细胞培养的个人总结(来自emuch)

细胞培养的个人总结(来自emuch) 总结---细胞培养 一(基本理论概论 原代培养: 也叫初代培养，指直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养。 传代培养:将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养。 细胞系:原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。(如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系;已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。) 细胞株:通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。 培养类型:细胞培养，组织培养，器官培养。 细胞生长的方式:贴附生长，悬浮生长 培养细胞的形态(形态不一定，环境改变形态可能改变):成纤维性型细胞，上皮型细胞(单层膜样生长)，游走性细胞(游散生长，常有伪足跟突起) 二(培养过程及要点(切记无菌操作) (一)工作环境的处理 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % 酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45? 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。吸管口切勿碰到容器瓶口 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒 感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目: CO2 钢瓶之CO2 压力 。CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 (二)试验用玻璃塑料用品清洗及其消毒灭菌 清洗: (1) 玻璃器皿的清洗(酸液由重铬酸钾，浓硫酸，蒸馏水配置) 浸泡—刷洗—浸酸—冲洗 (2) 胶塞的清洗 刚买回的常含滑石粉等杂质，先用自来水冲洗后再按常规方法处理。2%NaoH或洗衣粉煮沸10-20分钟---1%稀Hcl浸泡30分钟或蒸馏水冲洗后再煮沸10-20分钟—晾干备用 (3)塑料制品的清洗 2%NaoH浸泡过夜—自来水冲洗--5%稀Hcl浸泡30分钟—自来水和蒸馏水冲干备用。 - 1 - 消毒: (1)物理消毒法(紫外线，湿热，烘干，过滤)含碳酸氢钠溶液要过滤，高压会分解，培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体:121?, 15 磅, 20 分钟;布类、玻璃制品、金属器械等物品:先121?, 15 磅, 20 分钟，然后在烘箱中烘干;玻璃瓶:干热灭菌170?, 4 小时。 (2)化学消毒法(70%酒精，千分之一的新洁尔灭) (3)抗生素:培养用液灭菌或预防培养物污染 (三)培养物的污染及控制 污染种类: (1)细菌污染:培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 (2)真菌污染:培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。 (3) 支原体污染:培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。 (4) 病毒污染:尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 。 (5)非同种细胞污染: 污染来源: (1) 不洁的动物组织标本:正常情况下组织来源是不带菌的，但由于取材不小心也会染菌，也有可能动物体本身带菌，不用浓的抗生素清洗，会导致培养污染。 (2) 空气:如果无菌操作区与外界隔离不严，空气中会带菌。其次，超净台使用过久，滤板堵塞也会污染。工作时不带口罩外界气流过强会污染。再者，南方空气潮湿，空气中容易带菌，操作不注意会染菌。 (3)清洗消毒:培养用液除菌不彻底，培养器具清洗消毒不彻底。 (4) 操作不过关 1、实验前未检查器械和液体是否污染 2、操作者未带口罩帽子，呼出空气中含细菌和支原体 3、培养瓶未用75%酒精擦拭和灼烧 4、 操作不当吸管或培养用品接触到污染物，如皮肤，瓶壁 5、 操作者说话大声，来回走动，扬起灰尘。 预防和控制 污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。细胞培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之;在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。 预防 1、 培养用液、器皿要清洗消毒，防止污染。无菌室无菌器械要定期消毒 2、操作者要细心稳重。进入无菌是前要用肥皂洗手，穿好隔离衣帽口罩，检查物品无污染。进入室内要少说话走动打喷嚏要向背后，用酒精棉球擦手，瓶口，并灼烧瓶口。用酒精擦台面，在超净台中央操作，切勿一根吸管用到底，要更换吸管，操作时吸管不能碰到培养瓶口，防止污染，试验完成要做好标记。临走带走物品，用酒精擦台面。不可直接进行下一个试验。 3、防止细胞交叉污染，及早留种保持，防止污染 - 2 - 控制 (一)、使用抗生素:一般对细菌有用。预防用药比污染后用药好，联合用药比单独用药好。一般用青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml，清除用药是常量的5-10倍采用5,10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24,48h，再换入常规培养物，有时可能奏效。抗生素常用量和效果如果下: 抗生素 细菌 真菌 支原体 常用量 青霉素 G， 100u/ml 链霉素 G, 100ug/ml 庆大霉素 G+/G- 200ug/ml 四环素 G+/G- 10ug/ml 卡那霉素 G+/G- 50ug/ml 两性霉素B + 2ug/ml 制霉菌素 + 25ug/ml (二)、加温除菌:根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的细胞至于41摄氏度作用5,10h(最长可达18h)，以杀灭支原体。但41摄氏度对细胞本身也有较大影响，故在处理前应先进行预实验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的最佳处理时间。 (三)、使用支原体特异性血清:抗血清结合支原体。一般支原体污染无太大价值均弃掉。 (四)、其他方法:动物体内接种除菌，加巨噬细胞。 动物体内接种:受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培养。 与巨噬细胞共培养:巨噬细胞在体外可存活7,10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用这一特点，可将少量的污染细胞与足够量的巨噬细胞共培养，从而消除污染。 (四)细胞培养基及常用液体 常用的有TC199,MEM,RPMI-1640,DMEM 细胞培养的基本条件:无菌培养环境，合适的培养基，优质的血清，稳定的温度，合适的气体环境(O2，CO2。5%的CO2对应培养液的NaHCO3为1.97g/L, 10%的CO2对应培养液的NaHCO3为3.95g/L)。 培养基的种类及基本成分(来源分天然培养基，合成培养基。状态分干粉培养基，液体培养基) 一般用合成培养基加血清(氨基酸，碳水化合物，无机盐，缓冲系统PH7.2-7.4，氨基酸及其他辅助因子(2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol，2-Me)的作用一个重要作用是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽，能诱导细胞的增殖)) 完整的培养基组成:基础培养基80-95%,血清5-20%,碳酸氢钠2g/l，青霉素和链霉素。 保存 1、 未加血清的液体培养基一般4度保存12个月，使用时37度预热，液体培养基中L-谷氨酰胺会慢慢分解，长时间后要添加原来量 2、 血清:一般4度只能保存一个月，可-20----70度保存，解冻时不可直接拿到室温，须在4度冰箱解冻一天。无需除菌 常用液体 1、 PBS,DPBS,Hanks平衡盐溶液，D-Hanks平衡盐溶液 2、常用的消化液EDTA4Na和胰蛋白酶液(用无Ca和Mg的D-Hanks配成0.125%或0.25%,过滤除菌，使用时加入1:1的EDTA4Na，用碳酸氢钠调PH7.4 ，-20保存。加入血清可终止其反应) - 3 - 3、常用的缓冲液碳酸氢钠和HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸) (五)细胞培养 传代培养 1、悬浮生长细胞传代 离心法传代:1000转/分离心弃上清，沉淀加培养液混匀传代 直接传代法:悬浮细胞沉淀在瓶壁时将上清去除1/2-2/3培养液，然后用吸管吹打为悬液传代 2、半悬浮生长细胞传代 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代 3、贴壁生长细胞传代 酶消化法传代(1-2ml0.25%酶液，静置2-10分钟后吸除，加培养液吸取1/10-1/40接种于新瓶，加新培养液培养) 大规模细胞培养 1、固定化细胞大规模培养 培养方式。除了海藻酸钙包埋法外,其他固定化基质都是多孔型的,能允许大分子物质自由出入,因此可实现蛋白质产物的连续生产。在凝胶珠和微囊中可使蛋白产物积聚到很高的浓度,给后续的分离纯化处理带来方便,并大大降低了生产成本。 2、细胞的灌注培养方法 在灌注培养中,细胞保留在反应器系统中,收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分,并可带走代谢产物,同时,细胞保留在反应器系统中,可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比,灌注培养的产率可以提高一个数量级,并可大大降低劳动力消耗。 特殊培养法 1)二倍体细胞培养法 二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为: 1. 吸除旧培养液注入另瓶中。 2. 用温BSS冲洗1次。 3. 用0.25%温胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可;作用1~5分钟。 4. 待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失，可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液(新旧培养液按2:1新旧混合)。 5. 轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。 6. 按一分为二比例接种培养。 2) 支持物培养法 加支持物培养法与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。 1. 支持物制备:如用特氟隆薄膜，无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可;通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态，以便装入培养瓶中，然后按如下顺序处理:自来水浸泡24小时—96%酒精30,60 min—蒸馏水浸泡30,60 min—用干净软布擦拭干净—装入培养皿中—高压或干热灭菌备用。 2. 培养法:初代消化培养、初代组织块培养、传代培养等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后，可在任何时间取出支持物，做各种观察或实验。 3) 细胞分离(克隆)培养 多孔塑料培养板单细胞克隆法: 1. 消化:取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。 - 4 - 2. 低密度细胞悬液的制备:做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，最适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。 3. 接种:先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养。 4. 标记:培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底后，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。 5. 分离扩大培养:培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2次，继加胰蛋白酶少许，加入量已能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增殖，使之形成新的细胞群后，即转用常规培养法培养。 必须保证分离出来的细胞确为一个而不是两个或更多。因此必须提高克隆形成率才易克隆成功，为此常采取以下一些措施: 使用适应性培养基或条件培养基(Conditional Medium)。制备方法: 1. 培养同源细胞(未克隆前时的同一细胞)至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液。 2. 离心:3000~4000/分离心10分钟，吸取上清液。 3. 滤过:再经直径0.22μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用;用时取1分适应培养基+2分培养基混合使用。 使用饲细胞(Feeder Cells)。制备方法: 1. 取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按105细胞/毫升重新接种培养。 2. 在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素C，按2μg/106细胞的量加入到培养瓶中过夜;或用射线单次照射，剂量30,50戈瑞。 3. 细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×104(104细胞/cm2)接种入新培养基中。 4. 48小时后，即可用于细胞克隆之用。 底物特殊处理: 1. 制备浓度为1 mg/ml的多聚右旋赖氨酸的水溶液，用以湿润培养瓶底。 2. 倒出多聚赖氨酸溶液，用5ml PBS冲洗一次后，可立即使用，或存数周内使用。 4)球体细胞培养 1. 琼脂铺底的培养瓶:30ml无菌培养瓶，每瓶中加5 ml 2%琼脂培养基，冷却，形成平坦底层后备用。 2. 取生长状态良好已连接成片的细胞，用弯头吸管伸入瓶内，把细胞纵横割划成若干小区后，倒出培养液。 3. 加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置显微镜下边消化边观察，当细胞小区边缘微卷起后便立即终止消化，倒出消化液，用Hanks轻轻漂洗一次，加入新培养液3~5 ml，用吸管把已松动的细胞片吸打下来，分装入1~3个含2%琼脂培养基底层的培养瓶中，置温箱继续培养，数日后便可生长成细胞球体。 - 5 - 4. 换液:培养1~2日后，如需换液，微倾斜培养瓶，令培养液集于培养瓶底角，停片刻，待球体细胞下沉后，吸除部分培养液，再补充新培养液。 5)微载体细胞培养法 1. 微载体选择:先用利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的吸着率和计算细胞数，以得到最大量细胞为佳。 2. 水化:称一定量的微载体放入容器中，按每克微载体加50,100ml的比例，加入无Ca2，和Mg2，的磷酸缓冲液(PBS)，室温下放置应不少于3小时，并不时轻微搅动，然后再用新鲜PBS洗一次。 3. 消毒:可采用高压蒸汽消毒，也可在水化后用70,酒精浸泡消毒，再用无菌的PBS漂洗一二次。 4. 传代培养:在连续进行微载体培养时，可以不必把细胞从微载体分离下来，可将带有细胞的微载体和新的微载体混合进行培养细胞能移动到新载体上。如果进行其它实验或需要分离细胞进行传代培养时，和常规培养相同，先用EDTA，胰蛋白酶溶液作用使细胞脱离微载体 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面。细胞脱离微载体后，可用自然沉降法，即在室温下静止5分钟，微载体将先自沉在底部，细胞大部分仍在上清中，然后离心上清即可得到细胞。如果需要分离程度较高时，需用孔径为100微米的尼龙网或不锈钢网过滤后，再离心滤过液，就可得到较纯净的细胞。 6)悬浮培养法 悬浮培养是使帖壁细胞呈悬浮状态生长。如所需培养的细胞本身属悬浮生长型，则无须做任何处理;在传代时先做离心处理去除旧培养液，添加新培养液即可。但在培养帖附型细胞时，必须进行干扰细胞不能帖附，方法有二: 1(用大培养瓶增加含有铁芯的无毒的聚苯乙烯棒，在培养中进行电磁搅拌，使细胞不能帖壁而成悬浮培养。 2(用试管培养细胞，把试管置入带有旋转鼓的特制温箱中进行培养，旋转鼓不停徐缓转动，干扰细胞帖壁遂成悬浮培养。 细胞计数:细胞数(/ml)=(四格的细胞总数)/4×104×n (n为稀释倍数) 步骤: 1、 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于 1.5ml 小离心管中。 2、取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 3、计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue 等体积混合)，最后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 4、大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml ，每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 (1)HE(苏木精 — 伊红染色法)染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 (2)丫啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 (3)台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的 - 6 - 完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 (4)透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180,200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体; 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。 3、流式细胞仪定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 应用价值 流式细胞仪检测具有以下特点: 1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2)、可以做许多相关性分析 3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期 (1)检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。 利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。 (2)DNA片断原位标记法 凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3•的羟基(,OH)端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。 DNA片段原位标记法有二种: 1、原位缺口转移(in situ nick-translation,ISNT)技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷 - 7 - 酸连接到断裂DNA的3•,OH端 2、原位缺口末端标记技术(in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3•-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。 (3)检测细胞膜成分变化的Annexin V 联合PI法 原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的Annexin V，将Annexin V标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC)，同时结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。 结果判断:正常活细胞Annexin V 、PI均低染;凋亡细胞Annexin V高染、PI低染;坏死细胞Annexin V/PI均高染。 应用价值:细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。 方法及步骤 A. 直接标记抗体(FITC标记抗体): (1) 收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4?以上冷PBS洗一次。 (2) 用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2ml PBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。 (3) 用1ml含5% 人血清的 PBS 重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS ,避光冰上放置30min,离心弃上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待测即可。 (4) 用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。 B. 未标记抗体间接免疫荧光标记法: (1)收集2×106个细胞，用冷的PBS 2ml 洗涤细胞一次，800rpm离心5min。 (2)用2ml 4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min;2ml PBS重悬细胞，800rpm离心5min; (3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。 (4)加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS 重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。 (5)加入荧光标记(FITC)标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。 (6)加入0.5ml 1%多聚甲醛重悬细胞;固定待测。 (7)流式细胞仪检测荧光值,每管计数10 000个细胞。 C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品(PI染色)的制备: (1)待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。 (2)用4?预冷的70%冷乙醇固定，4?保存 ，至少固定18小时。 (3)调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1 - 8 - 毫升PI染液中，37?孵育30分钟即可进行流式分析。 (4)PI染液终浓度为50微克/毫升，RNase A终浓度为20微克/毫升。 培养细胞染色体显示法 (1) 传代培养细胞染色体显示法 培养细胞—加秋水仙素—采集分裂细胞—离心—低渗处理—预固定—固定—重复固定—制片—染色和封片 1(培养细胞:取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的[color=blue]、80,,90,汇合单层培养细胞。 2(加秋水仙素:使用最终浓度为0.02,0.8微克/毫升营养液，温箱继续培养6,10小时; 或用低温封闭法:把培养细胞置于4?条件下6,12小时后，再于37?温箱继续培养6,10小时处理(加秋水仙素)。 3(采集分裂细胞:可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使90,的中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。 4(离心:收集培养液，1000转/分钟离心5,10分钟。 5(低渗处理:吸除上清液、加入预温至37?的0.075M KCl溶液，在温箱中静置20,30分钟。 6(预固定:向悬液中加新鲜1:3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。 7(固定:离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂5,10ml;加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置15,20分钟。 8(重复7，末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5, 1ml。 9(制片:用滴片法制片，按如下步骤:彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2,3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。 10( 染色和封片:一般常用Giemsa染色:取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。 (2)人末梢血微量全血培养染色体显示法 1(培养液准备:取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养液(pH 7.2)，内含:1640培养液(含10,,15,小牛血清)，PHA 0.1ml，青霉素100单位和链霉素100微克/毫升 培养液 2(抽血针管准备:取2,5ml针管一支，在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素(100 U/ml BBS)少许湿润针管，如动作迅速不用肝素亦可。 3(采血:用棉签75,酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血1,2ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4,0.5ml，如系外出采血，安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作，但动作要迅速，以减少污染;在采血量不多或不应抽血的情况下，亦可在耳垂、手指肚(无名指)用刺血针采血。 4(培养和加秋水仙素:37?温箱中培养到60,72小时之间，此时细胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最终浓度0.02,0.08微克/毫升营养液，再培养4,6小时。 5(低渗:1000转/分钟离心10分钟，吸除上清液，加入预温过的0.075M KCl溶液10ml， - 9 - 置温箱中低渗处理15,20分钟。 6(其余步骤与处理传代细胞法相同。 (3)羊水细胞培养 1.抽取羊水:无菌抽取羊水10-20ml，立即注入无菌离心管 2.离心分离:1000转/分离心10分钟，弃去上清，留0.5ml. 3.培养:加培养液4ml(含小牛血清1ml)，用NaHCO3调PH至6.8，置37度培养，在温箱培养7-10天，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长;加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液，作用10-12小时。 4.其余步骤与传代细胞染色体制备方法相同。 一般染色体制片程序 1、取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。 2、将培养基换成10ml DMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基，处理1~2小时。 3、将细胞培养液倒掉，马上加入3~4ml 0.1%胰蛋白酶，并立即摇晃0.5~1min。当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后，马上加入终止液终止消化，并将分裂相细胞收集在一个15ml的离心管中，并在1200r/min离心4min。 4、将上清液倒掉，剩余50ul左右的液在管中，并轻微震动，使细胞沉淀重新悬浮。 5、加入10ml的低渗液(0.075M KCL)，第一毫升要逐滴加入，并边加边摇晃。 6、37?水浴中低渗30min。 7、 再加入1ml冰冷的固定液(甲醇:乙酸=3:1 的混合液)，并马上摇匀，离心，1000r/min、10min。 8、同步骤4。 9、 加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，边加边摇晃。 10、室温下固定30min，然后离心，1000r/min、10min。 11、同步骤4。 12、加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，边加边摇晃。 13、室温下固定15min，然后离心，1000r/min、10min。 14、重复步骤11~13一次。 15、将离心后的上清液倒掉，并加入50~100ul的新鲜固定液重悬细胞。 16、 滴片(玻片要求是湿冷的干净的，滴片高度要大于30cm。玻片倾斜角度15~30度左右) 17、 镜检。 (六)细胞的冷冻保存与复苏(慢冻速溶) • 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化:细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 • 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶;相反(结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 • 在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。 • 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 细胞冻存方法 (1)、冷冻前一日提前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 (2)、配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为 5-10,， - 10 - 混合均匀，置于室温下待用。(预先配制冻存液: 含20%血清培养基，10% DMSO加基础培养基 ) (3)、按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数; (4)、将细胞悬液以800,1000r/min离心5min，去上清夜; (5)、向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106,1×107个/ml; (6)、按每管1,1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖; (7)、再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4? 40 分钟? -20 oC 30 分钟? -80 oC 16,18 小时(或隔夜) ? 液氮槽vapor phase 长期储存。 注意点: (1) 细胞在-20度冰箱不能超过1h，以免冰晶过大破坏细胞，可跳过-20直接到-80，这样细胞活率低点。 (2) DMSO稀释时会放出大量热，不可直接加到细胞液中要提前配制。 (3) DMSO必须时细胞培养级别的，新买的本身是无菌的，第一次开瓶后立即少量分装于无菌瓶中，4度保存，避免反复冻容产生有毒物质。 细胞复苏(要点动作要快，轻) (1)、调配37度,40度的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至37度,40度; (2)、从液氮中取出冻存管，立即投入370C,400C 温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解; (3)、将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀; (4)、将细胞悬液经800,1000r/min(1500)离心5min，弃上清夜; (5)、向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。 注意点: (1)注意安全，以防冷冻管爆炸，带手套用镊子将冷冻管取出，不可用手。 (2)解冻时，液面不可超过冻存管面，以防污染。 - 11 -