【doc】HBscFv毕赤酵母工程菌的中试发酵及产物纯化

【doc】HBscFv毕赤酵母工程菌的中试发酵及产物纯化 HBscFv毕赤酵母工程菌的中试发酵及产物 纯化 第33卷第1期 2005年1月 华南理工大学(自然科学版) JournalofSouthChinaUniversityofTechnology (NaturalScienceEdition)V01.33No.1 January2005 文章编号:1000—565X(2005)O1—0079—05 HBscFv毕赤酵母工程菌的中试发酵及产物纯化木 熊盛谢秋玲王一飞邓宁粟宽源 (1.暨南大学生物医药研究开发基地,广东广州510630;2.暨南大学生命科学与技术学院,广东广州510630; 3.解放军458医院传染病中心,广东广州510602) 摘要:中试规模生产可溶性重组人抗HBsAg单链抗体(HBscFv),分泌表达HBscFv的 巴氏毕赤酵母(P-pastoris)工程茵在30L发酵罐中进行补料分批培养.上清中的HBscFv以 离子交换及免疫亲和层析两步法进行纯化.发现酵母工程茵经7d补料分批培养后,6OOnm 波长下的光密度值(OD鲫)达到334,目的蛋白表达量为260mg/L.纯化后,可获得纯度为 95%的HBscFv,产量为l7lmg/L.活性测定结果表明,HBscFv制品的比活性为(2.52? 0.17)g,,与大肠杆菌来源的HBscFv无明显差异. 关键词:乙肝表面抗原;单链抗体;巴氏毕赤酵母;发酵;纯化 中图分类号:Q786文献标识码:A 酵母既是微生物,又是真核生物,这一特性决定 了酵母在蛋白表达系统中的重要地位.与大肠杆 菌相比,酵母的蛋白折叠系统更高级,在信号肽的帮 助下,可以将正确加工的重组蛋白分泌至培养基中, 酵母还具有初级的糖基化能力,可对Asn.X.Ser/Thr 模体中的Asn进行糖基化;与哺乳动物细胞表达系 统相比,酵母培养更简单,生长更迅速.在前期工作 中我们获得了表达重组人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)的巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris)工程 菌,发现酵母工程菌P.pastorisGS115[HBscFv] 能高效分泌表达有活性的HBscFv.本文拟对酵母工 程菌进行高密度发酵,并对发酵产物进行纯化,为重 组抗体的基础研究和新药开发提供物质基础. 1材料和方法 1.1实验材料 1.1.1菌株和质粒宿主菌P.pastorisGS115 收稿日期:2004—02—19 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371661, 30400071);广东省自然科学基金团队项目(粤科基办 [2003]11);广州市科技攻关项目(2003Z3一E0401) 作者简介:熊盛(1972一),男,博士,主要从事生物技术方 面的研究.E—mail:xiongsheng99@263.net (h/s4)购自Invitrogen公司.工程菌GS115[HBscFv] 由本课题组构建. 1.1.2主要试剂抗生素zeocin?及酵母氮碱 (YNB)干粉购自Invitrogen公司;彩色预染蛋白质分 子质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品购自Sigma公司;重组HBsAg及HB. sAb检测试剂盒购自中山生物工程公司.羊抗兔 IgG—AP/HRP,羊抗鼠IgG—AP/HRP购自华美生物工 程公司.配制发酵培养基所需各种化学试剂为国产 或进口分析纯试剂.层析树脂SP—SepharoseFastFlow 及NHSactivatitedSepharoseHP购自AmershamBio— tech公司.鼠抗HBscFv单克隆抗体为本课题组自制. 1.1.3培养基和溶液YNB,缓冲复合甲醇培养基 (BufferedComplexMethenolMedium,BMMY),缓冲 复合甘油培养基(BufferedComplexGlycerolMedi— um,BMGY)及发酵基础培养基FBS,微量元素溶液 PTM1等参照文献[3—5]配制.制备免疫亲和层析 柱所用的灭活溶液等参照产品说明书配制. 1.2方法 1.2.1酵母工程茵的小规模表达工程菌GS115 [HBscFv]单菌落接种25mLBMGY培养基,30%振荡 培养至600nln波长下的光密度值(OD鲫)为2—6,离 心收集细胞,重悬于100—200mLBMMY中,使OD鲫 为1.0,继续培养.每24h补加甲醇一次,至体积分数 为0.5%一2%,同时取培养上清检测蛋白表达J. 华南理工大学(自然科学版)第33卷 1.2.2酵母工程茵的补料分批培养将在100mL BMGY培养基中活化的工程菌转入1500mLBMGY 培养基,30?,250r/min剧烈振荡培养24h至OD 为4,6,作为二级种子接种到15L发酵培养基中, 30?通气培养7d,维持溶氧(DO)在25%一30%之 间,用氨水调节pH为5.5.在此过程中,经历甘油分 批培养阶段,甘油补料分批培养阶段和甲醇补料分 批培养阶段曲J. 1.2.3鼠抗HBscFv单克隆抗体的制备大肠杆 菌表达的HBscFv纯化复性后,委托上海第二医科 大学医学检验重点实验室,采用杂交瘤法制备单克 隆抗体,最后筛选出12株分泌抗HBscFv抗体的杂 交瘤细胞. 1.2.4HBscFv活性测定采用间接ELISA法. 包被有HBsAg的酶标板加人工程菌培养上清或纯 化样品,以兔抗HBscFv作为第一抗体,HRP标记的 羊抗兔IgG作为第二抗体,TMB显色,酶标仪450nm/ 630nm波长测定吸光度. 1.2.5制备免疫亲和层析柱参照HiTrapNHS activatitedSepharoseHP产品说明书进行.鼠抗HB— scFvMcAb14F7置于偶联缓冲液中透析平衡.活化 的SepharoseHP柱用冰冷的1mmoL/LHC1洗柱,然 后注入McAb14F7溶液,25?吸附30min;灭活缓冲 液A,B交替洗柱,洗脱非特异性结合抗体并灭活未 结合的活化基团.最后用中和缓冲液中和至pH中 性,4?保存备用. 1.2.6酵母表达HBscFv的纯化P.pastoris工程 菌诱导表达后,离心分离上清,硫酸铵沉淀或以截留 分子质量为10ku的中空纤维柱浓缩,50mmoL/L pH6.5磷酸盐缓冲液透析平衡,上样平衡过的SP— SepharoseFastFlow层析柱,以含0,500mmoUL NaC1的50mmoL/LpH6.5磷酸盐缓冲液阶段洗脱, 收集各洗脱组分,SDS—PAGE鉴定目的蛋白峰;然后 将目的组分透析去盐后,上样14F7一SepharoseHP层 析柱,0.1moVLPB(pH8.0)洗去杂蛋白,0.1moUL Glycine.HC1(pH4.0)洗脱单链抗体,洗脱产物迅速 用Tris碱中和至pH为8.0. 2结果与讨论 2.1酵母工程菌的高密度发酵 工程菌GS115[HBscFv]在7d发酵过程中的菌 体密度和HBscFv表达量的变化如图1所示.在甘油 分批培养阶段,菌体OD为29;经过8h的甘油补 料分批培养后,菌体OD为78;通过约135h的甲 醇诱导培养后,菌体OD达到334,目的蛋白表达 量为260mg/L. f g 捌 皿 陋 窨 血 图1工程菌GS115[HBscFv]在发酵过程中的菌体密度和 HBscFv表达量变化曲线 Fig.1Changingcurvesofcell—densityandHBscFvyieldduring thefermentationofGS115[HBscFv] 重组毕赤酵母在发酵过程中,最重要的控制原 则就是适度流加甲醇,因为甲醇既是目的蛋白表达 的诱导剂,又是碳源和能量来源,但甲醇体积分数超 过1%后,会对酵母的生长和外源蛋白合成产生明 显的抑制作用J.本文以溶氧作为甲醇流加速 度的指示参数,得到了较好的结果.在发酵后期,生 物量还在缓慢增加,但由于菌体已经衰老并开始自 溶等多方面原因,目的蛋白表达量已经出现下降趋 势.所以,选择合适的收获时间对于毕赤酵母工程菌 发酵来说,至关重要. 2.2HBscFv的分级沉淀 工程菌培养上清加入20%,80%饱和度的 (NH):SO,4?沉淀2h,然后离心收集沉淀,SDS— PAGE分析目的蛋白回收率,结果发现,酵母培养上 清中的HBscFv可被30%,70%饱和度的 (NH):SO沉淀,但50%饱和度的(NH)SO沉淀 效果最好,蛋白回收率可达92.3%(见图2). 在前期研究中,我们发现酵母表达HBscFv活 性受蛋白水解酶影响较大J.考虑到这一点,采用 (NH)SO盐析法浓缩酵母表达上清,因为高浓度 的盐可以抑制蛋白水解酶活性,还可防止大体积培 养液在放置过程中可能发生的细菌污染.根据蛋白 在(NH):SO溶液中的溶解度不同可将其分为两 类:在恒定盐浓度和pH下,第一类蛋白经 (NH)SO沉淀后的上清中的蛋白浓度恒定,第二 类蛋白经(NH):SO沉淀后,上清中的蛋白浓度与 起始浓度正相关J.进一步实验结果表明,HBscFv 翌期熊盛等:HBscFv毕赤酵母工程菌的中试发酵及产物纯化81 100.0 \0 80.0 : 国60.0 皿 要4o.o皿 20.0 0.45 0.40 0.35上样峰 杂蛋白峰HBscFv~ 一 l — 01020304050607080 t/min 图3免疫亲和层析纯化HBscFv洗脱曲线 Fig.3ElutioncurveofpurificationofHBscFvbyimmunoaffini— tychromatography ku菘0 蕊= 97.4— 66.2一1--分子质量标准; 43.0——2,HB.F纯化产物 磷嘲 3l0?—一 l4.4 l2 图4二步法纯化的HBscFv的SDS—PAGE分析 Fig.4SDS—PAGEanalysisofthetwo—steppurificatedHBscFv 蛋白定量分析结果表明,在离子交换层析和亲和 层析阶段,目的蛋白回收率分别为79%和91%,HB— scFv的总回收率为66%,纯化产量为171mg/L. 在没有获得鼠抗HBscFv单克隆抗体之前,曾 尝试应用离子交换层析配合凝胶过滤等非特异性纯 化方法从酵母培养上清中纯化目的蛋白,但回收率 较低.本文应用免疫亲和层析技术,可以更高效快速 地纯化目的蛋白.在工艺探索中,还发现若在硫酸铵 沉淀时牺牲部分回收率,则获得的HBscFv分级沉 淀产物可直接上样免疫亲和层析柱,最后的产物纯 度也可达到要求.这一工艺在大规模生产时也许更 值得选择.另外,在大规模生产时,还可尝试超滤浓 缩培养液后离子交换层析,再免疫亲和层析的技术 路线,也可缩短纯化周期. 2.4HBscFv纯化产物的性质鉴定 采用间接ELISA法测定所获HBscFv的HBsAg 结合活性,定义1gHBscFv所产生的吸光值为比活 性,发现酵母表达HBscFv的比活性为(2.52? 0.17)g,,与大肠杆菌表达HBscFv无明显差 异. 以大肠杆菌表达的HBscFv作为抗原,制备鼠 源单克隆抗体,最后筛选出12株分泌抗HBscFv McAb的杂交瘤细胞.将这12株杂交瘤抗体分别与 大肠杆菌表达HBscFv和酵母表达HBscFv进行 ELISA反应,发现不同来源的HBscFv与鼠McAb有 相似的结合模式.与大肠杆菌表达HBscFv反应强 烈的单克隆抗体与酵母表达HBscFv的结合也较 强,但总体上看,酵母表达HBscFv与McAb的结合 如加”加? OOOOOOO 一;凸0一覃J整 82华南理工大学(自然科学版)第33卷 强度普遍小于大肠杆菌表达HBscFv.这种差异可能 是由糖基化造成,也可能与单克隆抗体制备时,抗原 发生降解有关,还可能与大肠杆菌表达的HBscFv 末端融合有6×His纯化标签有关. 3结论与展望 早在1987年,Cregg等就尝试在pastoris’中 表达HBsAg…,国内学者也在不久前发表了在P. pastor/s中表达preS—HBsAg融合蛋白的研究结果,但 有关抗HBsAg小分子抗体的研究大都是基于大肠 杆菌表达系统.虽然最近有在转基因烟草[12]和 CHOll中表达此类重组抗体的报道,但尚未发现有 关P.pastoris中表达抗HBsAg单链抗体的报道.本 文在前期工作的基础上,对分泌表达HBscFv的P. pastor/s工程菌进行中试规模的发酵和纯化,获得了 较好的结果,目的蛋白表达量远较摇瓶培养结果高, 这为HBscFv的进一步研究和开发奠定良好基础. 结合HBscFv的活性测定结果可知,不同来源 (巴氏毕赤酵母,大肠杆菌)HBscFv的抗原结合活 性无明显差异,但这两种抗体自身的抗原表位或局 部外形可能存在某些差异,深入探讨这些差异对于 HBscFv及其它基因工程小分子抗体的研发至关重 要.如果酵母的糖基化对抗体的抗原性有显着影响, 则有可能需要换用其它更高等的表达系统.重组蛋 白的糖基谱研究可以采用糖基水解,质谱及其它波 谱学技术进行,这方面的工作正在进行中. 巴氏毕赤酵母是近年来应用极为成功的一种表 达系统,至2000年就有220多种蛋白在毕赤酵母中 表达?,多项研究报道的细胞密度(OD..)超过 400,外源蛋白表达量最高达22g/L?,若本研究的 HBscFv在将来被批准为产品,则可对工程菌的发酵 和纯化工艺进行二次优化,有可能进一步提高目的 蛋白产量. 参考文献: [1]VermaR,BoletiE,GeorgeAJT.Antibodyengineering: Comparisonofbacterial,yeast,insectandmammalianex— pressionsystems[J].JImmunolMethods,1998,216(1— 2):165—181. 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FermentationandPurificationofHBscFvfrom P.pastorisonPilotScale XiongShengXieQiu—lingWangYi-feiDengNingSuKuan—yuan .Bio—medicalResearchandDevelopmentCenter,JinanUniv.,Guangzhou510632,Guangdong,China; 2.CollegeofBioscienceandBiotechnology,JinanUniv,,Guangzhou510632,Guangdong,China; 3.CenterofInfectiousDiseases,the458thHospitalofPLA,Guangzhou510602,Guangdong,China) Abstract:Inordertoproducesolublerecombinanthumananti—HBsAgsingl e—chainFv(HBscFv)inpilotscale, recombinantP.pastorisexcretingHBscFvwasinoculatedina30一 Lfermentortocarryoutafed—batchculture.HB— scFvinthesupernatantwasthenpurifiedwithatwo—stepprocedure.namely. ion—exchangeandimmuno—affinity chromatography.Itisfoundthat,aftertheculturefor7days,thecelldensity(O D6o0)ofrecombinantP.pastoris andtheyieldoftargetproteinarerespectively334and260mg/L.Afterthepurification,HBscFviscollectedwith purityof95%andaproductivityof171mg/L.Theresultsofbioassaydemonstratethatthespecificactivityof HBscFvproducedbyP.pastorisis(2.52?0.17)I.zg,,withoutsignificantdiff erencefromthatproducedbyE? coli.. chainFv;P.pastor~;fermentation;purification Keywords:HBsAg;single—