板种细胞问题(不均匀)

细胞不均匀的问题原因：1.培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，建议多加液体2.接种后不要摇晃，传统的思想认为摇一摇能使细胞均匀，但是事实上在摇晃的时候由于剪应力等多种因素的影响，细胞反而分布不均。解决 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ：1)接种到培养瓶的细胞，轻轻地让细胞悬液流遍整个瓶底；2)接种到培养皿或者培养板的细胞，用枪头对准中央加，让细胞悬液自行流遍整个孔，若有少量区域未能覆盖到细胞悬液，可用枪头轻轻牵引悬液，千万不要摇。细胞悬液铺满后，不宜立刻放入孵箱中，我一般静置>15min，这样接种的细胞很均匀。3)培养皿划“十”字交叉轻轻混匀（力度不易太大，否则剪切力损伤细胞），重复一次。轻轻放入孵箱即可。（1）平底和圆底（U型和V型）培养板的区别和选择：贴壁细胞一般用平底培养板。悬浮型细胞的培养一般用V型。U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞。V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。（2）细胞培养常见问题与解答问：我看到培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格，但不知道到底什么实验用哪种规格。答：要根据你具体的实验要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，细胞爬片一般用24孔等，要具体根据你实验来定。问：我想测吸光度用酶标仪，用多孔细胞培养板行吗？请问酶标板多孔细胞培养板有什么区别？答：用多孔细胞培养板测吸光度肯定可以拉，我们经常用它来做样品的蛋白定量和MTT检测。区别：酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，但也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不能用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量：不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2-3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体（氧气）交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。（3）细胞培养板的密闭和污染问题问：96，24孔培养板或培养皿的盖子都很松，这样是方便了透气，但是细菌、霉菌等污染物会不会也随着溜进去呢？答：1.盖子很松，属于半开放培养，这样的目的是透气（实际上是为了使培养皿外的co2能够与培养皿充分交换，维持培养基的pH值）。2.凡事有利必有弊，这样当然增加了污染的可能性。此外这样还会使培养皿内的液体蒸发，这对于精确定量的药物来说就显得值得注意了。所以以下二条措施是必须的a培养箱内空气必须清洁（定期紫外线照，酒精擦洗，尽量少开关培养箱）b培养箱内的湿度必须始终保持为100%（培养箱内放置无菌蒸馏水的水槽）。就好像培养皿，也是一个盖倒扣的容器，也不会污染。主要是因为盖子“L”型边缘产生气流负压的缘故，灰尘上面才附着有微生物，而气流携带的灰尘是无法通过产生负压的盖边缘的。而透气作用只是通过空气的扩散，不会产生气流，所以只会透气不会透菌。问：我使用24孔板，在其中的某些孔中有操作（在超净台内），而其它孔中还有细胞要培养.我很担心这样会污染，不知道要注意什么?在超净台内如果操作 规范 编程规范下载gsp规范下载钢格栅规范下载警徽规范下载建设厅规范下载 的话应该可以的，我想你可以充分利用培养版的盖子，尽量只暴露要操作的孔，将其它孔用盖子盖起来。这是我的一点粗浅的见解，抛砖引玉吧！使用前综合考虑一下，充分使用所以的孔；如果只需要使用少数的孔可以只用一边的，其余用盖子盖住，我习惯于先用右侧的孔（右手加样方便）。其实自己感觉只要注意无菌操作，一般是不会污染的。操作时用几块玻片把板子一侧垫高，不要把盖子全打开，一般没问题。（4）细胞分布不均及解决办法问：我的细胞接种培养板，细胞总是聚集在周边部分，该如何处理啊？我看园子里有的战友的细胞却是聚集在中间，是不是板子的质量问题啊？答：请问你的细胞是如何混匀的？是滴管吹打还是振荡培养板？如果是后者，而且是转圈摇匀的话，很有可能由于离心力的作用使细胞甩到周边部分，导致细胞中间少，四周多！自己可是试试！周边一般是相对会多一点，但是中间的数量也不会很少啊~~铺板的时候我也没有特异去振荡培养板。大概是板子的质量问题吧或者是不是铺板时候的细胞密度太低了？我用的corning的板。一个好办法：在你培养种板之前，把培养板放入培养箱里进行几个小时的饱和后再取出，种入细胞时力量要轻，可采取用滴头在培养板孔的侧面慢慢加入让细胞悬液流入板孔中，培养的细胞基本是均匀生长。记住千万不要用振荡器振荡，否则你的细胞就会想你说得那样聚积在一起。我今天把培养板放入培养箱里几个小时，适当的把细胞密度加大了一下，另外多加了一点培养液，今晚看细胞铺的挺好的。我认为有两种可能解决你问题的办法:1.加入前吹打均匀;2.从多孔板侧边或底边缓慢加入。问：我在做原代培养时也遇到过这种情况，我一直以为培养皿铺胶不均匀会导致这种现象，因为混匀的血管段加入到培养皿中时，在相差显微镜下血管段均匀分布在培养皿中，24h后贴壁的血管段就是周边多，中间相对少些。下次我要试试hkqu战友的方法看能否改变这种现象。答：这种现象很正常呀，不知你仔细观察过没有，孔直径愈小，这个现象越明显，我试过，24、96孔板这种现象不可避免，因为液体的附壁使得孔内培养液不是成一个液平面，而是周边高，就像凹镜一样，而使用这两种孔板由于需要加干预等原因而不能加足量培养液，使得细胞随培养液一起出现“边集”现象，如果为了使孔中央也有均匀细胞而增加接种细胞数量的话，这要看你需要观察何种指标，如果是MTT，免疫组化的话会因为细胞成层而影响结果。（5）6孔板接种和换液问题：问：我的细胞传代很正常，但一种到六孔板里（不管加药和对照），总有两三个孔（随机）细胞长得不好，很小，像破碎了。有人遇到过这种情况吗？到底是啥原因呢？请各位指点答：可能跟你加液的温度有关。如果你细胞刚刚拿出来换液加液，培养基也是从4度冰箱拿出来不久，很容易细胞就会冻死了。建议你最好把培养基先在培养箱里边孵育15min先。另外，跟你细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。或者放在37度水浴锅里孵育也可以，或者是培养板本身的问题，你再换换其它培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了，种板时的血清浓度调高试一下问：最近几天，我用六孔培养板接种细胞，培养24小时后更换培养基，在更换培养基之前，显微镜观察到细胞贴壁，状态非常的好，更换了培养基后，立即用显微镜观察，发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小，产生大量的碎片，而另一半的细胞一切正常，异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭，上半个圆是好的，下半个圆就不好，这是怎么一回事？答：你可以看一下是不是培养板没放水平。有一回我也出现过这种情况。你的培养液如何，如果培养液过期，细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。我也经常碰到，我想可能是板的问题，换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。不知楼主所需换液的培养板多不多，换培养基的时候如果没有注意风机的影响，特别是所需换液的培养板很多时，容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此，换液时应该逐个培养板进行，别怕浪费吸管，注意操作的效率！（6）24孔板接种问题：问：把细胞消化接种到24孔板之后，已经四天了，老是每孔的中间部分长不满，每天换液时都用PBS清洗，第二天换液时都出现同样的情况，每孔的边缘长的很好，中央大量死细胞？答：我是选择孔内铺盖玻片，在玻片上种植。每次换液都用PBS洗，必要的步骤吗？另外，也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关？我想你的培养液可能加的太少了。由于表面张力的作用，培养板的边缘液体会向上走，造成培养液面呈现一个凹面（就像量筒的液体凹面一样），中央的细胞正好在凹面的最低处，培养液少，细胞的营养不够，甚至干涸掉，空气中的氧气也会造成损伤，即使有增值过来的细胞也会死掉。另外，检查一下培养箱底部的水是否少了，如果少了，箱内的空气湿度不够，会造成培养液挥发加快，这样即使刚加的液体不少，过一段时间，由于蒸发，液体量会减少，造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度，造成渗透压过高。个人经验认为这是物理问题:24孔板小，细胞接种进去后是很难摇均匀的，结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况.至于中间较多死细胞，如果是悬浮状的话，也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞，似乎对摇均匀细胞有一定效果.在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意，不要把培养基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成细胞干涸，这样的话细胞会很快死亡。我有一段时间总是遇到这个问题，一个板子中总有一两个孔出现细胞大量死亡，后来发现是上面的原因。现在我做的时候如果必须把液体吸干，我会一个一个空来吸取，最多一次不超过3孔，然后马上加入液体，同时在作转染时，我会在吸液和加液时将风机关掉，这样基本上会避免细胞死亡。同时你所说的细胞周围密而中间稀疏，大约有如下原因：1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。细胞分布均匀与否有一点很关键，即每种细胞是有个体差异的，别人的细胞操作不一定适合于你.所以要靠自己摸索，且找出专属于自己细胞的一套规律，有如下经验：1.所有待接种的细胞悬液在种板前一定要用吸管混匀。2.按资料记载，24孔板的液体量为1ml，个人也觉得1ml的量足矣。3.接种时，要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头，这样做对细胞均匀分布有一定效果。4.接种后最好直接放入培养箱让细胞适应培养板这个新的环境，个人认为没有必要在室温放置一段时间。5.根据细胞的特性，细胞均喜欢聚集在边缘生长，所以我考虑到，你的问题还有可能是接种时的细胞密度不够，导致周边密集，中间稀疏的错觉。你的拌种密度是多少？另"要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头"的意思就是:加样不能太快，避免细胞在一个加样处聚集，且注意在不同的部位进行加样，即边加边活动枪头，人为使细胞趋于均匀分布，我个人觉得有一定的效果，不知这次我解释清楚没有