主要试剂:
核酸电泳缓冲液有三种,即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE与TPE缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE在DNA段回收时含磷酸盐浓度高,容易使DNA沉淀.TAE缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防止PCR扩增产物降解。
核酸分离一般用连续缓冲体系,常用的有:
1) TBE:0.08mol/l Tris·HCl,pH8.5,0.08mol/L硼酸,0.0024mol/l EDTA
2) THE:0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8,0.2mol/L醋酸钠,0.0018mol/l EDTA
主要实验步骤:
1、用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净.放在水平桌面上,并架好梳子。
2、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。
3、胶液的制备:称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
4、胶板的制备:将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB 溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液
至液面恰好没过胶板上
表
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面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。
琼脂糖浓度的配置可参照下表:
琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb)
0.3 5~60
0.6 1~20
0.7 0.8~10
0.9 0.5~7
1.2 0.9~6
1.5 0.2~3
12.0 0.1~2
实验
材料
关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料
,器具及药品:
电泳仪,电泳槽,移液器,枪头,紫外透射检测仪等
琼脂糖,0.5×TBE电泳缓冲液,溴化乙锭,6×上样缓冲液(溴酚蓝,蔗糖)
实验步骤:
⑴ 0.8g 琼脂糖加入100ml 0.5×TBE电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。(冷却到60℃,加入100μl的0.5mg/ml EB,并摇匀)
⑵用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃)倒入,室温冷却凝固。
⑶充分凝固后撕掉两端的胶布,将凝胶置入电泳槽中,加0.5×TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm,小心垂直向上拔出梳子。
⑷用移液器吸取DNA或复合样品20μl于离心管中,再加入10μl 的6X上样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。
⑸打开电源开关,调节电压至3-5V/cm,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约30min-60min。
浙公网安备 33021202002483