【doc】尿素柱层析分离共轭亚油酸甲酯异构体的研究

【doc】尿素柱层析分离共轭亚油酸甲酯异构体的研究 尿素柱层析分离共轭亚油酸甲酯异构体的 研究 2011年第36卷第1期中国油脂9 油再旨化学 尿素柱层析分离共轭亚油酸甲酯异构体的研究 郝建秀,贾时宇,邓天异,侯相林 (1.中国科学院山西煤炭化学研究所,太原030001;2.中国科学院研究生院,北京 100039) 摘要:利用负载型尿素层析柱对共轭亚油酸甲酯异构体进行分离.考察了固定相中 甲醇残留量,尿 素硅胶质量比,固定相结晶温度,层析温度及洗脱剂种类对分离效果的影响.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:当固定相 中甲醇残留量为3%,5%,尿素硅胶质量比为l:1,固定相结晶温度0,8?,层析温 度0?,洗脱剂为 石油醚时,经过层析分离反10,顺12共轭亚油酸甲酯的含量从样品中的33.94%提 高到57.69%. 关键词:尿素柱层析;共轭亚油酸甲酯;异构体 中图分类号:TQ645;TQ028文献标志码:A文章编号:1003—7969(2011)0l一0009 —04 Separationofconjugatedmethyllinoleateisomer byureacolumnchromatography HAOJianxiu,JIAShiyu,DENGTiansheng,HOUXianglin (1.InstituteofCoalChemistry,ChineseAcademyofScience,Taiyuan030001,China: 2.GraduateUniversityoftheChineseAcademyofScience,Beijing100039,China) Abstract:Theconjugatedmethyllinoleateisomerwasseparatedbyureacolumnchromatogr aphy,andthe factorsinfluencingtheseparationeffectsofconjugatedmethyllinoleateisomerwereinvestig ated.There— sultsshowedthatthecontentoftlO,c12conjugatedmethyllinoleatecouldbeimprovedfrom3 3.94%to 57.69%atthefollowedconditions:methanolresidueinfixedphase3%一5%,massratioofureatosili— cagel1:1,crystallizationtemperature0—8qC,operationtemperature0,eluentpetroleum. Keywords:ureacolumnchromatography;conjugatedmethyllinoleate;isomer 共轭亚油酸(CLA)是亚油酸共轭化的产物,亚 油酸两个顺式双键中的一个在共轭过程中发生位 收稿日期:2010—04—29;修回日期:2010—09—30 作者简介:郝建秀(1985),女,硕士研究生,主要从事天然产 物分离方面的研究工作(E—mail)haojianxiu@yahoo.cn. 通信作者:侯相林,研究员(E—mail)houxl@sxicc.ac.en. 【11JFUH,YANGL,YUANH,eta1.Assessmentoftrans fattyacidscontentinpopularwestern—styleproductsin China【JI.JFoodSci,2008,73(8):383—391. [12]姜元荣,夏树华,张余权.反式脂肪酸的危害及相关国 际法规[C]//营养与慢性病——中国营养学会第七届 理事会青年工作委员会第一次学术交流会议论文集. 北京:中国营养学会青年工作委员会,2010:150—157. [13]王冠.反式脂肪酸问题的由来与对策[J].上海计量 测试,2007,34(1):27—29. [14]贺咏梅,朱志鑫,安小宁,等.食品中反式脂肪酸的分 析方法[J].食品科技,2008,33(11):282—286. [15]朱新荣,胡筱波,潘思轶.食品反式脂肪酸检测方法 移,同时顺式双键转化为更稳定的反式双键.共轭 亚油酸主要是顺9,反11共轭亚油酸(c9,tl1一 CLA)和反10,顺12共轭亚油酸(tlO,c12一CLA)的 混合物.这两种异构体所具有的生理功能有很 大差异J,为了更好发挥其各自的优异功能,有必 要将两种异构体进行分离. 研究进展[J].粮食与油脂,2008(5):34—38. [16]宋志华,单良,王兴国.反式脂肪酸分析方法的研究进 展[J].粮油加工,2006(11):51—55. 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[19]谢明勇,谢建华,杨美艳,等.反式脂肪酸研究进展 [J].中国食品,2010,10(4):14—26. 10CHINA0ILSANDFATS201lV01.36No.1 目前有关将亚油酸从其他脂肪酸中纯化的方 法报道较多,而针对共轭亚油酸异构体直接分离 的方法相对较少,已经报道的较好的方法有以下 几种:尿素包合法,该法虽然成本较低,但存 在收率低,污染严重等问题;无溶剂尿素包合+超 I临界CO萃取技术分离两种异构体,该法工艺复 杂,成本高;冷冻结晶分离法,该方法所需操作温 度较低,耗能较大,不易实现;也有利用假丝酵母 脂肪酶两步选择性酯化和分子蒸馏相结合的方 法,该方法虽然分离效果很好,但是成本高,收率 低,难于产业化. 尿素柱层析是结合柱色谱分离与尿素包合法的 优势,用于纯化和分离不饱和脂肪酸的一种新方 法.本实验采用尿素柱层析法对共轭亚油酸甲 酯的两种主要异构体进行分离,考察了固定相中甲 醇残留量,尿素硅胶质量比,固定相结晶温度,层析 温度及洗脱剂种类对分离效果的影响. 1材料与方法 1.1材料,试剂 无水甲醇,石油醚,尿素,无水硫酸镁,浓硫酸均 为分析纯;柱层析硅胶;共轭亚油酸甲酯样品,由中 国科学院新疆理化技术研究所提供. 1.2设备,仪器 层析柱(2cm×60cm),78—1磁力加热搅拌 器,HH一2电子恒温水浴锅,RE一52旋转蒸发器, 真空干燥箱,FA一1004电子天平,HXSPGC一950气 相色谱仪. 1.3实验方法 1.3.1柱层析固定相的制备 将一定量尿素溶于适量无水甲醇中,加入一定 量柱层析硅胶(60,80目),在一定温度下搅拌一段 时间后,自然冷却至室温,置于0,8?下结晶一定 时间,抽滤,于真空烘箱中脱除甲醇,待用. 1.3.2装柱 称取60g柱层析固定相放入石油醚中浸泡,搅 动除去其中的微小气泡;待气泡驱除完全,湿法装入 层析柱中,制成负载型尿素层析柱. 1.3.3共轭亚油酸甲酯的分离 取一定量的共轭亚油酸甲酯,加入到尿素层析 1.2 柱上层,以石油醚为洗脱剂,控制流速为0.7,mL/min进行洗脱,每10mL收集1个洗脱份,对洗 脱份进行色谱分析,确定共轭亚油酸甲酯各异构体 含量. 1.3.4共轭亚油酸甲酯异构体的检测 色谱条件:HP一5色谱柱(30mX0.25lTll2qx0.25 I..tm);初始柱温200?,保持2.5min,以5c【=/rain升 温至230?;氢火焰检测器,载气为N:,汽化室和检 测器温度均为280?;TL9900色谱工作站,采用峰 面积归一化法计算共轭亚油酸甲酯相对含量. 2结果与讨论' 2.1共轭亚油酸甲酯样品的组成 共轭亚油酸甲酯样品色谱图如图1所示.A1 ,A3 为油酸甲酯,A2为顺9,反11共轭亚油酸甲酯为反l0,顺12共轭亚油酸甲酯,A4+A5为全反式 共轭亚油酸甲酯. >6 4 迎垦2 0 时f司/min 图1共轭亚油酸甲酯样品气相色谱图 2.2甲醇残留量对分离效果的影响 选取60,80目硅胶,控制尿素硅胶质量比为 1:1,以无水甲醇为结晶溶剂,在0—8?下结晶制备 负载型尿素固定相.在脱除甲醇过程中,控制脱除 时间及真空度,从而得到不同甲醇残留量的柱层析 固定相.共轭亚油酸甲酯进样量为1mL,用石油醚 对其进行洗脱,流速为0.7,1.2mL/min,层析温度 为0,8qC,实验结果如图2,图3所示. 6O 50 4O 硎30 如20 l0 0 ???磊卜 ?顺9,反1I共轭亚油酸甲酯 +反1odr[~l2共轭亚油酸甲酯 十全反式共轭亚油酸甲酯 图2洗脱过程中共轭亚油酸各组分含量的变化 固定相中残留的甲醇可以提供尿素与脂肪酸发 生包合的微环境,使分子间有更多的机会碰撞,还可 维持所形成包合物新构型的稳定性. 从图2可以看出,洗脱初期油酸甲酯,顺9,反 11共轭亚油酸甲酯以及全反式共轭亚油酸甲酯都 会被大量包合而使得洗脱液中三者含量下降.随着 洗脱的进行,流动相的不断冲洗使得甲醇残留量逐 渐降低,较低的甲醇残留量不能维持包合物的稳定 性,不断加人的流动相也会冲击破坏包合物,因而原 2011年第36卷第1期中国油脂 本已被包合的油酸甲酯及顺9,反11共轭亚油酸甲 酯又被洗脱下来,洗脱液中含量上升,全反式共轭亚 油酸甲酯包合物由于稳定性较高而直到洗脱末期才 被洗脱下来,洗脱液中含量有所上升. _--油酸甲酯 ?顺9,反11共轭亚油酸甲酯 - 反10,顺12共轭亚油酸甲酯 \ 加 图3甲醇残留量对共轭亚油酸甲酯各组分含量变化的影响 如图3所示,当甲醇残留量低于2.9%时,较低 的甲醇残留量不足以维持尿素包合顺9,反11共轭 亚油酸甲酯的微环境,顺9,反11共轭亚油酸甲酯 随流动相进入洗脱液中,导致洗脱液中反l0,顺12 共轭亚油酸甲酯的相对含量较低,不足53%;当甲 醇残留量为3%,5%时,反10,顺12共轭亚油酸甲 酯的相对含量可以达到56%,说明此时固定相中残 留的甲醇提供了尿素包合顺9,反11共轭亚油酸 甲酯的最佳微环境;而当甲醇残留量高于6.2% 时,可能由于甲醇与石油醚的互溶性不好,固定相 中过多的甲醇在层析过程中阻碍了石油醚相中脂 肪酸甲酯与尿素的充分接触,而使尿素对顺9,反 11共轭亚油酸甲酯的包合作用减弱,顺9,反11 共轭亚油酸甲酯随流动相进入洗脱液中,洗脱液 中反l0,顺12共轭亚油酸甲酯的相对含量呈下降 趋势. 2.3尿素硅胶质量比对分离效果的影响 选取60,80目硅胶,按照不同尿素硅胶质量 比,以无水甲醇为结晶溶剂,在0,8?下结晶制备 负载型尿素固定相,控制柱层析固定相中甲醇残留 量在3%,5%.共轭亚油酸甲酯进样量为1mL,用 石油醚对其进行洗脱,流速为0.7,1.2mL/min,层 析温度为0,8cE,实验结果如图4所示.由图4可 以看出,尿素比例会影响分离效果,随着尿素比例增 加两种异构体间含量差距减小,分离效果变差;纯尿 素的分离效果最差,两种异构体含量几乎和共轭亚 油酸甲酯样品含量相当.当尿素硅胶质量比为1:1 时,分离效果最好,反10,顺l2共轭亚油酸甲酯的 相对含量可以达到53%.尿素负载量太大,会造成 尿素的堆积,覆盖等现象,降低尿素的利用率,而加 入适量的硅胶,可以提供大的比表面积,使得尿素与 脂肪酸甲酯有更多的接触机会,从而包合更多的油 酸甲酯和顺9,反11共轭亚油酸甲酯. 60 5() 4o 登30 20 10 0 图4尿素硅胶质量比对分离效果的影响 2.4结晶温度及层析温度对分离效果的影响 选取60,80目硅胶,控制尿素硅胶质量比为 1:1,以无水甲醇为结晶溶剂,在不同温度下结晶制 备负载型尿素固定相,控制柱层析固定相中甲醇残 留量在3%,5%内.共轭亚油酸甲酯进样量为1 mL,用石油醚对其进行洗脱,流速为0.7,1.2mL/ rain,层析温度为0,8qC,实验结果如图5所示.在 上述条件下,控制结晶温度在0,8?内,在不同温 度下进行层析,得到实验结果如图6所示. 60 5O 4() 3f) 2f) 10 0 I5()8 结晶温度/ 图5结晶温度对分离效果的影响 6O 5() 4() 冀30 20 】() () a顺9眨1l共辄,油陵甲酯 -反lO顺12共轭,匝油酸rr『酯 083O 层析温度/1 图6层析温度对分离效果的影晌 图5表明,用0?和8cC结晶的固定相进行柱层 析时,分离效果好于一15?结晶的固定相,反l0,顺 12共轭亚油酸甲酯的含量均可达到53%.图6表 明,低温下层析的分离效果较好,在0cC下层析时,顺 9,反11共轭亚油酸甲酯含量下降至21%,反l0,顺 12CHINAOILSANDFATS 12共轭亚油酸甲酯的含量可以达到57.69%.而在 较高温度下,固定相对顺9,反11共轭亚油酸甲酯几 乎没有包合作用. 据报道J,碳原子数相同而双键数不同的硬脂 酸,油酸和亚油酸,25?尿素包合物的稳定常数分 别为5000,480和53.可以看出,亚油酸的尿素包 合物在25?时稳定性较低,和油酸的几乎相差1个 数量级,30?的稳定性将会更低.因此,以高温下 结晶制备的固定相进行柱层析或是在高温下进行层 析分离,都不利于形成顺9,反11共轭亚油酸甲酯 的尿素包合物.亚油酸只有在低温下才可形成稳定 包合物,但由于共轭亚油酸甲酯样品中油酸甲酯含 量较高,温度降低时,油酸甲酯被尿素包合的几率增 大,大量尿素孔道被油酸甲酯占据,尿素对于顺9, 反11共轭亚油酸甲酯的包合几率降低,使得分离效 果较差. 2.5洗脱剂种类对分离效果的影向 选取60,80目硅胶,控制尿素硅胶质量比为 1:1,以无水甲醇为结晶溶剂,在0—8?下结晶制备 负载型尿素固定相,控制柱层析固定相中甲醇残留 量在3%,5%内.共轭亚油酸甲酯进样量为1mL, 用不同洗脱剂进行洗脱,流速为0.7,1.2mL/min, 层析温度为0—8?,实验结果如图7所示. 6O 5O 4o 30 20 10 0 顺9.反11共轭汕酸甲酯 反J0,顺l2共轭啦油酸甲醋 石油醚乙酸乙酯石油醚+甲醇 图7洗脱剂种类对分离效果的影响 由图7可以看出,石油醚作洗脱剂的分离效果 较好.乙酸乙酯作洗脱剂有一定的分离效果,可以 使反10,顺l2共轭亚油酸甲酯的含量达到53%,但 是实验中发现其对油酸甲酯的包合作用较弱,很快 就会被洗脱,故不宜采用. 在洗脱过程中,固定相中残留的甲醇会随洗脱 而不断减少,以致不能维持已形成的尿素包合物的 稳定性,因此以石油醚与甲醇的混合液作洗脱剂进 行洗脱.从图7可以看出,用混合液进行洗脱,洗脱 液中反10,顺l2共轭亚油酸甲酯的含量并没有增 加,可能是洗脱剂中的甲醇不能替代固定相中的甲 醇来维持包合的微环境,故以石油醚与甲醇混合液 为洗脱剂不能提高分离效果. 3结论 在尿素柱层析分离共轭亚油酸甲酯异构体过程 中,固定相中甲醇残留量,尿素硅胶质量比,固定相 结晶温度,层析温度及洗脱剂种类都会对分离效果 产生一定影响.固定相中残留适宜的甲醇可以提供 包合的微环境,还可维持包合物的稳定性;适宜的尿 素硅胶质量比可以使尿素得到充分利用;而固定相 结晶温度与层析温度也应在适宜范围内,才能保证 包合物的稳定性,并降低共轭亚油酸甲酯样品中油 酸甲酯对两种异构体分离的干扰. 通过条件优化,得到尿素柱层析法分离共轭亚 油酸甲酯异构体的最佳条件为:甲醇残留量3%一 5%,尿素硅胶质量比1:1,固定相结晶温度0,8oC, 层析温度0oC,以石油醚为洗脱剂,无水甲醇为负载 溶剂,共轭亚油酸甲酯进样量1mL,洗脱剂流速 0.7,1.2mL/min.在最佳条件下,反10,顺l2共轭 亚油酸甲酯含量由33.94%提高到57.69%;此时, 顺9,反11共轭亚油酸甲酯含量为2l%,两种异构 体含量之比大于2:1.尿素柱层析可以实现对共轭亚油酸甲酯异构体的有效分离,但分离效率有待进 一 步提高. 参考文献: [1]刘晓华,曹郁生,陈燕.共轭亚油酸分析方法的研究进展 [J].中国油脂,2004,29(7):48—50. 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