紫杉醇提取及纯化

紫杉醇提取及纯化 兰州交通大学 化学与生物工程学院 综合能力训练?——文献综述 题目:紫杉醇提取与纯化研究进展 作者:李建军 学号:200907258 指导教师:谢放 -7-21 完成日期:2010 紫杉醇提取与纯化研究进展 李建军 兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州 730070 摘要 综述近年来紫杉醇提取纯化技术中的提取 、萃取 、柱色谱和高效液相色谱几个步骤的研究进展 ,评价其在 生产中的实用性 。 关键词 紫杉醇 ;提取 ;纯化 ;综述 紫杉醇 ( t a x o 1 ) 是 1 9 7 1年自太平洋红豆杉 (T a x u s b r e v i f o 一 lia ) 树皮中分离出的一种 二萜类化合物 。1 9 9 2年被 F D A批准用于治疗晚期乳腺癌的特效药上市。紫杉醇在植物体中含量很低 ，并与多种类似物共存 ，目前从红豆杉中分离紫杉醇及半合成前体的过程一般是用甲醇或乙醇浸出( 或超临界提取) ，然后经己烷脱脂 ，二氯甲烷或氯仿萃取得粗提物 ，经多次硅胶柱色谱后再用制备型高效液相色谱 ( H P L C) 、 高速逆流色谱 ( H C S S S ) 纯化后重结晶得到产品 ，目前不同工艺中各个步骤的纯度 、回收率见表 l 。由于紫杉醇的资源短缺 ，加之分离时存在得率低 (成本高 ，生产周期长等问题 ，导致紫杉醇价格昂贵。为解决这些问题 ( 国内外学者围绕增加得率 ， 提高纯度 ， 简化步骤等对紫杉醇的 提取和纯化技术开展了一系列研究。 l 萃取工艺的优化 1 (1溶剂萃取法 溶剂萃取法常用于紫杉醇的粗提阶段，在此阶段主要 考虑溶剂的选择。通常紫杉醇先用甲醇 、乙醇或甲醇一三氯甲烷 ( 1 : 1 ) 浸取，除去溶剂所得的浸膏用CH2Cl2 一 H2O或 C H3Cl-H20萃取 ，这种方法提取获得的浸膏杂质含量多 。日本学者对紫杉醇提取的溶剂种类进行了研究，结果表明在乙酸乙脂 、甲醇 、乙酸乙酯一甲醇 、乙酸乙脂一二氯甲烷 、乙酸乙脂丙酮等溶剂中发现以乙酸乙脂一丙酮( 1 : 1 ) 混合溶剂提取效果最好，一次便可以使紫杉醇的提取量高于以往常用溶剂所能得到的量。 1 (2 多元萃取法 陈海涛等针对紫杉醇和有机溶剂的特性 ，提出了红豆 杉细胞两液相培养的有机溶剂(油酸或油酸与邻苯二甲醇二甲酯的混合溶液 )中离紫杉醇的多元萃取方法 ， 即是将甲 醇加入含有紫杉醇的有机溶剂中，甲醇和有机溶剂互溶而成一相，然后加入水，因水与有机溶剂不相溶而成两相( 水 相:紫杉醇一水-甲醇 ;有机相:紫杉醇一有机溶剂-甲醇) ，使得水相对紫杉醇的溶解能力大幅度提高，从而将有机相中的紫杉醇萃取到水相中，使紫杉醇得以分 离。通过测定知道紫杉醇在培养液( 无甲醇存在的水相 ) 和油酸( 有机相) 体系中的分配系数为0(OO649，有甲醇存在( 水相中甲醇的摩尔分数为0.453 )时 ，紫杉醇在水相和油酸体系中的分配系数可达 0(2,0(55 ， 所以采用多元萃取法可大大提高紫杉醇的分离效果 ，在甲醇存在下其分配系数可以提高两个数量级 。 1 (3 起幡界萃取法 超临界流体技术( S P F )引入到紫杉醇的提取纯化技术中可以减少含氯有机溶剂的使用，S P F最常用的溶剂是 c o2，它本身无毒且易从提取物中分离，是一种环保 、安全的新技术。早在1 9 9 2年 J e n n i n g s 等 就已经对该技术作了研究，发现用c o2和加入乙醇改性剂的c o 2作S P F溶剂，在 3 1 8 K温 度和l 8(0 7,2 5(7 9 MP a压力下进行紫杉醇的提取，紫杉醇提取率高达 0(0 8 ,。N a i r 等用含 0(001, ,15,丙酮或乙腈的超临界 co 2 ，也可以有效地提取东北红豆杉的紫杉醇。但由于S P F 用于粗提阶段成本过高，至今还难以进行大规模实践。而超临界流体重结晶( S P R) 有较大分离制备量及简单高效的过程。把S P F和 S P R技术相结合，采用S P R等压温差(吸附法过程，其富集浓度可达到l 0倍所以采用S P R:许并配合分步吸附法给难分离的紫杉醇纯化带来了曙光，只要对吸附剂及现有装置进行适当改进，就可以高效快速地替代现有冗长而低效的硅胶柱色谱分离过程。 1 (4 固相萃取法 固相萃取( S P E ) 是近2 0年才发展起来的技术 ，用 S P E方法可以快速除去浸膏中的脂、蜡及色素等杂质 ， 获取初步纯化的紫杉醇。比较浸膏经 S e p - P a k C18硅胶和硅胶以及氧化铝固相萃取 ，结果发现浸膏经氧化铝 固相萃取后 ，不仅供试品中大量的亲水性物质 、 脂类物质被去除，更重要的是7一表-紫杉醇峰也随之去除 ，这给紫杉醇的常压色谱精制提供了可能 。 2 柱色谱技术的优化与应用 2(1 硅胶柱色谱 硅胶柱色谱在色谱中应用很广泛 。一般情况下，紫杉醇在硅胶柱上的保留较强，用CHCI3淋洗时紫杉醇不会被洗脱(用CHCI3和甲醇的混合溶液洗脱可分离出两个峰。如果 在色谱流动相中添加0(0 5,水时，分离出的紫杉醇纯度有所提高 ，分离速度加快，经常压硅胶柱色谱可获纯度 >1 4 , ，回收率 >9 8 ,的紫杉醇。在中压快速硅胶柱色谱的条件下，用cH 2cl2 、甲醇梯度洗脱，可使紫杉醇的纯度达到4 0 , ,6o, 。 由于苯基反相介质在分离多环化合物方面有独特的作用，因此可用紫杉醇分离 。苯基一硅胶介质以硅胶为基质 ，r一氨丙基三氧基硅烷( A P T S ) 为连接臂，通过液相法( 分别用三乙胺 、吡啶 、吗啡啉为催化剂 ) 和气相法合成 。采用甲醇一水( 6 5 : 3 5 ) 为流动相，用液相法合成的苯基一硅胶介质其纯度和回收率分别为 :三乙胺催化合成的为5 3 (5 , 、5 9(3 , ， 吡啶催化合成的为 6 o (2 ,、9 8(6 ,，吗啡啉催化合成的为4 9 .8,、4 0(8 , ;用气相法合成的苯基一 硅胶介质可使紫杉醇的纯度达 7 7(4,，回收率达9 2,。 2(2 氧化铝色谱柱 在比较色谱介质性能研究中，通过比较固相萃取、硅 胶色谱、氧化铝色谱以及制备薄层色谱，可知用氧化铝柱色 谱能获得40以上的纯化倍数，极性比紫杉醇弱的物质基本 被除去，然后通过-步c 18固相萃取便可除去极性比紫杉 醇稍强的杂质。用氧化铝柱色谱初分离工艺不但纯化倍数高 ， 而且其回收率大于1 4 0,。对氧化铝色谱中氧化铝的酸碱性等条件的优化选择结果表明:用碱性氧化铝，流动相中含水0(03,,甲醇1(5,,反应时间在3 0 mi n左右，洗脱速度在1 ,3 m1 ,mi n之间时效果最好，可以使紫杉醇的含量从小于 1 ,提高到大于2 7 , ，紫杉醇的表观回收率大于170,。这说明有其它非游离的紫杉醇转化成了游离紫杉醇，研究表明通过碱性氧化铝柱色谱后 ， 有5 0,的7 一 表一 紫杉醇可以转化成游离紫杉醇，使紫杉醇的回收率可达170,。 2(3 大孔吸附树脂 紫杉醇具有多环结构，容易被带苯环的吸附剂特异性 吸附。在静态吸附的条件下，通过对树脂类型、树脂吸附的 最佳p H值进行选择，发现用20 1×4型树脂，p H为6(4时效果最好。在动态吸附的条件下对洗脱条件进行比较 ，结果表明用50,甲醇水溶液为初始溶剂 ( 调 p H为 6 ( 4 ) 溶解供试品及淋洗，紫杉醇被完全吸附于2 0 1×4型树脂上，以 8 0,的甲醇溶液洗脱，经一步树脂吸附色谱 ， 除去了紫杉醇浸膏中的脂 、蜡等杂质，供试品颜色由棕黑色转成浅黄色，紫杉醇含量从 0 、6 5,提高到 2(1 5, ， 紫杉醇的回收率为9 9.6,。在对东北红豆杉的研究中， 用乙醇提取液在高分子树脂( MN) 上用乙醇和水进行梯度洗 脱，可实现紫杉烷与大部分非紫杉烷的分离，分离出紫杉烷类化合物后，再用 Z o r b a x — S W 柱进行分离 ，用乙醇一 水( 4 5 : 5 5 ) 可把紫杉醇与另外两种紫杉烷基本达到分离， 得到高纯度的紫杉醇。 3 紫杉醇与衍生物 c e p h a l o ma n n i n e的分离 3(1 化学反应法 紫杉醇很难与衍生物 c e ph a l o m a n n i n e分离 ， 用化学反应 的方法将 c e p h a l o ma n n i n e的性质改变而保持紫杉醇的性质不发生改变,使得二者容易分离 。K i n g s t o n等,尝试的用0sO4处理紫杉醇与 c e p h a l o ma n n i n e的混合物，发现0sO4能选择性的氧化 c e p h a l o ma ml i n e ，使之成为醇，而紫杉醇却不受影 响，这种方法有较好的效果，可使紫杉醇的纯度达到9 5, ， 但因毒性大而不能应用于实践 。Mu r r a y改良法采用含 1 , ,1 0, O3氧化后，加入吉拉德氏酰肼一 A C OH混合物使 O Z O —c e p h a l o — ma n n i n e ( c e p h a l o ma n n i n e被氧化的产物 )最后通过选择性沉淀或用乙酸乙脂一水等萃取，就可以把紫杉醇分离出来,可使紫杉醇的纯度达到9 7(5 ,相比较K in g s t o n方法而言，Mu r r a y 改 良法无疑是一大进 步。J e f f等发现用臭氧和 Gi r a r d试 剂氧化法分离紫杉醇和 e e p h a l o m a n n i n e取得了良好的效果。 除了用氧化方法外，近来又发现用溴加成的方法来分离紫杉醇和 c e p h alo m a n n l n e的混合物，其具体过程是将树皮用l ,的柠檬酸渗漉，提取物的总萜经过两次柱色谱，得到总萜含量为 4 0 , ,5 0 ,的粗品，然后进行溴加成。对加成条件进行优化筛选，结 果发现选用 0(7 5 ml ( 溶 解 于 1.3 ml的c c L4) 的溴量,1 0 g的加成样( 溶解 于 2 5 nml的 CH CI3 ) ，反应温度小于 2 0 ?C，时间不超 过 5 mi n ，可得到白色晶体的 p a c l i t a x e l 纯度可高达9 9 (2 l ,。其他方法相比较 ，溴加成具有安全成本低 、操作简单易行等优点 。 3 (2 制备型HPLC和HS C C C 制备型 HP L C在分离紫杉醇类化合物方面有着重要的作用，有较深入的研究，制备纯化多用正相，在早期研究中 Wi t h e r u p 在比较C 18氰基柱和苯基柱分别对紫杉醇紫杉烷化合物进行分离 ，结果发现氰基柱和苯基柱刈紫杉醇和c e p h a l o ma n n i n e有较好的分离度 ， 但却不能有效的对 7 一 表一 l 0-去乙酰基紫杉醇( 7 一 e p i 一 1 0 一 d e a c e t y l — t a x o 1 ) 进行分离 要解决这一难题 ，开发新型填料尤为重要，已有tlip h e n y和 p e n t a f l u o r op h e n y l ( P F P ) 、 P h e o me n e x 4 t t m T a x s o l T M F，No v a p a k p h e n )l 等填充柱被开发 。在 对 Z o r b a x S W( T a x a n e住 的研究中，正相条件下比较了在Z o r b a x S W— T a x a n e柱 、烷基烷基柱和五氟苯基柱的离效果 ，在反相条件下比较了 Z o r b a x S W( T a x a n e梓和 C 18柱的分离效果 ，发现 Z o r b a x S W— T a x a n e柱在正相条件 F优于烷基苯基柱 、 五氟苯基柱 ，在反相条件下优 于 C18柱， 在正相条件下可使紫杉醇的纯度达到 9 8 , ，回收率大于 8 0 ,，由于HP L C负载容量小 ，易受柱压的影响 ，制备规模在一定程度上受到了限制。 HS C C C技术是当前国际上较新型的一 种液液分配技 术。该法具有分离效果好，溶剂用量少的优点，同时也具有 无固体载体逆流色谱的;采用石油醚 ( 4 0 ? -6 5 ?) 一 乙酸 乙脂一 甲醇一 水 ( 5 0: 7 0 : 8 0: 6 5 ) 为两相体系从混合物中分离得到纯的紫杉醇和 c e p h a l o ma n n i n e 。HS C C C有望成为紫杉醇大规模生产的技术。 4 简化工艺的尝试 为减少紫杉醇纯化精制的成本和提高回收率 ，用常压色谱法代替HP L C，选择价廉的大颗粒 C 18烷基硅胶色谱柱 ， 采用再循环分离操作方式纯化紫杉醇粗品 ，对色谱条件进 行优化筛选 发现当C 反相色谱柱的洗脱剂为甲醇-乙腈-水 ( 1 : 2 : 2 ) ， 进 料量为 1 5 mg , g ，采用梯度洗脱方式 ，以省略再生步骤的多次色谱方式提高回收率时紫杉醇的纯度可达 9 5,，用甲醇或水重结晶可得到纯度为 9 8 ,的紫杉醇 ，叫收率达到 9 5 ,左右。 综上所述 ，随着研究的不断深入 ，紫杉醇提取纯化技术不断进步，新的技术和手段不断出现并应用 ，并显示了良好的发展前景 ，这些技术将推动紫杉醇生产的低成本 、高效率的产业化进程。 参考文献: 【1】 Jennings DW.HiSh — pressure phase equ ilibria and Supercritical fluid extraction inv olving carbondioxide systems[ J ] (Diss Abst r I nt ，1992 47 ( 5 ): 4860( 【2】 Vanhaelen MH Taxol and related diterpenoids from Taxus species: singnificant advances in cancer chemotheraphy [ J ] ( J P harm Belg，1992，15( 4):697 【3】 锅田怎助 ，田崎弘之，江部洋史，等(夕年f ， 一，类含有L ，效率的抽出方法[ P ] (Japan:6 -l57329，1994—06-03( 【4】 Mu t t i n a M J ! ， Mac ‘ Eache rn GJ (E 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