧光特性,建立了/荧光光度法测定蛋白质的新方 .的缓冲溶液中,/与牛血清白蛋白 法:在 反应后,荧光强度显著增强,并且荧光强度的增强与牛血清白蛋白的 浓度有良好的线性关系。该法用于食品和尿液中蛋白质的测定,并与考马斯 亮 蓝法比较,结果满意。 六.与课题相关的其它研究:以乙酸锌为锌源,硫化钠为硫源,巯基乙酸为修 饰剂水相合成了微粒。基于微粒能与结晶紫反应使结晶紫的吸光度降 低,加入牛血清白蛋白反应后,体系的吸光度显著增强,据此建立了结晶紫. .分光光度法测定蛋白质的新方法。该法用于肉松、酸奶等食品中蛋白 质含量的测定,与考马斯亮蓝法做对照,结果满意;研究了食品中糖精钠 含量的一种新的测定方法,在 .的..缓冲溶液中,结 晶紫与糖精钠作用可使结晶紫吸光度显著增强,据此建立了结晶紫.紫外光 度法 测定食品中糖精钠含量的新方法。该方法应用于食品中糖精钠含量的测定, 与 国标法.高效液相色谱法对照,结果满意。 关键词:量子点,蛋白质,荧光技术 ,, .,, . ,, , , , . , . . ,, , ,.弱 ,, ,觞, , . ,, ,, ., ,. :. , . . :.. . ? .. 舔 , , . . ... , . . . . , .. . , , , , , . . ., , . ./ ./ . .. . , .. : ., , . , , . , , . .., ? . . .?, , . : , 目录 摘要?.~ 目录 育行言? 第一章绪论? 蛋白质测定方法研究进展 .测定蛋白质含量的经典方法.. .紫外光度法.荧光光度法?.. 量子点的合成及其在生物分子中的应用. .量子点的结构与发光原理?.. .量子点的性质一 .量子点的制备.. .量子点在生物分子中的应用? 课题的提出。 参考文献第二章硫化镉荧光光度法测定蛋白质含量的研究 引言?. 实验部分?. ’.试剂与仪器? .荧光微粒的制备 .实验方法??.. 结果与讨论 . 合成条件的选择. . .体系的荧光光谱? .酸度对体系荧光强度的影响.. . 用量的影响??。:一 .反应温度和时间的影响.工作曲线??. .共存离子的干扰.样品测定及对照实验. .加标回收试验? 本章小结?... 参考文献第三章表面活性剂对?荧光体系的影响及其应用??.. 引言?. 实验部分一 .试剂与仪器?.. .实验方法??. 结果与讨论??.. .表面活性剂的选择? .荧光光谱 . 的影响、缓冲体系及用量的选择一:. 用量的影响??. . 溶液用量的选择.反应温度和时间的影响??.. .工作曲线??.. .共存离子的干扰.样品测定及对照试验... .加标回收试验??。 本章小结??. 参考文献第四章一.羟基喹啉荧光光度法测定蛋白质含量的研究引言?. 实验部分.. .试剂与仪器?一 .实验方法结果与讨论 .荧光光谱??. .酸度对体系荧光强度的影响. . 溶液用量的影响? . .羟基喹啉溶液用量的影响? .反应温度和时间的影响.共存离子的干扰??。 .工作曲线.样品测定及对照实验 .加标回收试验. 本章小结参考文献第五章/荧光光度法测定蛋白质的研究? 引言?. 实验部分.. .试剂与仪器? . /荧光试剂的制备.实验方法结果与讨论 .荧光光谱. 的影响、缓冲体系及用量的选择 . /溶液用量的影响?。 .反应温度和时间的影响.工作曲线.共存离子的干扰. .样品测定及与对照试验. .加标回收试验? 本章小结?.. 参考文献第六章其它相关研究工作?.. 第一节结晶紫..体系分光光度法测定食品中蛋白质的含量.. 引言. 实验部分 结果与讨论结论. 参考文献?.. 第二节结晶紫一紫外光度法测定食品中糖精钠的含量? 引言. 实验部分? 结果与讨论??. 参考文献? 本章小结? 结束语? 致谢. 攻读学位期间发表的学术论文目录?. 前言 .上? 月 吾 蛋白质是复杂的含氮有机化合物,分子量大,高达数万甚至数百万,通常由多 种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来,并且具有一定的空间结构,包含的主要 化学元素有、、、,某些蛋白质中还含有微量的、、、等元素,但是含 氮是蛋白质区别于其它有机化合物的主要标志【】。 蛋白质是生命的物质基础,在生物体内占有特殊的地位,它和核酸是构成原生质 的主要成分,同时也是生物体发育及修补组织的原料,一切有生命的活体都含有不同 类型的蛋白质。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源,具有糖类和脂肪不可替代的 作用。人体内的酸碱平衡、水平衡的维持,遗传信息的传递,营养代谢,细胞结构, 酶,激素,病毒,免疫,物质的代谢及运转都与蛋白质有关,所以蛋白质是人体重要 的营养物质。 蛋白质可以被酶、酸或碱水解,最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质最基本 的物质,现在从各种天然源中分离得到的氨基酸已达种以上,但是构成蛋白质的氨 基酸主要是其中的种。而构成蛋白质的氨基酸中,亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、 异亮 氨酸、赖氨酸等种氨基酸在人体内不能合成,必须依靠食品供给,故被称为必需氨基 酸,它们对人体有着极其重要的生理功能,常会因其在体内缺乏而导致患病。 随着食品营养知识的普及,食物中蛋白质含量的高低愈来愈得到人们的重视,但 是近几年来发生的食品中毒事件也让人毛骨悚然。目前国际上采用的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 方法如凯氏 定氮法只能测定食品中总含氮量蛋白质氮和非蛋白质含氮化合物,再通过换算计算 出蛋白质的含量,所以这种方法本身就存在很大的缺陷。如年轰动全国的“三聚氰 胺事件”,一些不法商人向牛奶和奶粉中加入三聚氰胺,目的是为了提高食品中的含氮 量,造成蛋白质含量高的假象,从而对消费者的身体健康造成了严重危害。甚至有些 不法奸商将废旧皮革制品甚至动物毛发予以“水解”后生成的粉状物质混入牛奶中, 用于提高蛋白质含量,这种皮革奶长期食用可能会致癌。由于皮革水解蛋白本身 就是一种蛋白质,所以其检测难度比三聚氰胺还大。另外食品中蛋白质的种类很 多,目前在鉴别蛋白质的种类及各类的检测上尚无更为准确的方法。因此,探究食品荧光技术在食品蛋白质检测中的应用研究 中蛋白质含量的简便、准确、快速的测定方法已经迫在眉睫。 随着分析手段的不断进步,食品中蛋白质含量的测定方法也正向准确和快速 的方向发展【,本课题在已有研究基础上,研究食品中蛋白质含量测定的新方法。 第一章绪论 第一章绪论 蛋白质测定方法研究进展 目前,测定蛋白质的方法有很多种,大致可分为两类:直接法和间接法【】。直接 法是根据蛋白质的物理和化学性质,直接测定蛋白质含量的方法;间接法是通过测定 样品中蛋白质的含氮量进行推算蛋白质含量的方法。 多年来,利用蛋白质的主要性质如含氮量、肽键、折射率等和蛋白质含有的特 定氨基酸残基如芳香基、酸性基、碱性基等来测定蛋白质含量的方法在不断发展, 常见的经典方法主要有凯氏定氮法,国际经典测定方法、双缩脲法、 考马斯亮蓝法、.酚试剂法【引,此外还有紫外分光光度法【。】、荧光光 度法【?、质谱法【。、共振瑞利散射法【】、金属.染料结合法【、化学发光法【、 免疫法【、纳米粒子法【、等离子体共振法【、过渡金属羰基法【和滴定法等。 .测定蛋白质含量的经典方法 ..凯氏定氮法 由于食品种类繁多,食品中蛋白质含量各异,特别是干扰成分多,如碳水化合 物、脂肪和维生素等。而且新鲜食品中的含氮化合物大都以蛋白质为主体,所以检验 食品中蛋白质时,往往只限于测定总氮量【】。目前,测定蛋白质含量最常用的方法是 凯氏定氮法,它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一,在国内外普遍应 用。凯氏定氮法的基本原理是含蛋白质的样品在催化剂的作用下,与以浓硫酸为主要 组分的消化液一同加热消化,使样品中蛋白质分解,试样中的蛋白质氮及其它有机氮 转化为氨态氮,其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出,而氨态氮再与硫酸结合成硫 酸铵。在强碱条件下,对硫酸铵溶液进行蒸馏,使氨气逸出,用过量硼酸溶液吸收生 成硼酸铵,并用标准盐酸溶液滴定,根据标准盐酸的消耗量可计算出样品中氮的含 量,从而折算出蛋白质的含量【?】通常由含氮量乘以系数.计算出蛋白质的 含量, 乳制品通过乘以系数.计算【习。凯氏定氮法测定蛋白质含量的过程,主要包括消荧光技术在食品蛋白质检测中的应用研究 化、蒸馏、吸收、滴定等步骤。 凯氏定氮法测定结果准确,重现性好,但操作复杂费时,试剂消耗量大。许多科 研工作者经过实践探索,对凯氏定氮法在测定过程上做了很多改进。 李宁【认为凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质 测定的经典方法,适用样品广泛,测试结果准确。 王雅四认为凯氏定氮法样品的最佳消化条件为?.,., 浓.;?的用量为影响消化时间的主要因素,和浓 用量为第二和第三主要因素;用此最佳条件试验,消化时间仅为,与其他 ,,浓用量对比,该法所需消化时间最短、试剂用量减少、 可降低实验成本、也降低了对环境的污染。 邓小超等【对凯氏定氮装置进行了改进,用高压锅做水蒸气发生器,串连几套定 氮仪,可同时测定几份样品。节省时间,提高了工作效率。改进后的方法适用于批量 食品蛋白质的测定,具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。 石艳静【刀在蛋白质的测定过程中,尤其在消化方面进行了改进,用三角烧瓶代替 定氮瓶进行消化,取得了较为满意的结果,达到了易固定、消化时间短,定量方便, 适用于大批样品消化的目的。 凯氏定氮法测定的是样品中粗蛋白质的含量,测定出的结果不仅包含可以被人体 吸收的蛋白质,还包括非蛋白氮,如三聚氰胺,因此这种方法不能区分食品中的伪蛋 白质。一些不法分子利用测定方法的漏洞在牛奶和奶粉中添加三聚氰胺冒充蛋白质, 不仅对人体造成了很大的危害,而且给国家也造成巨大的经济损失‘矧。 ..双缩脲法 双缩脲是两分子的脲经左右加热,放出一分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物,称为双缩脲反应【。凡 具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或间隔一个碳原子相连的肽键结构的化合物 都可以发生双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分 子量及氨基酸成分无关,可用来测定蛋白质含量。此方法对各种蛋白质呈色基本相 同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便,但灵敏度 不高,约为,故现在已很少使用】。 第一章绪论..考马斯亮蓝. .,法 在酸性溶液中呈红棕色,最大紫外吸收峰位于,与蛋白质结合后溶液 颜色变为蓝色,最大吸收峰红移至。在一定条件下,体系的吸光度与蛋白质的 浓度成正比【。 但是这种染料最容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰键结合,这种特异性可导 致对不同的蛋白质检测时结果差异较大,这是此方法的主要缺陷。并且蛋白质.的 混合物是不溶的,极大的影响了测定结果的准确度,为了克服这些问题,许多研究对 此方法做了改进【?。 .. .酚试剂法 这是蛋白质测定法中最灵敏的方法之一,其原理与双缩脲法基本相同,只是加入 了.酚试剂,在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物,一酚试剂 中的磷钼酸盐、磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,使溶液呈现深蓝 色钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的条件下,蓝色的深浅与蛋白的量成正比【】。但 是酚类、柠檬酸、硫酸铵、晡缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有强的干扰作用。 .紫外光度法 ..紫外吸收法 蛋白质分子及其降解后的产物中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在 处具有紫外吸收,其吸光度与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在的光吸 收值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度成正比 的关系,并参照事先用凯氏定氮法测定蛋白质含量的标准样所做的标准曲线,可计算 出样品中蛋白质的含量【。 本法操作简单快速,不消耗样品,测定后还可回收,常用于食品及生化研究工 作。由于许多非蛋白质成分在紫外光区也有吸收,再加上光散射作用的干扰,虽可以 校正,但还是存在一定的误差,所以此法应用并不广泛【?。 ..有机染料结合分光光度法 采用分光光度法对蛋白质进行定量分析大多是基于有机染料与蛋白质的结合作用 所产生的显色或褪色反应,这类方法不需特别装置,而且简便、快速、准确、经济、 污染小,应用已有五十多年。目前采用分光光度法定量分析蛋白质所使用的染料主要 荧光技术在食品蛋白质检测中的应用研究 有四类,分别为三苯甲烷类染料、偶氮类染料、花菁类染料和金属络合染料 ‘彤。 罗宗铭等【硎使用甲基百里酚蓝和溴邻苯三酚红作为探针,与蛋白质作 用时最大吸收波长红移,且吸光度增大,其中甲基百里酚蓝除有磺基之外,还有氨羧 .时作用明显,作用机理尚不能用 基团,在酸性下与蛋白质无明显作用,但在 静电作用解释,与传统考马斯亮蓝法相比,其灵敏度大大提高,蛋白质线性范围均在 ../。../】的研究也得到了类似结论。 .条件下研究了偶氮胂?与牛血清白蛋白产生的结合反 段建平【】等人在 应,据此建立了一种新的测定微量蛋白质的分光光度法。方法的线性范围在 /,桑德尔灵敏度为./,相关系数为.,相对标准偏差为 .%,该法可应用于人体液中白蛋白的测定。 .的.缓冲介质中,蛋白质与酸性品红结合使染 罗宗铭【】在 料的吸光度下降,并且吸光度的降低与蛋白质浓度成线性关系,该法已用于食品中蛋 白质含量的测定。 有机染料结合法测定蛋白质含量重现性好、灵敏度高,一定量的氨基酸和金属离 子对测定无干扰,是目前分析化学家重点研究的一个领域【。 .荧光光度法 ..荧光光度直接测定法 荧光法是测定蛋白质的一种常用光谱方法,蛋白质降解后的产物中存在有酪氨酸 和色氨酸,所以蛋白质本身能吸收.的紫外光而发生紫外光荧光。在蛋白质 的荧光光谱中呈现和两个荧光峰,前者与酪氨酸的荧光峰相符合,后者 与色氨酸的荧光峰相符合【。该方法可用于牛乳中蛋白质含量的测定,并且在测定条 件下,核酸、嘌呤和嘧啶都不发生荧光,因此对测定结果无干扰【.?。另外荧光分析 法还具有灵敏度高,选择性好,动态响应范围宽以及测定条件更接近生命体的生理环 境等特点,因此在分析检测中应用十分广泛。 ..共振瑞利散射法 , 光的散射是指一束光通过介质时,在入射光方向以外各方向观察到的一种光辐射 现象。它源于光磁波的电场振动而导致的分子中电子产生的受迫振动所形成的偶极振 子。根据电磁理论,振动着的偶极振子是一个二次波源,它向各个方向发射的电磁波 第一章绪论 就是散射波。光散射与介质的不均匀性有关,除了真空,其它所有介质都有一定程度 的不均匀性,从而产生散射光,由于介质中粒子大小不同,产生不同类的散射【斟】。 目前,在蛋白质的分析应用上,利用生色团在生物大分子上的聚集作用导致共振 瑞利散射显著增强,达到测定蛋白质、核酸等生物大分子的含量的目的。其中测定蛋 白质的法所使用的主要试剂有卟啉类试剂、三苯甲烷类染料、咕吨染料、偶氮染 料以及其它的有机试剂【。 ..荧光探针技术 与光度法相似,蛋白质与某些荧光染料结合形成荧光探针,能引起溶液荧光强度 的变化增敏或猝灭,并且在一定条件下,溶液的荧光强度与蛋白质浓度呈线性关 系,据此可用于蛋白质含量的测定。其原理是利用物质的光物理和光化学特性,在分 子量级上研究溶液中蛋白质高灵敏度的分析方法【】。 蛋白质分子荧光探针按荧光波长可分为发射在紫外可见区的荧光探针和近红外荧 光探针。紫外可见区的荧光探针如香豆素、荧光素、罗丹明类等因具有较高 的量子产 率而常被用于制备荧光底物‘‘ 】。紫外区在蛋白质的结构和功能研究中应用较少。因 为短波长激发光能量较大,易对被标记生物分子造成光损伤。而且当用紫外光激发 时,许多细胞及组织产生背景光吸收和自身荧光,会对探针荧光产生干扰。可见区的 荧光探针具有较高的摩尔吸光系数和荧光量子产率,结合光漂白后荧光恢复凡钟、 荧光偏振、荧光相关光谱、荧光共振能量转移等技术使得它们成为蛋 白质构象、结构性能以及蛋白质相互作用研究的极佳探针。在紫外可见区形成的荧光 探针染料可分为香豆素类、芘类、萘类、荧光素类、罗丹明类、判。。 在近红外沁姗光区,生物体自吸收或荧光强度很小,由于散射光强度与 波长的四次方成反比,近红外区的散射干扰大为减少,近红外荧光染料摩尔吸光系数 大,位移显著,热力学、光化学稳定性强,耐猝灭。近年来以菁类、噻嗪类为 代表的近红外荧光探针发展迅速,其优点为散射光弱、背景干扰低,低激发能量减小 了光漂白,使用近红外激光器提高了灵敏度,因而特别适合用于生物样品的测定【】。 目前,利用有机荧光染料与血清蛋白结合成荧光探针的技术研究非常广泛, 而有 机荧光染料作为重要精细化学品之~,以其独特的性能在越来越多的领域内起着重要 的作用,已越来越引起众多研究者的关注。随着合成及应用技术的不断改进,人们对 有机荧光化合物的认识和研究将不断深入,其应用范围也将不断扩大,有机荧光染料 荧光技术在食品蛋白质检测中的应用研究 的发展前景将越来越广副。但是传统的有机染料本身也存在许多缺陷,如荧光光谱 较宽、量子产率低、易漂白、化学稳定性不强、寿命短等。所以近些年许多化学家们 在寻找与合成新的荧光材料,以利于对和蛋白质等进行“标识”、“阅读”和“查 询”,目前研究最热的是有关量子点的合成与应用【。 量子点的合成及其在生物分子中的应用 .量子点的结构与发光原理 量子点 ,是一种主要由 如,,等、 .如,等组成的,能够光致发光的半导体纳米晶【。量子点是近年 来发展起来的一种优异的新型荧光纳米材料,在生物分析及医学诊断研究中得到了广 泛应用,并取得了一系列重要研究成果。 通常量子点的研究粒径范围为,电子和空穴被量子限域,连续能带变成具 有分子特性的分立能级结构,因而在受到光激发或电压后能产生荧光发射,具有独特 的光谱特性与光学稳定性【。 .量子点的性质 与传统的荧光染料相比较,量子点作为生物探针具有以下优势: 激发光谱宽且连续分布,发射光谱窄而对称 量子点激发波长的范围宽,可以被波长短于发射光的光一般以上激发,并 产生窄半波宽约而对称的发射光谱,从而避免了相邻探测通道的串扰‘。 光谱可调谐 量子点的发射波长可通过控制它的粒径大小来“调谐”,因而可获得多种可分辨的 颜色。且光谱为对称的高斯分布,半峰宽约为,位移较大,几种不同发射 波长的量子点可用于不同靶位点的同时监测,这样就可避免光谱之间的相互串扰,由 于激发光谱范围宽,采用单一激发光源就可同时激发不同的量子点,而普通的荧光染 料却需要多种不同的激发光源【。 稳定性好,抗漂白能力强 量子点具有良好的光化学稳定性,大概为罗丹明的倍,可以耐受更强的 第一章绪论 激发光和更长的光发射周期。荧光强度强,抗漂白能力强,在紫外光照射下, 荧光基 本没有衰减,可以经受反复多次激尉。 .量子点的制备 量子点的制备方法主要包括化学方法和物理方法,目前人们已经发明了两种完全 不同的制备半导体量子点的途径【】:一种是“自上而下”.的方法,另一种是 “自下而上”.的方法【。前一种途径因受到超微细加工工艺的限制应用得比 较少【,第二种途径中研究的较为广泛的制备技术主要有液相法【、沉淀法【】、胶 体化学法【、传统有机合成法【。、金属有机物化学气相沉积、分子束外 延、水热法【删等。 为了使用量子点更为方便,在分析检测中一般采用的是水溶法合成量子点。而且 在实际应用中,如作为荧光探针应用需要量子点的激发光谱宽,且连续分布,发射光 谱窄,光稳定性也要好。因此,在合成时有效地控制量子点的粒径、组成、结晶 度和表面修饰,对于改善其光学性质至关重要引。 宋冰【】等人以十八胺为溶剂,以醋酸镉和硫粉为原料水相合成量子 点,并研究硫粉的加入量对其光学性质的影响。研究表明,随着硫加入量的增 加, 量子点的粒径逐渐增大,反应中过量的硫能有效地填补硫空位,从而抑制了表面 态发光。而且的修饰也能有效地钝化表面态,减小表面态的发光强度。 汪乐余等【】人报道了功能性纳米荧光探针的合成与表征,同时研究了纳米粒 子的荧光衰变寿命,考察了该纳米荧光探针的吸收光谱和荧光发射光谱特性。还进一 步研究了不同蛋白质和核酸对该纳米荧光探针的吸收光谱和荧光发射光谱的影响。实 验表明,蛋白质的加入使的吸收和发射光谱强度均增强,而核酸的加入则使其吸 收和发射光谱强度均减弱。据此可将该纳米荧光探针应用于生物大分子的分析测定。 由于纳米颗粒较大的比表面积对其结构和光学性质产生很大的影响,因此可以在 量子点的壳层修饰上一层无机或有机物,来消除因表面缺陷而引起的表面上大量的无 辐射复合中心,从而提高量子点的荧光量子产率,并增强其发光稳定性【‘。 .量子点在生物分子中的应用 由于量子点具有普通荧光物质无法比拟的特殊光学特性,使其在分子生物学、细 荧光技术在食品蛋白质检测中的应用研究 。 胞生物学、基因组学、药物筛选、生物分子相互作用等研究中有极大的应用前景【 通常将合成的量子点作为荧光探针用于生物分子的标记】。陈丽霞等【】人采 用水相法合成量子点,利用巯基乙酸包裹的外端的羧基与牛血清白蛋白的 氨基,通过偶联剂的作用形成酰胺键,从而达到标记蛋白质的作用,并借助光谱仪器 研究标记前后体系的发射光谱和吸收光谱的变化以及荧光量子产率,研究与牛 血清白蛋白的结合机理。 利用量子点具有优异的光学性质,可以将其与蛋白质相结合,使量子点自身的荧 光强度发生增敏或猝灭作用,借助荧光光度计测定体系的荧光强度,根据荧光强度的 变化与蛋白质浓度呈正比的关系,从而达到测定样品中蛋白质含量的目的。近几年, 这种利用新型荧光试剂对蛋白质进行定量分析方法已有报道【”?,但是测定方法还 未成熟,也存在许多问题,需要进一步的改进发展。 第一章绪论 课题的提出 综上所述,在蛋白质分析测定中,荧光分析法具有设备简单、操作方便、灵敏度 高、准确度好、适用范围广等优点。而新型荧光试剂量子点具有传统有机染料无法比 拟的优异光学特性。因此,本文以荧光分析作为检测手段,在查阅大量文献的基础 上,通过系列实验,利用量子点与蛋白质相结合,研究测定样品中蛋白质含量的新方 法。主要研究内容如下: .利用水热法水相合成荧光试剂,与牛血清白蛋白结合后荧光强度的变 化,建立荧光法测定蛋白质含量的新方法。 .研究不同种表面活性剂对.体系荧光特性的影响,建立表面活性剂荧 光增敏测定蛋白质含量的新方法。 .研究一.羟基喹啉一反应体系的荧光特性,建立..羟基喹啉荧光法 测定蛋白质含量的新方法。 .研究和制备具有核壳层结构的/微粒及其与反应后体系的荧光特 性,建立/荧光光度法测定蛋白质的新方法。荧光技术在食品蛋白质检测中的应用研究 参考文献 【】大连轻工业学院,华南理工大学,郑州轻工业学院,等.食品分析【】.北京:中国轻工业出版 . 社,:.. 【】刘志皋.食品营养学.北京:中国轻工业出版社,:.. 【】张爱武.食品中蛋白质测定方法的研究进展【】.农产品加工?学刊,,:.. 【】路苹.蛋白质测定方法 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 【】.北京农学院学报, :.【】 . ,: , 【】蔡武成,袁厚积.生物物质常用化学分析法.北京:科学出版社, 【】张龙翔,张庭芳,李令嫒.生化实验方法和技术.北京:高等教育出版社, , ,: 【】. 【】 , . , ... :..【】 , , ..,:. ., 【 】 ,. ,:. . 【 】, .’,:..【 】 ,... .,: . 【】 , .,:.【 】妇,.. .., ,: 【】龚海霞,陈荣华,郭锡熔.蛋白质组技术及其在临床医学领域的运用【】.国外医学儿科学分 册, ,:. 】魏开华,杨松成,王红霞,等.转印到膜上的蛋白质的质谱分析【.质谱学报,,,:. 【】司英健.蛋白质组学研究的内容、方法及意义们.国外医学临床生物化学与检验学分册,; 第一章绪论 . : 【】王征,阮幼冰,官阳.肝细胞癌患者血清蛋白质组成分的双向凝胶电泳时间质谱分析【】.中华病理 学杂志,,:?. 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蛋白质是生命的物质基础,人体内的酸碱平衡、水平衡的维持,遗传信息的传 递,物质的代谢及运转都与蛋白质有关,故蛋白质是人体重要的营养物质,也是食品 中重要的营养指标。目前蛋白质含量的测定方法很多,主要为甲醛滴定法【】、分光光 度法【、共振光散射法【、电感耦合等离子体质谱间接法【等。荧光法因具有多种测定 参数、选择性好、灵敏度高而应用广泛,但是,由于蛋白质本身的内源荧光很 弱,多 采用有机染料结合法【】。近年来,量子点作为一种很有发展潜力的新型荧光生物 探针,其光学特性与传统有机染料相比有明显的优越性,因此在生命科学中有很好的 发展前景【酬。 最近,通过不同方法合成的量子点已有不少报道【,引,但利用合成的荧光量子点对 样品中蛋白质的测定报道较少。本实验以六偏磷酸钠为稳定剂,巯基乙酸为修饰剂水 相合成了荧光试剂硫化镉,研究表明,随着的加入,荧光强度增强,并 且与浓度在一定范围内有良好的线性关系。据此,建立了利用荧光特性测 定蛋白质含量的新方法。 实验部分 .试剂与仪器 牛血清白蛋白,国药集团化学试剂有限公司;.缓冲溶液取浓度均为 ./的硼酸、磷酸、醋酸混合溶液,用./的调至所需值;巯 基乙酸./,六偏磷酸钠./,./,./,所用试 剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。 .荧光光度计日本日立公司;.紫外.可见分光光度计 北京莱伯泰科仪器有限公司;.型酸度计上海大普仪器有限公司;型 恒温加热磁力搅拌器郑州长城科工贸有限公司。荧光技术在食品蛋白质检测 中的应用研究 .荧光微粒的制备 在的烧杯中,依次加入蒸馏水、、六偏磷酸钠、巯基 乙酸,用溶液调节值到.。在磁力搅拌器作用下,缓慢加入 ,搅拌,得到含一定粒径大小的微粒的溶液。 .实验方法 .的.缓冲溶液.、含 在容量瓶中,加入溶液.、 适量的溶液,蒸馏水稀释至刻度,摇匀,于?温度下反应,在激发波长 ,发射波长处进行荧光测定。 舢 砷? 结果与讨论 姗 舢 姗 . 合成条件的选择 舢 ? ..酸度对荧光强度的影响通过加入不同 的调节溶液值,考查酸度对合 图.酸度髋晌 . 成荧光强度的影响,示于图.。实验 表明,值为.时荧光强度达到最大,选择合成的值为.。 .. 合成中【与【比例的影响调节与。比例为:、:、:、 :、:、:、:,合成一系列的,测定荧光强度,实验表明,当 :与比例为:时,荧光强度最大,实验选择】:【厶:。 . ?体系的荧光光谱 固定激发光谱为,分别对、、以及不同量与作用后的体 系进行荧光扫描,结果示于图.。曲线为蛋白质的荧光光谱,曲线.分别为含不 同量时体系的荧光光谱,实验表明,在发射光谱处有最大吸收,而 本身在此波长处吸收较弱,随着加入不同量的,体系荧光强度显著增大,且 荧光峰逐渐蓝移。可以推测,与形成复合物,有效的钝化了表面,减 少了的表面缺陷,从而使荧光强度增强。引起发射峰位变化的原因可能是的 表面电荷数减少,从而降低了周围分子的定向极化率,使其斯托克斯位移减 小,所以 第二章硫化镉荧光光度法测定蛋白质含量的研究 发射光谱发生了蓝移【。 ,? 栅 ./ 鲫 . ...抛 ? . ...咖 . ...枷 . ...? ?枷硒 / . ...图.荧光光谱.? .酸度对体系荧光强度的影响 配制一系列不同值的.缓冲溶液,按照实验方法,测定不同酸度下的荧光 强度,以对不同酸度作图图?。实验表明,当体系的值在.~.范围 内,体系趋于稳定,且在值为.时达到最大,实验选择值为.的缓 冲溶液。 实验对.、柠檬酸.柠檬酸钠及.缓冲溶液进行选择,表明值 为.的?缓冲溶液使体系荧光强度增加显著。 通过进一步对缓冲溶液的用量进行选择,实验表明,缓冲溶液用量在.范 围内,体