以木质纤维为原料的产油微生物的筛选及特性研究

以木质纤维为原料的产油微生物的筛选及特性研究1.研究背景随着现代社会工业化程度的提高，人类所面临的能源和环境压力日益增大。为打破传统能源危机带给人类的束缚和危害，世界各国均大力发展可再生能源。近年来，人类所需的油脂总量仅仅靠植物油脂和动物油脂来提供已经出现了很大的问题，寻找其它油脂原料来生产人们所需油脂变得越来越重要。另外，伴随着价格日益攀升并且不可再生的资源石油的日渐枯竭，利用其它可再生资源生产能源就成了必然趋势。利用微生物产油这一新的研究方向日渐被众多的研究人员所关注。微生物油脂是制取生物柴油的优质原料，微生物油脂还含有对人体健康有利的多种不饱和脂肪酸，因此，在改善人类人体健康程度和医疗保健方面具有重要的开发和利用价值[1]。目前工业化生产生物柴油的原料主要以植物油为主，但原料成本占到总成本的70%～85%，经济可行性差[2]。那么，寻求能够低成本替代现行生物柴油的生产原料就变成了一个迫切需要解决的问题。产油微生物具有资源丰富、油脂含量高、碳源利用谱广等特点，开发潜力大，因此微生物油脂具有良好的发展前景，可能在未来生物柴油产业中发挥重要的作用。微生物油脂又称为单细胞油脂(SingleCellOil，SCO），是指由微生物在一定条件下合成并储存在菌体内的甘油脂，其脂肪酸组成与一般的植物油脂相似，主要是C16、C18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚麻酸等。某些微生物如细菌、酵母、霉菌、微藻能够利用碳水化合物、碳氢化合物或普通油脂作为碳源积累油脂，如果微生物油脂积累量超过细胞总量的20%，即被称为产油微生物(Oleaginousmicroorganisms)[3]。生物柴油即采用动植物油脂等原料（主要成分为脂肪酸甘油酯）与短链醇（主要是甲醇和乙醇）在催化剂（酸、碱和酶）或超临界的条件下，经过酯化和酯交换反应生成的脂肪酸短链酯。生物柴油因使用时环境污染物释放量少、使用安全、可生物降解等特性，成为当今国际新能源开发的热点。目前在世界范围内掀起了生物柴油的研发热潮，谁先拥有了这项技术必然抢占世界市场先机，造福于人类社会。于是先有美国的大豆生产生物柴油；后有东南亚地区的棕榈油生产生物柴油；远有欧洲各国，尤其是德国的菜籽油生产生物柴油；近有日本的餐饮废油生产就生物柴油[5-7]。中国油脂年产量约1440万吨，人均年消费约为8kg，远低于国际标准24kg的推荐量。我国的生物生物柴油产业不能够大范围发展的主要原因有，国内食用油现存量不能够满足现实所需，部分缺口需要以进口的方式进行补充[8]；而现实存在的地沟油等获取量不固定同时又存在地区局限性，给它们的充分利用带来了较大的困难，综上所述，生物柴油产油原料的开发和获取就成为了生物柴油产业中非常关键的核心问题。2.文献综述2.1微生物油脂的研究进展目前，国内外关于利用微生物生产油脂的报道现在主要集中在四个方面：一是从发酵工程的角度，通过优化发酵工艺来增加油脂产量：碳源、氮源的种类和碳氮比、接种量、发酵时间、培养温度、培养基初始pH值以及油脂提取方法等都对油脂的产量和油脂脂肪酸组成有很大影响[9]；二是通过诱变方法[10]或基因工程手段[11]得到或发现新的高产油脂的微生物；三是对产油微生物机理的研究：国际上关于产油微生物甘油三酯的合成和积累机理研究已经取得了巨大进展，例如已初步阐明AMP脱氨酶、ATP：柠檬酸裂解酶、苹果酸酶与甘油三酯合成积累的关系[12,13]等；四是利用各种廉价原料生产微生物油脂，以降低其生产成本。微生物细胞通常含有2%~3%的油脂，但经过选育，某些微生物的干菌体含脂量可达60%左右[14]，施安辉[15]等通过紫外诱变育种和优化摇瓶培养条件，通过培养后期补加碳源的方法培养，最终GLR513菌株油脂产量可达菌体干重的67.2%。刘淑君[16]等经紫外线和EMS复合诱变选育出一株高产油脂的优良酵母菌株，油脂产量5.9g/L；菌体生物量11g/L；油脂含量53.6%。刘玲[17]等对红酵母进行物理和化学诱变，对影响红酵母油脂合成的主要因素进行了研究红酵母的油脂含量可达43.6%。曲威[18]等以斯达氏油脂酵母LipomycesstarkeyiAS2.1560为出发菌株，经紫外线诱变选育出了一株高产油脂的优良酵母菌株L.starkeyiM36，通过摇瓶培养，对与菌体产油脂相关的因素进行了单因子试验，最后可得生物量24.2g/L；油脂量14.6g/L，测得菌体油脂肪酸组成分析结果如下：豆蔻酸0.5%，软脂酸35.2%，棕榈油酸4.3%，硬脂酸4.4%，油酸53.0%，亚油酸2.6%；李永红[19]等采用均匀 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 和单因子试验法，系统考察了圆红冬孢酵母菌（Rhodosporidiumtoruloides）在不同碳氮比条件下产油发酵情况以及添加无机盐对产油发酵的影响所得菌体油脂含量高达76.1%，脂肪得率系数可达22.7。孔祥莉[20]等了斯达氏油脂酵母Lipomycesstarkeyi2#利用葡萄糖-木糖混合糖为碳源生长和油脂积累特性、生物量和菌体油脂质量分数分别达19.0g/L和52.6%。王莉[21]等通过摇瓶发酵，考察了碳源浓度、氮源种类和浓度对发酵性丝孢酵母（Trichosporonfermentans）发酵产油脂的影响，对发酵产油脂条件的初步优化结果为菌体生物量为18.2g/L，干细胞的油脂含量为68.5%。林金涛[22]等为缩短发酵时间，减少原料消耗，采用细胞增殖和油脂积累分离的两阶段模式，培养圆红冬孢酵母RhodosporidiumtoruloidesAS2.1389生产微生物油脂。结果表明，细胞增殖阶段获得的R.toruloidesAS2.1389细胞，重悬接种在葡萄糖溶液中，可快速积累油脂，菌体油脂含量超过自身干重的55%。罗玉平[23]等分离到1株高产棕榈油酸的酵母，总脂中棕榈油酸质量分数高达50.14%，中科院大连化物所实验室筛选出的4株产油酵母能同时转化葡萄糖、木糖和阿拉伯糖为油脂，菌体含油量超过其干质量的55%。近年来，人类所需的油脂总量仅仅靠植物油脂和动物油脂来提供已经出现了很大的问题，寻找其它油脂原料来生产人们所需油脂变得越来越重要。另外，伴随着价格日益攀升并且不可再生的资源石油的日渐枯竭，利用其它可再生资源生产能源就成了必然趋势。2.2微生物油脂的优点与植物油脂相比，用微生物生产油脂具有许多优点[24,25]：1)微生物适应性强，生长繁殖迅速，生长周期短，代谢活力强，易于培养，方便基因工程改良；2)微生物产油脂占地面积小，不受场地限制，不受气候、季节限制，能连续大规模生产，比农业生产油脂所需劳动力低；3)微生物生长所需原材料丰富，价格便宜，除淀粉、糖类外，微生物还能利用农副产品、食品行业和造纸行业中废弃物，如乳清、糖蜜、废糖液、淀粉生产中产生的废料废液、亚硫酸、纸浆、木材糖化液等原料发酵，既可加强废物利用，又能保护环境。因此，利用微生物油脂生产生物柴油可望大大降低其生产成本，加快生物柴油的生产，促进其大规模工业化生产和广泛应用。研究微生物产油脂对于解决我国社会经济可持续发展的能源短缺、环境恶化等问题有重要的意义。2.3产油微生物的种类目前能够用来生产微生物油脂的微生物主要有细菌、真菌和藻类,其中以真菌中的酵母菌类和霉菌类的真核微生物居多。2.3.1产油细菌常见产油细菌有：嗜酸乳杆菌CRL640、混浊红球菌PD630、弧菌CCUG35308等。混浊红球菌PD630在葡萄糖或橄榄油中生长时，甘油酯中的脂肪酸含量占细胞干重的76%～87%[26]。弧菌CCUG35308脂肪酸主要为偶碳链脂肪酸，可用于EPA的生产研究中[27]。近年来在能够产多不饱和脂肪酸的深海细菌和极地细菌细菌的研究较多。对于产PUFA的细菌而言，PUFA的组成和含量受温度的影响较大，使培养温度降低，则PUFA产量相对提高[28]。2.3.2产油真菌霉菌因其油脂含量高，含有丰富的γ-亚麻酸、花生四烯酸等功能性多不饱和脂肪酸而被深入地研究。常见的产油霉菌有[29]：长被孢霉（Mortierellaelongata）、水霉（Saprolegnia）、轮枝霉（Diasporangium）、高山被孢霉（Moriterellaalpina）、毛霉（Mucor）、樟疫霉（Phytophthoracinnamomi）、小克银汉霉（C.unnighamella）等含有EPA、ARA，被孢霉（M.ortierella）、鲁氏毛霉（M.rouxianus）、卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）等菌种含有γ-亚麻酸（GLA）。畸雌腐霉（Pythiumirregulare）、长被孢霉（Mortierellaelongata）、终极腐霉（Pythiumultimum）、破囊壶菌（Thraustochytriumauneum）、头孢霉（Cephalosporium）等均含有EPA、DHA。1899年，PaulLindner发现产油酵母菌，即现在广为人知的美极梅奇酵母（Metschnikowiapulcherrima）[30]。酵母中产生的脂肪酸相对较集中，很大部分的酵母细胞只产生十六碳和十八碳的脂肪酸，软脂酸的含量相对较多，在酵母细胞中也含有相应的多不饱和脂肪酸，含量较高的有油酸，但亚油酸含量很少。常见的产油酵母菌有[31]：浅白色隐球酵母（Cryptococcusalbidus）、斯达氏油脂酵母（lipomyce）、弯隐球酵母（Cryptococcusalbidun）、粘红酵母（Rhodotorulagiutinis）、出芽丝饱酵母（Trichospironpullulans）、产油油脂酵母（Lipomyslipofer）、类酵母红冬饱（Rhodosporidumtoruloides）等，含油量可达菌体干重的35%~65%，是目前已知的油脂产量最高的酵母菌株。2.3.3产油藻类目前常见的产油藻主要是微藻。微藻的太阳能利用效率高、个体小、营养丰富、生长繁殖迅速、对环境的适应能力强、容易培养，因此受到人们的重视。另外，微藻中不但油脂含量可观，而且从微藻中提取的油脂成分与植物油脂相似，因此具有广泛的应用价值，它不仅可以替代石油作为生物柴油直接应用于工业上，还可以作为植物油脂的替代品[32]。目前国内外对微藻脂肪酸进行了大量的研究，但报道较多的是小球藻（Chlorellaps）、鞭金球藻（Isochrysisgalbana）、三角褐指藻等(Phaeodactylumtricornutum)[33]。美国国家可更新实验室（NREL）通过现代生物技术建成“工程微藻”，即硅藻类的一种“工程小环藻”。在实验室条件下可使“工程微藻”中脂质含量增加到60%以上，户外生产也可达到40%以上。清华大学缪晓玲的博士论文表明，通过异养转化细胞工程技术可以获得脂类含量高达细胞干重55%的异养藻细胞[34]。2.4微生物产生油脂机理及代谢调控微生物油脂的生物合成是一个非常复杂并且由多酶催化的过程，属于初级代谢的一部分。产生的油脂主要有甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)和磷脂，其中甘油三酯约占80%以上，磷脂约占10%以上。微生物产生油脂过程，本质上与动植物产生油脂过程相似，都是从利用乙酰CoA羧化酶的羧化催化反应开始，经过多次链的延长，或再经去饱和酶的一系列去饱和作用等，完成整个生化过程。微生物油脂的积累大体可分为两个阶段，发酵培养的前期为细胞增殖期，这个时期微生物要消耗培养基中的碳源和氮源，以保证菌体代谢旺盛和增殖过程。在这一阶段中细胞也合成油脂，但主要用于细胞骨架的组成，即以脂质体形式存在。当培养基中碳源充足而某些营养成分(特别是氮源)缺乏时，菌体细胞分裂速度锐减，微生物基本不再进行细胞繁殖，而过量的碳元素继续被细胞吸入，在细胞质中经糖酵解途径进入三羧酸循环，同时甘油三酯的积累过程被激活[35]。综合目前国内外的研究，油脂合成的机理主要可分为4个环节：乙酰-CoA的形成→脂肪酸的合成→脂肪酸碳链的延长和去饱和→甘油三酯的合成。2.5微生物的诱变育种微生物诱变选育的手段主要有基因工程诱变选育、物理诱变选育、离子注入诱变选育、化学诱变选育、原生质体融合诱变选育。其中基因工程诱变选育是近几年科学研究的重点和热点，采用生物工程技术，通过基因工程手段，构建带有一定功能的基因工程菌，使其高效的利用木质纤维产生更多的生物油脂，在此我们着重介绍基因工程技术以及基因工程菌的构建手段。基因工程[36]是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传DNA分子提取出来，在离体条件下进行“切割”，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得目的产物或性状。基因工程的主要过程包括以下几个步骤：（1）目的基因的获得，从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带目的基因的DNA片段；（2）选择载体，目前常用的载体有细菌质粒、入噬菌体(原核细胞)、SV40病毒(真核细胞)等；（3）目的基因与载体DNA的体外重组，在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并且具有选择性标记的载体分子上，形成重组DNA分子；（4）重组DNA分子进入受体细胞，将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖，这一过程也叫转移，受体细胞可以是微生物，也可以是动、植物细胞，目前应用最多的是大肠杆菌Escherichiacoli，在理想情况下，上述重组载体进入受体细胞后，能通过自主复制提供部分遗传性状；（5）筛选，从大量细胞繁殖群体中，筛选获得重组DNA分子的受体细胞克隆，且从这些筛选出来的受体细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用；（6）表达，将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类需要的蛋白质[37]。基因工程菌是指将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得的新物种菌。利用基因工程技术构建高选择性基因工程菌可以提高微生物生物强化处理技术，是现代微生物培养技术在废水处理领域的良好应用和扩展。2.6影响产油微生物合成油脂的因素微生物发酵产油脂大体分为两个阶段，即菌体增殖期和油脂积累期，发酵培养的前期为细胞增殖期，这个时期微生物要消耗培养基中的氮源，吸收利用蛋白质，以保证菌体代谢旺盛，接着菌体细胞分裂速度剧增，以消耗碳源为主，并合成积累大量油脂，这个时期为油脂积累期[38]。微生物高产油脂的一个关键因素是培养基的碳源充足。而其它营养成分缺乏，在这种情况下，微生物菌体不再进行细胞增殖，而是将过量的碳水化合物转为脂类。研究表明，不同种属的微生物其产油脂量、油脂成分及含量各不相同。而就同一种微生物菌株，在不同培养条件下，其产油脂量、油脂成分及含量也不尽相同。与此相关的培养条件主要有碳源、氮源、温度、PH值等，其中以碳源的影响为最大[39]。2.6.1碳源、氮源及培养基碳氮比的影响微生物细胞产生油脂可分为两个时期，即细胞增殖期和油脂积累期。微生物细胞处于生长过程中的两个时期对碳源和氮源之间的摩尔比有不同的要求。氮源的作用是给予微生物细胞提供生长所需的氮元素，使微生物细胞得以迅速增长，所以产脂发酵前期要控制较低的碳源和氮源之间的摩尔比，以获得大量的菌体细胞，产脂发酵时期要求较高的碳源和氮源之间的摩尔比，给菌体细胞提供大量的碳元素以积累更多脂肪[40]。氮源促进细胞生长，在严重缺氮条件下，可观察到细胞内脂类积累等。碳源充足而其他营养成分缺乏是高产油脂的一个关键因素。可以用来作为微生物细胞发酵产油脂的碳源较多，如五碳糖、六碳糖、糖厂废弃物、淀粉、纸浆、木材工业的废液均可作为发酵产脂的氮源。大部分实验证明微生物发酵产脂的最适宜氮源是葡萄糖。氮源主要有玉米浆、氨基酸、硝酸盐、氨盐及尿素。黄建忠[41]等人进行的不同氮源影响细胞油脂合成的实验表明，能够减缓油脂合成但是能够促进微生物细胞生长的氮源有NH4NO3、尿素，能够增加油脂合成但是对微生物细胞的生长有一定影响的氮源有蛋白胨、牛肉膏，既能够存进微生物细胞油脂合成又能够促进细胞生长的氮源是酵母膏。2.6.2无机盐和微量元素的影响根据相关资料可以得知，调整无机盐和微量元素在培养基中的添加量可以影响菌体的产油周期和含油量多少。相关研究表明[42]，若想使菌体含油量和油脂生成率大幅提高，可以采用调节培养基中的钠离子、钾离子、镁离子、硫酸根和磷酸根的添加量的方法。在相关利用斯达氏油脂酵母产油的试验中可以得知，增加产脂培养基中Fe3+的浓度，可以使菌体内的油脂含量在短时间内增加，在产脂培养基中添加Zn2+可以使菌体的油脂含量提高[41]。2.6.3温度的影响温度对菌体油脂的生成影响主要体现在：在菌体的最适温度下培养菌体产油可以使菌体内部很好的合成油脂，高于或者低于菌体的最适温度将不利于菌体内部优质的合成。产油菌体一般能够在25℃产油量达到最高。综合资料可以显示，菌体的培养温度可对菌体的含油量以及油脂的构成产生影响，在较低温度培养条件下，有利于提高菌体内部的不饱和脂肪酸含量。2.6.4pH值的影响产油微生物的最适pH随着菌体的不同而有所变化。如产油酵母菌的最适pH在酸性到弱酸性之间，产油霉菌的最适pH在中性到弱碱性之间，微藻的最适pH在中性到弱碱性之间。在pH值为酸性到中性之间的培养基中培养时，构巢曲霉的油酸含量伴随着pH的增加而同时增加[43]。若调节产油酵母的初始培养中的pH在7.0左右，在菌体稳定期可以测得菌体含油量相对达到最高。2.6.5培养时间的影响产油菌体的所属菌种类型以及菌体所处的菌体繁殖生长阶段决定了菌体生成油脂的最适生长培养时间。若培养时间达不到菌体最适培养时间，由于细胞总数量较少而导致油脂产量不足，若培养时间超过菌体最适培养时间，则可能出现培养基内菌体自溶现象，油脂散落到培养基中，回收困难导致油脂产量降低。黑曲霉的最适培养时间为3d、米曲霉的最适培养时间为7d、根霉的最适培养时间为7d、红酵母的最适培养时间为5d、酿酒酵母的最适培养时间为6d。产油酵母在菌体生长指数期菌体内部油脂累积量较少，处于指数生长末期菌体内部油脂累积量迅速增加，在进入稳定期后菌体内部油脂累积量达到最高[44]。2.6.6其它因素的影响在培养基中提供相对丰富的氧气有利于菌体内部油脂的生成。如果在对数生长期内培养基中的细胞数量过多，会由于培养基中营养成分相对缺乏而使油脂产量降低[45]。若细胞数量过少则导致菌体细胞内油脂含累积过多使细胞的增加速度降低。所以调整培养基中的细胞数量达到最适可以平衡细胞数量和油脂产量这两个关键环节。另外，乙醇、乙酸盐、乙醛、B族维生素、EDTA等物质的适当加入可以提高菌体的油脂产量。2.7木质纤维的研究2.7.1木质纤维素木质纤维素是地球上最丰富、最廉价的再生资源。有资料表明，全世界每年的植物体生成量高达1.55×1011吨干物质[46]。木质生物资源的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素(表1-1)[47]。其中，纤维素、半纤维素是可发酵糖的来源，含量占66%-79%(纤维质原料的绝对干重量)，纤维素经水解可生成葡萄糖，半纤维素经水解可生成木糖、阿拉伯糖、半乳糖等，糖进一步可生产燃料乙醇、木糖醇、有机酸、单细胞蛋白、糠醛、乙酞丙酸等工业产品[48]。我国是一个农业大国，若能把大量的农业纤维原料及工业纤维废料中的纤维素经济地、有效地水解成糖化液，并加以利用，这将有利于改善目前资源日益紧张，环境日益恶劣的状况，具有重要的经济和社会，既符合我国国情，又符合可持续发展战略。表1-1几种重要木质纤维素原料的组成木质纤维素原料纤维素(%)半纤维素(%)木质素(%)硬木40-5524-4018-25软木45-5025-3525-35玉米秸秆402517玉米芯453515麦秸秆305020水稻秸秆352512甘蔗渣402425草25-4035-5010-30一般来说，木质纤维素生物燃料（Lignocellulosicbiofuel）的生产过程主要包括三个步骤：首先收集不同木质纤维素生物质（Lignocellulosicbiomass），然后把这些生物质降解为各种可发酵的糖（预处理与糖化过程），最后通过不同的生物转化过程（微生物发酵）把这些糖转化为不同的生物燃料。随着全球能源危机愈发严重，寻找石油燃料的替代品迫在眉睫，因此利用木质纤维素生产生物燃料在过去几十年里一直都是研究的热点与重点。但是许多这些过程的研究仍都处于一个起始的阶段，例如现在的糖化与发酵技术仍然十分低效与不成熟等。2.7.2木质纤维素的水解木质纤维素原料通常需要经过水解才能被微生物所利用。一般地，木质纤维素中的纤维素与半纤维素成分首先会被降解为多聚糖，而随后这些多聚糖又被降解为相应的六碳糖或者五碳糖。水解效率决定了后续生物转化的成本。一般来说，木质纤维素的水解方法主要包括化学法与生物法两种。早期木质纤维素的水解主要使用化学法，尤其是稀酸法。但这些方法都会增加整个生物转化过程的成本。而且，对于木质纤维素中的纤维素成分，稀酸的水解效率很低，而纤维素成分的进一步水解，需要增加酸的浓度或者水解温度，但与此同时，水解液中的抑制剂浓度也会增加，导致所得水解液不能用于微生物发酵。为了减少水解过程中抑制剂的产生与提高对纤维素成分的水解效率，木质纤维素的水解更多地使用生物法。生物法水解以酶法水解为主，酶法水解主要指用纤维素酶催化的水解。影响酶法水解的因素主要有木质纤维素的孔径、结晶度、以及半纤维素与木质素的含量等[49]。半纤维素会减少底物的孔径从而减少纤维素被水解的可能性，而木质素则会保护纤维素不被水解从而限制水解的速率。因此，预处理在木质纤维素酶法水解中扮演着一个十分重要的角色，决定水解效率与成本。2.8利用木质纤维素水解液生产微生物油脂的研究现状如上所述，尽管木质纤维素水解液已经被运用在许多生物工程领域，有些工业产品，如燃料乙醇等已经工业化或半工业化，但利用木质纤维素水解液生产微生物油脂仍处于起步阶段。在国内，大连化物所的赵宗保最早提出用木质纤维素原料生产微生物油脂的设想[50]，并提出了合理的BM2BD（biomass-to-biodiesel）计划[51]，指出利用生物炼制产生物柴油主要包括三个步骤：1）把木质纤维素原料水解成可发酵的糖；2）选择合适的油脂微生物把糖转化成为微生物油脂；3）把微生物油脂转化为生物柴油。在这三个步骤中，木质纤维素的水解已经有超过30年的系统研究，许多技术已经十分成熟，部分技术也成功地产业化。而第三步油脂转化为生物柴油也经过了多年的研究，无论是化学法或者酶法，工艺与技术也十分成熟。因此，更多的研究的重点放在了筛选合适的油脂微生物上来。最近关于油脂微生物的研究中，研究较多的油脂微生物主要有：解脂亚罗酵母（Yarrowialipolytica）[52,53]，斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)[54]，粘红酵母（Rhodotorulaglutinis）[55]，圆红冬孢酵母菌（Rhodosporidiumtoruloides）[56]等，但这些微生物利用木质纤维素水解液发酵产油脂的研究却鲜有报道。木糖是木质纤维素完全水解后的水解液中仅次于葡糖糖的第二大成分，因此高效利用木糖是微生物高效利用木质纤维素水解液进行发酵的关键。尽管油脂微生物能广泛利用各种廉价原料生产微生物油脂，但很少能够高效利用木糖发酵。目前有报道可利用木糖的油脂微生物仅仅有斯达氏油脂酵母（Lipomycesstarkeyi）[54]与深黃被孢霉（Mortierellaisabellina）[57]等几种，因此，筛选出能高效利用木糖积累油脂的微生物菌株十分重要。一般来说，微生物先利用完六碳糖后再利用五碳糖，而如果通过筛选或者对已有菌株进行改造得到能同时利用葡萄糖与木糖积累油脂的菌株，则能大大提高糖利用率，进而提高油脂积累的效率。但对于一些能够同时利用六碳糖与五碳糖的菌株，木质纤维素水解液中的一些抑制剂如乙酸等也会影响其糖代谢，导致其无法同时利用这两种糖。由于缺少可高效利用木质纤维素水解液发酵产油脂的菌株，因此利用木质纤维素水解液产微生物油脂的研究仍处于初始阶段。只筛选到高效利用木糖积累油脂的微生物也不能保证其能高效利用木质纤维素水解液进行发酵，因为在木质纤维素水解液中除了各种可发酵的糖之外，还含有大量抑制剂，这些抑制剂会影响微生物的生理生化活性，抑制微生物生长与产物积累。因此，能够耐受一定浓度抑制剂也是油脂微生物能高效利用木质纤维素水解液积累油脂的另一个必要因素。不同的脱毒方法可以除去木质纤维素水解液中部分抑制剂，通过驯化或者菌种改造等方法可以提高微生物对木质纤维素水解液抑制剂的耐受性。研究抑制剂对微生物生长与产物积累的影响，能为水解液的脱毒与发酵过程中的参数优化提供理论基础，并为菌种改造提供方向。目前，关于木质纤维素水解液中抑制剂抑制机理的研究集中在一些产乙醇或者丁醇的菌株，而抑制剂对于油脂微生物的抑制机理却未见报道。因此，研究木质纤维素水解液中抑制剂对油脂微生物细胞生长与油脂积累的抑制规律与机理，对油脂微生物高效利用木质纤维素水解液发酵产油脂具有十分重要的意义。2.9以稻轩为原料利用微生物发酵生产生物柴油的研究现状利用稻秆产生生物柴油的主要过程是利用微生物产生的纤维素酶将纤维素分解为单糖,然后利用单糖从乙酰CoA接化酶催化梭化的反应开始,经过多次链延长,或再经过去饱和作用等完成整个生化过程。目前利用微生物分解稻杆生产生物柴油主要面临的问题主要有两点:首先是稻秆中的纤维素难以被降解。其次,目前国内外用于生产生物柴油的微生物一般不能利用木质纤维素生长,只能利用简单的营养物质(淀粉、葡萄糖等)生长发育,因此要想利用微生物分解稻秆产生微生物油脂,一般采用的是混合培养的方法,既先用能够分解木质纤维素的微生物对天然的木质纤维素进行分界处理,然后再加入产脂微生物,让其利用已经产生的单糖合成和积累油脂,此种方法因为要考虑到不同微生物的最适条件和不同微生物的接种比例等问题,较为繁琐和复杂。因此选取一种既能有效降解木质纤维素又有较强油脂积累能力的菌株是解决这一系列问题的关键。3本课题的研究意义、主要内容及技术路线3.1研究意义随着化石能源的不断枯竭，可再生利用资源得到原来越多的重视。寻找其它油脂原料来生产人们所需油脂变得越来越重要。生物柴油作为一种重要的生物能源，从上世纪90年代开始，产量逐年递增。目前生物柴油的生产主要集中在欧洲、美国、巴西、阿根廷，泰国等国。这些国家油料作物产量丰富，利用油菜籽、大豆、棕榈等原料可以大量生产生物柴油。但对于全球的大部分国家，由于微生物的培养占地少，不受季节、气候限制并能大规模生产，因此微生物油脂作为生物柴油的原料，比传统的植物油脂或者其它廉价油脂原料更具优势。我国国土广阔，具有丰富的自然资源。木质纤维作为地球上最普遍且廉价的自然资源，拟应得到广泛的重视与研究；我国又是个农业大国，若能把大量的农业纤维原料用作微生物产油的应用当中，必将从根本上改变我国在全球的能源地位，从原油进口大国转变为出口大国；并且可以改善目前的资源日益紧张及能源供需不平衡的问题。此外，对于保护环境降低污染有着积极的作用，具有重要的经济和社会效应，既符合我国国情,又符合可持续发展战略。3.2主要内容目前，对以木质纤维为原料产油微生物的研究主要集中在两个方面：一方面是从自然界中寻找出高产油微生物，以便进行人工驯化和培养，从而可以大规模用于生产和生活；另一方面利用基因工程技术培育出可以以木质纤维为原料高产油的工程菌，便于后续实验需要。鉴于此，本课题的主要内容是：（1）筛选出能够降解木质纤维原料（主要以秸秆粉末或木粉）的产油微生物（真菌为主，细菌为辅，种类仅限1-3株），并具有较高的产油量；（2）通过正交实验找出产油微生物的最佳培养及营养条件，如温度、pH、C/N比、溶解氧等；（3）对筛选出来并符合要求的产油微生物进行基因组测序找出高产油与分子生物学之间的关系，随后进行转录组测序，得到产油合成途径中酶系的组成。对于上述内容的“三步走”计划，我的设想是：①筛选阶段的产油微生物的来源可以从森林土壤、堆肥、污泥以及产油脂的树木中获得，当然需要考虑哪些环境最适合微生物产油，如堆肥表面、粪便表面和森林草原中腐朽的木材及枯草上可发现明显生长的白色或褐色等菌类、蘑菇或其它真菌；其次通过合适的筛选方法进行筛选、分离、纯化、培养及制备。这是该课题的最关键的一步，倘若筛选出高于已有文献产油量且未见报道的产油微生物，对于本课题的后续工作的顺利开展具有极大的帮助与支持。②在进行正交实验探寻最佳条件的过程中，需要找出影响微生物产油量的最关键因素，其创新点在于找到最佳条件产油量高于文献报道。③最后一步是对产油微生物的分子生物学研究，通过基因工程技术对基因组和转录组数据进行分析，其目的在于，探索基于高产油量下选定微生物的产油机理与已有文献中的产油机理的区别，由此得到新的产油途径。3.3技术路线4实验方法和手段4.1实验原料及产油微生物秸秆粉末或1-2cm的秸秆段；实验菌种来自堆肥、粪便和森林朽木中采集的菌种，以真菌为主，细菌为辅。4.2培养基及试剂PDA培养基(用于菌种的纯化培养)：去皮马铃暮200g，葡萄糖20g，琼脂15~20g，蒸馆水1000ml、pH自然。马丁氏培养基(用于真菌的分离):KH2P04lg，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖lOg，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml，l%孟加拉红水溶液3.3mL，l%链霉素0.3mL，pH自然。斜面保藏培养基：麦芽汁琼脂培养基。固体培养基(g/L)：酵母提取物10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g、琼脂粉18g、pH自然。苏丹黑B染色液：苏丹黑B0.5g，加入75%乙醇100ml，水浴加热使其充分溶解，待其冷却后过滤，得出的滤液即为苏丹黑B染色液。试剂：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、酵母粉、蛋白陈、琼脂、KH2PO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、硫酸、硝酸、无水乙醇、冰醋酸、3,5-二硝基水杨酸、NaOH、4.3仪器设备超净工作台、酒精喷灯、高压灭菌锅、分析天平、电热恒温鼓风干燥箱、冰箱、高速离心机、生化培养箱、恒温摇床、高效液相色谱仪、可见分光光度计、紫外可见分光光度计、气相色谱仪、电泳仪、DNA测序仪、PCR扩增仪等。4.4实验方法4.4.1真菌的培养挑取保存于斜面的少量菌丝或抱子，于PDA斜面培养基上28℃培养3-5d，直至长出大量抱子。用无菌水冲洗斜面上的抱子并用移液枪分别吸取50µl接入50ml的液体种子培养基中，于28℃，180r/min振荡培养24h。然后将种子液按10%的比例接种到装有发酵培养基的25Oml三角瓶中，三角瓶装液量均为为100ml，于28℃，180r/min振荡培养144h。4.4.2真菌的分离纯化釆用梯度稀释平板涂布法称取10g的腐木,置于装有90ml无菌水的250ml锥形瓶中。将锥形瓶放入220r/min的振荡箱中振荡30min，取出后，静置1min，此时制得的浓度是10-1的菌液，然后用移液枪吸取1mll0-1的菌液加入9ml无菌水中，从而得到10-2的菌液，由此重复操作，依次可得10-3-10-5的菌液。然后用移液枪将稀释好的10-2-10-4浓度梯度菌液吸取0.lml稀释液，接种于己经倒好的马丁氏培养基中，用涂布棒涂布菌液，使其在培养基表面均匀分布，每一浓度梯度设置3次重复。接种后的平板倒置于恒温培养箱中28℃培养3-5d。将长出的单菌落转接到PDA培养基上28℃培养，菌种长出后再次转接，2-3次之后转接到PDA斜面上保存备用。4.4.3真菌的筛选对检出的各种形态的菌落进行初筛和复筛以选出高产菌株。初筛：苏丹黑染色后镜检出脂肪粒大且多的菌落，同时将该菌保存于斜面培养基。对培养皿和将要涂片的菌落进行一对一标号，防止发生错误。复筛：在初筛的基础上，将脂肪粒大的菌落的斜面以三环的接种量接入100ml产脂培养基，于30℃的恒温摇床上培养4d，检测其生物量(g/L)、油脂产量(g/L)，筛选出两者均较大的菌株。菌体生物量的测定：取50ml发酵培养液放于100ml离心管内，通过4500r/min离心10min，收集菌体并在65℃下干燥至衡重，准确称取干菌体重量。生物量(g/L)=干菌体(g)/发酵液(L)4.4.4菌体油脂的提取将烘干的菌体用蒸馏水润湿，按每克湿菌体加入5ml4mol/LHCl，振荡混匀后室温放置30min，于100℃水浴处理10min后迅速冷冻，加入10ml氯仿：甲醇=1:2提取液，振荡2min，再加入1ml氯仿，振荡混匀，加1.5mlH2O，振荡混匀后5000r/min离心5min，取氯仿层，加等体积0.1%NaCl溶液，5000r/min离心5min，萃取氯仿层，用已知质量的接收瓶收集氯仿层，并用氯仿冲洗分液漏斗3次，在旋转蒸发仪上蒸去氯仿即得油脂，计算油脂产量(g/L)和油脂含量。4.4.5遗传稳定性实验将复筛的菌株接种至斜面培养基，连续传代6次，分别用摇瓶发酵后测其油脂产量，若油脂产量无显著变化，说明其遗传性状稳定。5本研究的难点与解决 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 5.1本研究的难点实验过程中遇到的困难可能有：1）无法筛选出符合条件的产油微生物；2）即使筛选出符合条件的产油微生物，但无法到达超过现有文献记载的产油量；3）找到了最佳条件，但无法通过该条件提高微生物利用木质纤维的产油量；4）在对其进行分子生物学研究中，很难判断产油机理是否与现有文献记载的相同。5.2解决方案若在长达六个月的筛选过程中，无法分离出令人满意的产油微生物，应当改变既定方案，在阅读大量文献的基础上，可以从相关机构直接购买纯种菌种，用于后续实验的需要。若分离出产油微生物，但其在利用木质纤维产油的量上无法到达预期的效果，应该考虑可以改变其生长和营养条件，来促使其高产油；或对其进行基因工程的研究，找出限制其产有的遗传密码子，通过分子生物学技术，构建基因工程菌，以期达到高于现有产油量的水平。在进行正交试验时，无法判断哪个因素是最关键的，因此必须另辟蹊径，换一个角度考虑需找最关键因素；其次在找到关键因素的情况下，改变关键因素无法提高产油量，可以同时改变两个因素，通过协同作用来提高微生物的产油量。6实验计划与经费估计6.1实验计划2014.9-2015.3：产油微生物的筛选，找到符合要求的菌种；2015.3-2015.7：产油微生物特性的研究，找到指定菌种的生长及其高产油的最适条件；2015.7-2016.3：对产油微生物进行分子生物学研究；2016.3-2016.7：论文的数据整理和完善。6.2经费估计1-2万元左右参考文献[1]赵宗保.加快微生物油脂研究为生物柴油产业提供廉价原料[J].中国生物工程杂志,2005,25(02):8-11.[2]Cheol-MinGhim,TaesungKim,RobertJ.Mitchell.SyntheticbiologyforbiofuelsBuildingdesignermicrobes[J].BiotechnologyandBioprocessEngineering,2010,15:11-21.[3]RatledgeC.Regulationoflipidaccumulationinoleaginousmicro-organisms[J].BiochemicalSocietyTransactions,2002,30:1047-1050.[4]JaeGuPan,JoonShickRhee.Massandenergybalanceforanalysisofoleaginousyeastgrowth[J].KoreanJ.ofChem.Eng.,1985,2(1):81-85.[5]刘宏娟,张建安,墨玉欣等.利用微生物油脂制备生物柴油[J].化学反应工程与工艺,2008,24(03):263-266.[6]易绍金,郑义平.产油微生物的研究及其应用[J].中外能源,2006,11(02):90-93.[7]E.MolinaGrima,A.RoblesMedina.Comparisonbetweenextractionoflipidsandfattyacidsfrommicroalgalbiomass[J].JAOCS,1994,71(9):955-959.[8]张中义,柴秋儿,晁文等.微生物催化制备功能性油脂——共轭亚油酸的研究[J].粮油加工，2006(05):48-49.[9]PapanikolaouS.,KomaitisM.,AggelisG.Singlecelloil(SCO)productionbyMortierellaisabellinagrownonhigh-sugarcontentmedia[J].BioresourceTechnology,2004,95(3):287-291.[10]黄建忠,施巧琴.深黄被孢霉高产脂变株的选育及其发酵的研究[J].微生物学通报,1998,25(004):187-191.[11]TakenoS.,SakuradaniE.,TomiA.,etal.Transformationofoil-producingfungus,Mortierellaalpina1S-4,usingZeocin,andapplicationtoarachidonicacidproduction[J].JournalofBioscienceandBioengineering,2005,100(6):617-622.[12]RatledgeC.,BowaterM.D.V.,TaylorP.N.CorrelationofATP/citratelyaseactivitywithlipidaccumulationindevelopingseedsofBrassicanapusL[J].Lipids,1997,32(1):7-12.[13]RatledgeC.,WynnJ.Thebiochemistryandmolecularbiologyoflipidaccumulationinoleaginousmicroorganisms[J].AdvancesinAppliedMicrobiology,2002,51:1-44.[14]杨虹,林娟,欧阳瑞珍.产脂微生物的育种[J].福州大学学报(自然科学版),1997,25(05):104-106.[15]施安辉,谷劲松,刘淑君等.高产油脂酵母菌株的选育、发酵条件的优化及油脂成分分析[J].中国酿造,1997,(04):10-14.[16]施安辉,谷劲松,刘淑君等.粘红酵母GLR_(513)产油脂条件[J].生物工程学报,1998,14(02):203-232.[17]刘玲,金雨.红酵母产油脂诱变育种及发酵条件的研究[J].粮食与食品工业,2005,12(06):17-20.[18]曲威,刘波,吕建州等.高产油脂斯达氏酵母菌株的选育及摇瓶发酵条件的初步研究[J].辽宁师范大学学报(自然科学版),2006,29(01):88-92.[19]李永红,刘波,赵宗保等.圆红冬孢酵母菌发酵产油脂培养基及发酵条件的优化研究[J].生物工程学报,2006,22(04):650-656.[20]孔祥莉,刘波,赵宗保等.斯达氏油脂酵母利用混合糖发酵产油脂[J].生物加工过程,2007,22(02):36-40.[21]王莉,孙玉梅,刘英新等.发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans)发酵产油脂的研究[J].工业微生物,2007,37(01):39-42.[22]林金涛,沈宏伟,张泽会等.圆红冬孢酵母两阶段培养法生产微生物油脂[J].生物工程学报,2010,26(07):997-1001.[23]罗玉萍,杨荣英,陈英等.酵母油脂的脂肪酸组成的研究[J].中国粮油学报,1994,9(03):44-48.[24]吴时敏.功能性油脂[M].中国轻工业出版社,2001.[25]LuqueR.,LovettJ.C.,DattaB.,etal.Biodieselasfeasiblepetrolfuelreplacement:amultidisciplinaryoverview[J].Energy&EnvironmentalScience,2010,3:1706-1721.[26]薛飞燕,张栩,谭天伟.微生物油脂的研究进展及展望[J].生物加工过程,2005,3(01):23-27.[27]邓张双.PUFAs真菌选育及营养生理研究[D]:华中科技大学,2005:21-42.[28]张燕鹏.γ-亚麻酸发酵工艺及其油脂提取技术[D]:华中农业大学,2007:13-43.[29]朱巍.γ-亚麻酸生物合成工艺的研究[D]:浙江工业大学,2006:3-46.[30]胡芳华,殷福珊.产油酵母菌——可再生油脂的潜在资源[J].日用化学品科学,2009,32(04):12-13.[31]孟祥梅,张杰,陈雷等.生物柴油研究现状和发展方向[J].煤气与热力,2009,29(02):19-22.[32]RattrayJ.BiotechnologyandthefatsandoilsindustryAnoverview[J].JournaloftheAmericanOilChemistySociety,1984,61(11):1701-1712.[33]蒋霞敏,郑亦周.14种微藻总脂含量和脂肪酸组成研究[J].水生生物学报,2003,27(003):243-247.[34]缪晓玲.藻类可再生能源的利用及藻细胞抗环境胁迫的研究[D].2004.[35]RatledgeC.Thebiochemistryandmolecularbiologyoflipidaccumulationinoleaginousmicroorganisms[J].AdvApplMicrobiol,2002,51:1-51.[36]张兰英,刘娜,孙立波等.现代环境微生物技术[M].北京:清华大学出版社,2005.[37]冯玉杰.现代生物技术在环境工程中的应用[M].北京:化学工业出版社,2004.[38]费栓琴.微生物油脂进展[J].西部粮油科技,1998,(2):23-24.[39]徐华顺,罗玉萍,李思光,等.微生物发酵产油脂的研究进展[J].中国油脂,1999,24(2):34一37.[40]R.JulianDavies,JaneE.Holdsworth.TheeffectoflowoxygenuptakerateontheattyacidprofileoftheoleaginousyeastApiotrichumcurvatum[J].ApplMicrobiolBiotechnol,1991,34:832-833.[41]马丽娟,邢大辉,王红蕾等.培养条件对产油微生物生长的影响[J].生物工程学报,2009,25(01):55-59.[42]王萍,张银波,江木兰.多不饱和脂肪酸的研究进展[J].中国油脂,2008,(12),26-29.[43]殷梦华,江木兰,何东平等.微生物多不饱和脂肪酸的生物合成、调控和利用[J].中国油脂,2007,32(01):56-58.[44]HuangChao,ZongMin-hua,WuHong等.MicrobialoilproductionfromricestrawhydrolysatebyTrichosporonfermentans[J].BioresourceTechnology,2009,100(19):4535-4538.[45]ChristopherA.Boulton.Cryptococcusterricolus,anoleaginousyeastre-appraised[J].ApplMicrobiolBiotechnol,1984,20:72-76.[46]张继泉,王瑞明,孙玉英.利用木质纤维素生产燃料酒精的研究进展[J].酿酒科技,2003,(115):39-42.[47]赵律,李志光,李辉勇,等.木质纤维素预处理技术研究进展[J].化学与生物工程,2007,24(5):5-8.[48]宋湛谦.生物质资源与林产化工[J].林产化学与工业,2005,25:10-14.[49]PalonenH.,ThomsenA.B.,TenkanenM.,etal.Evaluationofwetoxidationpretreatmentforenzymatichydrolysisofsoftwood[J].AppliedBiochemistryandBiotechnology,2004,117(1):1-17.[50]ZhaoZ.Towardcheapermicrobialoilforbiodieseloil[J].ChinaBiotechnology,2005,25(2):8-11.[51]ZhaoZ.K.BM2BD:Towardsasustainablebiodieselindustry[J].JournalofBiotechnology,2008,136S402.[52]PapanikolaouS.,AggelisG.LipidproductionbyYa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