[硕博论文][人体解剖与组织胚胎学]L

[硕博论文][人体解剖与组织胚胎学]L 南昌大学医学院硕士学位论文L-NAME对严重烫伤早期大鼠血脑屏障通透性和MMP-9表达的影响姓名王航辉申请学位级别硕士专业人体解剖与组织胚胎学指导教师刘曾旭20070419摘要摘要目的观察对严重烫伤早期大鼠血脑屏障通透性和表达的影响探讨与严重烫伤引起的血脑屏障损伤之间的关系。方法建立度严重烫伤大鼠模型。健康成年大鼠随机分为四组正常对照组假烫伤组烫伤组烫伤治疗组。、组又设严重烫伤后、、、、个时相点用透射电镜观察血脑屏障超微结构变化紫外分光光度计检测脑组织伊文氏蓝含量干湿重法测脑含水量免疫组化染色观察脑表达。结果严重烫伤后大鼠脑组织伊文氏蓝含量、脑含水量明显增高表达升高差别具有显著性。电镜显示烫伤后大脑皮质的神经细胞线粒体肿胀或溶解突触小泡减少突触间隙增宽。脑毛细血管周围出现空泡化内皮肿胀基底膜厚薄不均。用一氧化氮合酶抑制剂治疗后脑组织伊文氏蓝含量及脑含水量与假烫伤组比较明显下降经治疗后表达恢复至正常水平脑毛细血管、神经细胞、突触及基底膜等超微结构基本恢复正常。结论严重烫伤后大鼠血脑屏障通透性增高与脑内表达升高有关提示??是严重烫伤后血脑屏障损伤的关键因素。早期应用能明显减轻烫伤对的损伤可能与抑制表达有关。关键词烫伤血脑屏障硝基精氨酸甲酯基质金属蛋白酶— 、析 一 ’ 。、析 晰 ?? — 一缩略词表缩略词表缩略词表学位论文独创性说明学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名手写字同期少吵杉’月乡日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌文学有关保留、使用学位论文的规定有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后适用本授权书学位论文作者签名手写…期呼月学位论文作者毕业后去向工作单位通讯地址主蚤锐夕日导师签名手写别专厶签字日期年厂月歹电话邮编第一章引言第一章引言严重烧伤后脑水肿 是早就被人们注意到的一个事实其发生率与烧伤的严重程度成正比【引。严重烧伤后脑水肿作为严重烧伤后主要内脏并发症之一病因复杂伤情严重发展越快后果越严重在临床救治中颇为棘手严重威胁着伤员生命。因此在烧伤内脏并发症防治中占有重要地位。严重烫伤早期血脑屏障 损害通透性增加最终导致脑水肿的发生。严重烧伤后脑水肿发生的主要原因分为血管源性和细胞源性两种前者因为血管本身通透性的改变或烧伤后补液过多引起细胞间隙扩大细胞外形成的稀释性低钠血症而引起后者多为烧伤后释放毒性物质吸入或烧伤后产生的毒素进入血液引起毛细血管通透性增加而形成。因为脑水肿的渗出液均来自于血液都必须移动通过完整的血脑屏障以致于蛋白被排除所以所有的脑水肿实际上都是血管源性的。烧伤后血脑屏障通透性改变在脑水肿的形成中起着至关重要的作用。血脑屏障作为血液和脑实质之间物质交换的屏障是脑水肿研究的一个重要领域。血脑屏障的概念是年由 正式提出的。血脑 屏障主要由脑血管内皮细胞、内皮细胞间紧密连接、基底膜和胶质细胞足突构成。其中血管内皮细胞 及其紧密连接是的重要形态学基础。脑 与外周器官的 相比在功能与形态上有许多差异脑 拥有狭窄的细胞间连接复合体在 质膜上无窗孔其胞浆中有高密度的线粒体其质膜中缺少胞饮小泡缺少收缩性的蛋白。紧密连接结构相当稳定主要起着屏障与粘连作用它与脑毛细血管 组成血脑物质交换的第一道屏障。正常情况下血脑屏障完整性确保了脑不受内外环境各种理化因素的影响。基底膜可起酶屏障作用是血脑间的第二道屏障。脑毛细血管基底膜是维持完整性的重要结构基础。它厚约内皮细胞基底和基膜之间仅有一狭小间隙电镜下基膜由微纤维形成网状骨架中间填充无定形物质基膜本身具有一定的负电荷。基底膜主要由?型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白构成它能起到支持作用防止由于静水压和渗透压改变引起的血管变形。星形胶质细胞第一章引言对的完整性有诱导和维持作用为维持内环境恒定的第三道屏障。外伤、烧伤、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素等均可造成血脑屏障损伤从而导致血脑屏障通透性增高产生血管源性脑水肿。作为中枢神经系统与外周血液循环之间物质交换的调节器对中枢神经系统内环境的相对稳定起着重要的作用其中血管内皮细胞紧密连接结构的完整性对的功能起着主要作用【 血脑屏障的功能遵循 原理即任何在单纯静水压下进入脑组织的水分都将由被阻留在血管内的电解质和血浆蛋白形成的渗透压所建立起的一种反向力量将其重新“抽回”血液从而有效的控制水分子及其溶质进入脑组织。在病理情况下由于受到破坏这种调控作用消失血液的成分包括电解质和血浆蛋白因血液动力而经开放的释入脑组织。影响的因素脑微血管内皮细胞只有与胶质细胞共同培养才能产生屏障结构提示胶质细胞分泌指令性因子决定生成。创伤、高热等可破坏紧密连接的完整性。糖脂诱导的自身免疫抗体对微血管内皮细胞的免疫性损伤可造成的通透性增加。氧自由基可激活金属蛋白酶后者消化基底膜导致破坏。炎性细胞因子可破坏紧密连接促进活化白细胞在血管内皮细胞的粘附和转移。高渗性甘露醇可使血管内皮细胞铍缩。细胞间紧密连接可逆性开放 】。基质金属蛋白酶 是一组锌依赖的蛋白水解酶能降解几乎所有细胞外基质 在生理和病理过程中发挥着重要作用。在 中基质金属蛋白酶 一又名明胶酶是体内最重要的降解酶之一能降解脑血管内皮细胞基底膜基底膜在维持血脑屏障通透性方面起重要作用及紧密连接蛋白 最近研究揭示与血脑屏障损伤关系最为密切。大量实验研究证实与自由基在血脑屏障损伤中扮演愈来愈重要的作用?。酶原相对分子质量为活性相对分子质量为?一的主要底物包括明胶、胶原?、、层粘连蛋白和弹性蛋白。。由多种细胞合成分泌包括巨噬细胞、中性粒细胞、毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和海马锥体细胞等。有一个纤粘蛋白结合域主要攻击脑血管外基底膜的主要成分层粘连蛋白和纤粘蛋白。与脑血管病的关系最为密切。只在炎症反应中被诱导产掣】。的特性包括以酶原形式分泌催化机制依赖于含锌离子的活性中心第一章引言为内肽酶能从肽链中间裂解产物酶原能被某些蛋白酶或有机汞激活并能被相应的特异性组织抑制因子 所抑制活性酶能裂解一种或多种细胞外基质”。可以降解紧密连接蛋白使蛋白下降跨膜蛋白与细胞骨架之间的连接受损内皮细胞问的紧密连接破坏血脑屏障的通透性增高使脑水肿进一步加重【】。参与脑缺血、脑出血、脑创伤时的血脑屏障损伤。 掣给鼠脑内注射明胶酶发现明胶酶通过降解毛细血管基底膜和紧密连接引起的破坏产生继发性组织损伤。研究发现脑缺血后缺血区表达开始增加明显增高达到高峰一直持续到缺血后第表达恢复基础水平。的表达可能是由于与急性期损伤有关。 等【】在小白鼠脑缺血再灌注模型实验中发现脑缺血的降解主要为活性作用所致。 等【进一步证实脑缺血后对的损害主要与基底膜中层粘连蛋白丧失有关。 在局灶性脑缺血再灌注小白鼠模型实验中发现活化的早期出现导致破坏和血管源性脑水肿。基因敲除的小鼠脑缺血后较同种野生小鼠梗塞面积明显减少而脑缺血的野生小鼠应用的广谱抑制剂治疗后也使缺血性脑损害明显减轻基因敲除的小鼠应用治疗则显示无效【。 等】在细菌胶原诱导的大鼠脑出血模型上发现制模后脑组织中含水量和含量增加并伴有富含型胶原的脑血管床基底膜的破坏 抑制剂能显著降低细菌胶原酶注射部位外围的脑含水量。由此可推出的表达增加可能是脑出血后早期引起开放血管源性脑水肿形成的重要原因之一。脑创伤后神经元、胶质细胞、内皮细胞和侵入的中性粒细胞都可以表达大量的。在小鼠控制性皮层冲击伤模型中应用 和明胶酶谱法检测发现伤后损伤侧脑组织表达开始升高达高峰墙〔嗄宰橹 谋冻中 泶镆恢芤 ,谧杂陕涮迥源炝焉四,椭歇嵩谏撕罂 忌 叽锔叻逑陆抵琳 ～尽,谀源瓷酥谢钚陨 咚 庋 芑 食煞中徒涸 ?阏沉 鞍缀拖苏沉 鞍滓约敖裘芰 拥鞍资够 啄ず徒裘芰 咏峁蛊苹低ㄍ感栽黾拥贾卵 茉葱阅运 准又啬运鹕恕;共斡肓硕喾?杂不 ?《拘阅匝住?笛樾员溆π 云琳纤鹕恕,谝徽乱 院侠淼鹘诿傅淖饔枚杂诜乐文匀毖 阅约顾柩椎纫 鸬难 乃鹕擞兄匾 囊庖濉,芯糠?致 谧?洫妗?涸 缚晒セ髅 秆 苤芪У幕 啄た 拧,嬉种萍量梢约跎俚鞍兹芙饷付匝 芑 啄さ乃鹕讼拗萍谭?陨窬 仔苑从Α:侠淼挠τ弥幸 径阅匀毖 鸬乃鹕擞斜;ぷ饔闷渥饔没 瓶赡苡肫涠曰 啄さ谋;び泄于, 云琳系乃鹕耸悄匀毖 ?蟹纭?馍说饶运鹕斯 讨性缙谒劳龅闹饕 ,找蛩刂 弧尽 严重烫伤或烧伤以后同样存在脑缺血、缺氧同时因为严重烧伤或烫伤后产生大量毒性物质被吸入而引起脑功能衰竭并引发脑水肿。严重烧伤可引起多器官的损害脑水肿症状往往被其它并发症掩盖容易被医生忽视。尤其因其特殊的解剖生理特点严重烧伤后较成人更易发生脑水肿。黎海涛等研究发现犬严重烧伤后大脑出现脑水肿的组织学改变部分毛细血管内皮细胞、神经细胞及轴突出现不同程度的缺血坏死并随时间延长而逐渐加重以伤后表现最为显著。几种与血脑屏障通透性增加的因素已被确定另有一些尚在研究之中。研究表明严重烧伤后血脑屏障通透性增蒯】。那么严重烫伤后是何种因素促使血脑屏障破坏呢严重烫伤后脑内的表达有何变化与通透性、脑水肿之间有何联系调节的表达对严重烫伤后脑水肿发生有无预防作用国内外未见相应报道。严重烧伤后脑内的一氧化氮 是增高的是体内最重要的自由基可破坏血脑屏障。而自由基可以激活。那么一氧化氮合酶抑制剂一硝基一精氨酸甲酯 能否同时抑制与的表达严重烫伤后调节一氧化氮的生成对的表达及脑水肿形成有何影响的表达与脑血管内皮细胞紧密连接蛋白之间又有何关系这些问题都值得我们去研究。本实验可为进一步探讨血脑屏障损伤机制提供新思路。本课题通过观察对严重烫伤早期大鼠血脑屏障通透性和表达的影响探讨与严重烫伤引起的血脑屏障损伤之间的关系及对损伤的保护作用及可能机制。第二章材料与方法第二章材料与方法实验材料主要试剂和仪器主要试剂伊文氏蓝二甲基甲酰胺硫化钠戊巴比妥钠蔗糖一抗一试剂盒多聚赖氨酸戊二 醛多聚甲醛及浓缩型试剂盒主要仪器电子天平冰冻切片机高压消毒锅分析天平高速低温离心机生物显微镜低温冰箱型透射电镜微量移液器美国国产分析纯美国国产分析纯上海化学试剂公司国产分析纯美国美国美国上海化学试剂公司上海溶剂厂北京中杉金桥生物技术有限公司德国赛普利期浙江金华无线电机厂上海博迅有限公司上海天平仪器厂日本日本日本日立公司上海求精生化试剂仪器有限公司第二章材料与方法紫外分光光度计上海精密仪器仪表有限公司型电热恒温水浴箱上海医用恒温设备厂自动纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂免疫组化温盒武汉博士德生物工程有限公司型电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂实验动物和分组健康成年 大鼠只由南昌大学医学院动物科学部提供体重雌雄不拘。随机分为四组组正常对照组只大鼠组假烫伤组只大鼠组烫伤组只大鼠?组烫伤治疗组只大鼠术后立即腹腔注射 。所有实验大鼠分别于烫伤后立即腹腔注射乳酸林格氏液 抗休克。、组又设烫伤后、、、、共个时相点处死动物每组每个时相点各只注电镜标本每组每个时相点各只脑含水量和免疫组化共用标本。分别于相应时间点取材。实验方法严重烫伤动物模型的建立制作烫伤模型前单笼喂养周禁食。戊巴比妥钠 .