唾液淀粉酶最适pH值的测定

唾液淀粉酶最适pH值的测定 作者:黎海燕 黎唐燕 何会姣 吴妙凤 摘要: 目的:(1)掌握测量pH对酶活力影响的基本原理和方法，了解pH对酶活力的影响,把酶学知识应用于临床诊断与应用治疗(2)熟悉不同pH值缓冲溶液的配制和分光光度计的使用. 方法:通过唾液淀粉酶在不同pH环境中水解淀粉，测出未被水解的淀粉与碘液结合成的蓝色复合物的分光光度值，根据实验数据判断酶的最适pH。因为在温度、酶浓度相同的条件下，酶的活力在最适pH处达到最大，远离则变小。在底物过量的条件下，相同时间内，在温度、酶浓度相同的条件下，接近最适pH的反应体系中消耗淀粉的量最大，剩余淀粉与过量碘液生成的颜色越浅，吸光度越小，利用分光光度计测出各管的吸光度后，取处于升高与降低趋势之间的较小吸光度范围对应的pH值即为唾液淀粉酶的最适pH。 结果:在ph值6.0~8.0内范围变化，并且随着ph的增大而先减少后增大，ph=6.6左右，吸光值最低，所以唾液淀粉酶最适ph值约为6.6。 关键词 唾液淀粉酶、活性、PH、吸光度 前言 酶学与医学的关系密切。人体的许多疾病和酶都密切相关。酶分子中的许多极性基团，在不同的pH条件下解离状态不同，其所带电荷的种类和数量也各不相同，酶活性中心的某些必需基团往往仅在某一解离状态时才容易同底物结合或具有最大的催化活性。此外，pH的改变还可以引起酶活性中心的构象改变,因此pH的改变对酶的催化作用影响很大。人的唾液中99%是水，有机物主要是唾液淀粉酶、粘多糖、粘蛋白及溶菌酶等，无机物有钠、钾、钙、氯和硫氰离子等。唾液中含有的一种有催化活性的蛋白质，可以催化淀粉水分解为麦芽糖。唾液淀粉酶发挥作用的最适pH值在中性范围内，唾液中的氯和硫氰酸盐对此酶有激活作用。食物进入胃后，唾液淀粉酶还可继续使用一段时间，直至胃内容物变为pH值约为4.3~4.8的酸性反应为止。 正文 实验原理:ph的改变对酶的催化影响很大，酶催化活性最高时，反应体系的PH值称为最适 PH值。本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受ph影响的情况。淀粉被分解 越多，剩余底物越少，A值最小，过酸或过碱会抑制酶的活性，使底物分解减少， A值增大。碘液与淀粉的不同程度水解的产物反应呈不同颜色，即:淀粉(蓝色)、 紫色糊精(紫色)、红色糊精(红色)、麦芽糖及葡萄糖(黄色)。利用朗伯—比尔 定律，用分光光度计测量出各溶液在660nm处地吸光度A，从而间接测出唾液淀 粉酶的最适PH值。A在ph值6.0~8.0内范围变化，并且随着ph的增大而先减少 后增大，ph=左右，吸光值最低，所以唾液淀粉酶最适ph值约为。 实验仪器与试剂: 试管、试管架、洗耳球、小烧杯、坐标纸、37?恒温水箱、722型可见分光光度计、 吸量管，一次性纸杯 试剂药品:0.4g/L缓冲淀粉溶液、碘液、0.2mol/L磷酸二氢钠溶液、0.2mol/L磷酸 氢二钠溶液、蒸馏水 实验步骤: (1)配置缓冲液 : 配置各个PH的缓冲液10ml， 选择ph值从6.0到8.0，间隔0.2. 不同ph值的测定 用量(10ml) 试剂 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 磷酸氢二钠 0.615 0.925 1.325 1.875 2.45 3.05 3.6 4.05 4.35 4.575 4.735 磷酸二氢钠 4.385 4.075 3.675 3.125 2.55 1.95 1.4 0.95 0.65 0.425 0.265 定容到10ml (2)唾液的获取: 蒸馏水漱口1~2次，,然后含一大口水约1min，期间做咀嚼运动，然后收集至杯子中。 (3)淀粉用量的确定: 管号 1 2 3 空白 7.0PH缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 2.5g/L淀粉 0.4 0.5 0.6 - 唾液(稀释10倍) 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，37 ?水浴7.5min，然后向每管加2滴碘液 H2O 5.6 5.5 5.4 6.0 混匀，观察现象，并选择适中一支，记录其中用量 结果: 0.4ml 2.5g/L淀粉为最适量(颜色最浅) (4)酶液稀释倍数的确定: 稀释倍数 5 10 15 20 25 30 酶液(ml) 1 0.5 0.4 0.25 0.2 0.2 H2O(ml) 4 4.5 4.6 4.75 4.8 5.8 另取试管各取配好的稀释液0.1ml: 管号 1 2 3 4 5 6 7 稀释倍数 5 10 15 20 25 30 空白 7.0PH缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 2.5g/L淀粉 由第3步操作确定 (0.4ml) 唾液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，37 ?水浴7.5min，然后向每管加2滴碘液 H2O(ml) 6 6 6 6 6 6 6 混匀，观察现象，并选择适中一支，记录稀释倍数 结果:观察到酶稀释十倍2号管颜色最浅，所以酶稀释十倍最适合 (5)最适pH确定: PH试剂 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 PH缓冲液 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 2.5g/L淀粉 由第3步操作确定 (0.4ml) 某倍数唾液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 (由第4步操作确定) 混匀，37 ?水浴7.5min，然后向每管加2滴碘液 H2O(ml) 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 混匀，用蒸馏水调零，测定A660nm A660nm 0.52 0.657 0.625 0.652 0.787 0.669 0.718 0.665 0.638 0.737 0.728 以A660nm为纵坐标，PH为横坐标作图 实验记录: 实验结论: 根据实验数据结果，绘出上图。最低点对应的PH值即为唾液淀粉酶的最适PH值。由于实验误差，PH为6.0时数值偏离较大，应该舍弃。最低点对应PH为6.6，即本次实验得出的唾液淀粉酶最适PH值为6.6 讨论: 1.此次实验是根据唾液淀粉酶催化底物水解量来测定最适PH值。当唾液淀粉酶的活性最大时，淀粉被分解的最多，剩余底物的量最少，A值最小，过酸或过碱都会抑制酶的活性，使之分解的底物减少，A值增大。由所作曲线可知唾液淀粉酶的最适PH值在6.6左右。在PH小于6.6时，酶的活性随着PH升高而增大，在PH等于6.6时达到最大值，在PH大于6.6时酶的活性随PH升高而降低。 2.在唾液淀粉酶活性最高时要保证底物过量。 3.选取合适的底物浓度，过高或过低，会导致颜色过深或过浅，难以判断。 4.加入碘液后必须加入蒸馏水稀释 5.碘液能使唾液淀粉酶灭活，不用煮沸使酶失活 6.酶的最适PH值受底物性质和缓冲溶液的影响，如唾液淀粉酶的最适PH为6.8，但在磷酸缓冲液中约为6.4~6.6，在醋酸缓冲液中约为5.6,。 7.实验结果出现较大误差可能原因有:操作过程中操作者缓冲液拿错，编号记错，恒温水浴时间拿捏不准，等。提供唾液同学的唾液严重偏酸或偏碱，长期以来酶适应了这种条件。 参考文献 (1)张杰 刘伟忠 杨泽民 何震宇 唾液和唾液淀粉酶临床研究进展 广东药学院基础学院，广州 510006;2(广州市脑科医院国家药品临床研究基地，510360 (2)张盛周 朱升学 佟媛 张荣 樊爱绪 pH值和温度对虎纹蛙消化系统蛋白酶活力的影响 安徽师范大学学报(自然科学版)第28卷2期2005年 6月 (3)张盛周 朱联九 朱升学 王波 汪燕 曹金秀 黑斑蛙消化道淀粉酶的活力 安徽师范大学 学报(自然科学版 )第 32卷 2期 2009年 3月 (4)胡思玉 白建梅 葛传龙 王延斌 陈永祥 pH值对昆明裂腹鱼淀粉酶活性的影响牢 毕 节学院学2006年第4期总第24卷(总第87期) (5)吴耀生 周素芳 医学生物化学与分子生物学实验指南 张光亚 基于几丁质酶特征序列预测其最适pH的研究 激光生物学报 (6)林毅 蔡福营 第 l7卷5期2008年10月