血清羟脯氨酸测定及影响因素
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?158?医学检验进修杂志1997年第4卷弟4期 血清羟脯氨酸测定及影响因素
河北省中医院(050011)王再华郄会卿
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摘要介绍以过睾【酸三氯醋酸来测定血清中羟脯氨酸总量及结合羟脯氨酸.在测
定过程中标本的采集及不
同的饮食对测定结果有影响.宜采用空腹血.酪氮酸,色氨酸在本法条件下出现干
扰,显色特异性好
关键词轻脯氮酸水解食物影响
毋
通过 人体中羟脯氮酸主要存在于胶原蛋白中.
对弪脯氨酸含量的测定.能了解体内胶原蛋白分解 代谢情况,对皮肌炎,恶性肿瘤,煤矽肺等疾病的诊 断及疗效观察有一定的参考价值,也是观察儿童生 长速度的重要指标我们参考有关资料选择并改进 了一种操作简便,准确性较好用血量少的i蹙『定方 法对有关实验条件进行了探讨.井对健康人血清中 羟脯氨酸含量作了测定,供参考
1原理
以过氯酸一三氯醋酸沉淀血清中蛋白质,滤液 中与肽相结合的羟脯氨酸经酸水解后被释出,用氯 胺T将羟脯氨酸氧化成含吡咯环的氧化物,以过氯 酸破坏多余的氯胺T,终止氧化过程,使氧化物与对 二甲氨基苯甲醛反应,生成红色化合物,进行比色定
量.
2试剂
2.16.5mol/L过氯酸
2.20.4mo|/L三氯醋酸液
2.3枸糠酸缓冲液枸橼酸50g,冰醋酸12ml,醋 酸钠120g,NaOH34g,用蒸馏水溶解并稀释至 1000ml.调整pH至6.0士0.2,冰箱保存. 2.40.05mol/L氯胺T液取氯胺T1.41g溶解 于20ml蒸馏水中,加甲醇30ml,再加枸橼酸缓}中液 50ml,置冰箱可保存一周.
2.5酚酞41~,-'R-剂酚酞100mg溶于100m195乙 醇中.
2.66mol/LNaOH液
2.7欧立区试荆x~--甲氨基苯甲醛10g,以95 乙醇溶解并稀释至lOOml,此液可存放二周. 2.8径脯氯酸标准贮存液(10mmol/L)精确称 取L一羟脯氮酸131mg以0.0lmol/LHCI溶解并 移至100ml容量瓶中,再以0.01mol/LHCI稀释至 刻度置冰箱保存.取标准贮存液一定量以蒸馏水稀 释100倍,浓度为100,umol/L作标准应用液. 3方法
3.1羟脯氯酸总量测定
3.1.1沉淀蛋白质取试管三支.标明测定管标 准管,空白管.测定管中加血清lml,标准管中加标 准液lml,空白管中加蒸馏水lml,各管中加6.5 mol/L过氯酸0.5ml,0.4mol/L三氯醋酸液0.5ml, 混匀,放置10min.3000rpm/min离心5rain. 3.1.2水解分别取上清液lml,置入5ml容量的 安瓿中封口,在110'C干燥箱中水解蛆.
3.1.3调整pH取出冷却.打开安瓿,各加酚酞指 示剂一滴,以6mol/LNaOH校正pH至溶液呈粉红 色.将安瓿内的水解液分别倒入刻度试管中,以蒸馏 水洗涤安瓿,并将洗涤液全部倒入刻度试管中.各管 以蒸馏水补充体积到5ml.
3.1.4氧化各管中加入0.05mol/L氯胺T液 lml,置室温氧化20min,在氧化过程中振摇数次,氧 化完毕各管加6.5mol/L过氯酸Iml,混匀. 3.1.5显色各管加入欧氏试剂Iml,混匀,置 56"C水浴箱中显色15min,取出冷却,以721型分光 光度计560nm进行比色,以空白管校正光密度为0 点,读取各管光密度
3.1.6结果计算
羟脯氨酸总量cm.I/L)~;l;}喜囊×-..
3.2游离羟脯氨酸测定
?[作者简介:王再华,男,主管检验师,临检科,中心实验室副主任
医学检验进修杂志lgg7年第鲞苤
操作与总量测定基本相同.不同点是:沉淀蛋白 质时需置入冰内操作,避免结合羟脯氨酸的水解?离 心沉淀后立即取上清液以NaOH校正pH.省略水 解这一过程.羟脯氨酸总量减去游离羟脯氨酸量即 为肽结合羟脯氨酸量
4实验与结果
4.1标准曲线羟脯氨酸含量0,100~mol/L范 围内与光密度值成线性关系.
4.2精密度试验取两份混合血清,每份平行操作 十次,结果(以~mol/L表示)标本1i=33.65, S一1.63,CV=4.9;标本2x一21.85,S一0.91,
CV=4.2;连续测定5天,标本1一34.76.S一 1.71,CV一5.1;标本2x=22.4,S一1.01,CV 4.4.
4.3回收试验向羟脯氨酸含量为27.6~mol/L 的混合血清中分别加入羟脯氨酸含量为20,4O, 60~mollL的标准液,测得其回收率分别为96.5, 94,93.2
4.4水解效果与术解时间本法中过氯酸与三氯 醋酸既是蛋白质沉淀剂,又能水解结合羟脯氨酸.为 了对比水解效果,分两种方法沉淀蛋白质及水解肽 结合羟脯氨酸一种是本法,另一种是以浓盐酸代替 6.5mol/L过氯酸,同时水解4h,两种方法水解后测 得结果一致.过氯酸与三氯醋酸沉淀蛋白质完全,而 且不沉淀月胨.结合羟脯氨酸系羟脯氨酸与肽相结 合,在上述沉淀剂中不被沉淀
以110?分别水解2h,4h,7h进行试 水解时间,
验,结果表明4h已完全水解.
4.5人体血清羟脯氨酸昼夜变异及食物的影响 血清中羟脯氨酸含量变化随着人体从食物中摄 取羟脯氨酸的多少而有明显的波动.为了观察昼夜 变异规律,我们对四名普通饮食的正常人在24小时 内分三次取血样:下午3时,夜间11时,第二天清晨 7时(空腹).测定了游离羟脯氨酸及羟脯氨酸总量, 其变异规律见图(四人平均值作图).
从图中可以看出,清晨7时空腹血中含量最低, 午餐后含量最高
不同种类的食物可I起血清羟脯氨酸含量出现 较大的差异.肉类比淀粉类含多量羟脯氨酸,尤其是 ?
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猪肉皮胶原含量很高,虾类,蛋类,豆制品次之,淀粉 中含量更低我们对两名正常人进行了普通饮食及 肉食后(午餐约200余克鸡肉)昼夜血清羟脯氨酸含 量差别观测结果表明(以二人平均值计算)午餐后 (下午3时)普通饮食为26.7~mollL,肉食为35.1 ~mol/L,第二天清晨7时空腹血普食为23.66~moll
L,肉食为29~mollL.所以血清羟脯氨酸测定应禁 食多量羟脯氨酸的食物一昼夜,井空腹取血,这样才 能使实验数据有较好的可比性
3O
含25
量
20
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l5237<空腹)
取血样时间(小时)
舀1血清羟脯氪酸昼夜变异
4.6干扰因素在本法显色条件下,色氨酸浓度在 1.2mgtml,酪氨酸浓度在1.1mg/ml以下不出现干 扰,说明呈色特异性良好.
4.7正常参考值测定了40名健康成人(年龄l8 ,45岁)血清羟脯氨酸含量,游离羟脯氨酸为l3.0l ?2.39~mollL,肽结合羟脯氨酸为8.63?1.93 ~mol/L.
5讨论
本法操作较为简便,特异性良好,在无蛋白滤液 中邑氨酸酪氨酸含量甚微,所以不出现干扰,通过实
验,说明应坚持空腹取血,在操作中我们免去了测定 对照管,如欲制作对照管,则操作最后以95乙醇 代替欧氏试剂,经试验光密度为0,所以免去,以减 少血清标本用量.
参考文献略
(收待日期:199ff.06.25)
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