烟碱降解菌SCUEC2菌株的分离及其降解特性

烟碱降解菌SCUEC2菌株的分离及其降解特性 李 阳１，杨振飞１，马婷婷１，陈 涛２，龚传清２，李永辉２，李晓华１ （１．中南民族大学生命科学学院／生物技术国家民委重点实验室，武汉 ４３００７４；２．湖北省烟草公司襄阳市公司，湖北 襄阳 ４４１００３） 摘要：以烟碱为惟一碳源，从湖北省襄阳市烟草种植土壤中分离得到１株烟碱降解菌，为蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）ＳＣＵＥＣ２。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ时，发酵１０ ｈ后烟碱降解率达到８８．８０％。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，烟碱质量浓度为６．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８２．５９％；烟碱质量浓度为７．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率和菌株生长呈下降趋势，烟碱降解率为１８．９４％。ＳＣＵＥＣ２菌株发酵液经ＨＰＬＣ检测，结果显示，烟碱的保留时间为５．２５ ｍｉｎ左右，在培养到１６ ｈ时，烟碱峰峰面积明显减小，并在保留时间为１１．７９ ｍｉｎ左右处出现一个新色谱峰，表明有中间代谢产物产生。 关键词 ：烟碱；生物降解；蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）；降解特性 中图分类号：Ｑ９３９．１１＋２；Ｓ５７２；Ｓ１５４．３ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）07－1586-04 DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.07.013 烟碱俗称尼古丁（ｎｉｃｏｔｉｎｅ），是烟草中的主要生物碱。烟碱对人体有害，很容易被人体吸收，是吸烟上瘾的主要物质，会引起人体的心血管疾病［１］。烟碱易溶于水，在烟草种植和香烟生产上很容易造成固体和液体的高浓度污染，严重污染环境和威胁人类健康。欧盟已将每千克烟碱含量超过５００ ｍｇ的烟草废弃物规定为“有毒有害物”，其他一些国家也规定了各自相应的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ［２，３］。因此，烟碱降解成为迫切需要解决的问题，而利用微生物降解烟碱是一种低成本、高效率且对环境影响小的方法［４］。近年来，微生物降解烟碱的研究受到关注，降解烟碱的微生物主要有嗜烟碱节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ）［５－８］、假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）［３，９－１３］、中间苍白杆菌（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）［１，１４］、土壤杆菌属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）［１５－１７］、红球菌属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）［１８］、米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）［１９］等。本研究从湖北省襄阳市烟草种植地土壤分离出１株新菌株蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ），具有较高的降解烟碱性能，通过对其降解性能进行研究， 旨在为降低烟叶和烟厂废弃物中烟碱含量提供依据。 １ 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 １．１ 材料 １．1．１ 样品 土壤样品采自湖北省襄阳市烟草种植地土壤。 １．1．２ 培养基 烟碱培养基：１３．３０ ｇ Ｋ２ＨＰＯ４，４．００ ｇ ＫＨ２ＰＯ４，０．１０ ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．００ ｇ酵母粉，１０．００ ｍＬ微量元素（１．００ ｇ ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，０．４０ ｇ ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ，０．２０ ｇ ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．２０ ｇ ＣｕＣｌ２·２Ｈ２Ｏ，０．０２ ｇ ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ，用０．１０ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液溶解定容至０．１０ Ｌ），用去离子水定容至１．００ Ｌ，自然ｐＨ。高压蒸汽灭菌后，加入一定量烟碱（用０．２２ μｍ滤膜过滤）。烟碱分离培养基：烟碱培养基中加入１．８％的琼脂。种子培养基：１０．００ ｇ胰蛋白胨，５．００ ｇ酵母浸粉，１０．００ ｇ ＮａＣｌ，先溶于０．９０ Ｌ去离子水，用５．００ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液调ｐＨ至７．００，再用去离子水定容至１．００ Ｌ。培养基１２１ ℃高压蒸汽灭菌２０ ｍｉｎ。 １．１．３ 主要试剂和仪器 烟碱（纯度≥９８％） 购自洛阳天科生物工程有限公司；ＵＶ－６１００ＰＣ紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００高效液相色谱仪（美国戴安公司）；ＨＺ－９２１１Ｋ空气恒温振荡器（太仓市华利达实验设备有限公司）；ＣＲ２２Ｇ高速冷冻离心机（日本日立公司）。 １．２ 烟碱降解菌的分离 称取２．００ ｇ土壤样品于２０．００ ｍＬ烟碱培养基，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养。用０．９０％生理盐水梯度稀释，涂布于烟碱分离培养基，于３０ ℃培养，挑取菌株划线分离纯化。分别将纯化的菌株接入烟碱培养基中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，测定发酵液中烟碱质量浓度。 １．３ 烟碱培养基中烟碱质量浓度的测定 将菌株接入烟碱培养基中，于３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，用不接菌的烟碱培养基作空白对照（ＣＫ）。发酵液在１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ条件下离心５ ｍｉｎ，上清液用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液稀释到合适的吸光值范围。以０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ 溶液作参比，测定发酵液在紫外光波长为２５９ ｎｍ处的吸光值。烟碱降解率的计算公式为： 烟碱降解率＝（原培养液中烟碱质量浓度－发酵液中烟碱质量浓度）／原培养液中烟碱质量浓度×１００％ １．４ 菌体生长量的测定 将菌株接种至烟碱培养基中，在３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ条件下摇床培养，定时取样，采用分光光度法测定菌体的生长量和烟碱降解率，菌体生长量用Ｄ６００ ｎｍ表示。 １．５ 静止细胞的制备 将菌株接种于种子培养基中，在生长对数期转接到含有烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ的烟碱培养基中，生长对数期离心菌体并用ｐＨ ７．００的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４缓冲液洗３次备用［１２］。 １．６ 发酵液的ＨＰＬＣ检测 用０．２２ μｍ的水相膜过滤发酵液，ＨＰＬＣ检测，检测条件为：波长为２５９ ｎｍ，色谱柱为Ｃ１８柱（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ），流动相为甲醇（色谱纯）∶１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４＝２５∶７５（Ｖ／Ｖ），流速为０．５０ ｍＬ／ｍｉｎ，柱温为３０ ℃，进样量为２０．００ μＬ。 ２ 结果与分析 ２．１ 烟碱降解菌的分离与烟碱的测定 用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液将纯烟碱配制成浓度为５．００ ｇ／Ｌ的工作液，分别取工作液０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５和０．０６ ｍＬ，用０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液定容至１０．００ ｍＬ，以０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶液为参比，测定不同浓度烟碱溶液在２５９ ｎｍ处的吸光值。结果显示，烟碱浓度在０．００５～０．０３０ ｇ／Ｌ范围内时，吸光值（ｙ）与烟碱浓度（ｘ）呈正相关，线性回归方程为ｙ＝３５．０１４ ２９ ｘ＋０．０００ ０７，ｒ＝０．９９９ ９５。 将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株以５％的接种量接种至烟碱培养基，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养１０ ｈ，进行降解烟碱能力的测定，结果（图１）显示，未接种的烟碱培养基（ＣＫ）在２５９ ｎｍ处有吸收峰，而经ＳＣＵＥＣ２菌株培养１０ ｈ后，２５９ ｎｍ处吸收峰降低，表明ＳＣＵＥＣ２菌株具有烟碱降解能力。 ２．２ 烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株的烟碱降解率与生长量的关系 将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株以５％的接种量接种至烟碱培养基中，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，取样测定并计算发酵液的烟碱质量浓度和菌体浓度。结果（图２）显示，随着ＳＣＵＥＣ２菌株的生长，烟碱不断被降解，１０ ｈ后 ＳＣＵＥＣ２菌株生长量达到最大，此时降解率达８８．８０％，表明烟碱降解率和菌体生长量呈正相关。 ２．３ 烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株对烟碱的耐受性 将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株以５％的接种量接种至烟碱培养基中，烟碱质量浓度分别为５．００、６．００和７．００ ｇ／Ｌ，在３０ ℃下、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，取样测定并计算发酵液的烟碱降解率和菌体浓度。结果（表１）显示，烟碱质量浓度为５．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８０．８４％；烟碱质量浓度为６．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８２．５９％；烟碱质量浓度７．００ ｇ／Ｌ时菌株生长被抑制，烟碱降解率呈下降趋势，烟碱降解率为１８．９４％。 ２．４ 温度对烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株烟碱降解率和菌体生长量的影响 将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株以５％的接种量接种至烟碱培养基中，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ，分别在２０、２５、３０、３７和４２ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养１２ ｈ，取样测定并计算发酵液的烟碱降解率和菌体浓度，结果（表２）显示，温度为３０ ℃时，烟碱降解率和菌体生长量最大；当温度低于３０ ℃时，烟碱降解率和菌体生长量随温度的升高而增大，但影响较小；当温度大于３７ ℃时，菌株的生长受到抑制，烟碱降解率和菌体生长量随温度的升高呈快速下降的趋势。 ２．５ 烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株中间代谢产物ＨＰＬＣ分析 将烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株的静止细胞（Ｄ６００ ｎｍ为０．６０左右）以１０％的接种量接种至ｐＨ ７．００、烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４缓冲液中，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，定时取样，发酵液１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，用０．２２ μｍ的水相膜过滤，进行ＨＰＬＣ检测。结果（图３）显示，液体培养基中烟碱的保留时间在５．２５ ｍｉｎ左右。当培养到１６ ｈ时，５．２５ ｍｉｎ左右的烟碱峰面积明显减少，出现一个保留时间在１１．７９ ｍｉｎ左右的新色谱峰，表明培养基中的烟碱被降解，同时产生中间代谢产物。 ３ 小结与讨论 本研究从湖北省襄阳市烟草种植地土壤中分离得到1株烟碱降解菌，为蒙氏假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养，当接种量为５％，烟碱质量浓度为１．００ ｇ／Ｌ时，发酵１０ ｈ后烟碱降解率达到８８．８０％。在３０ ℃下，１８０ ｒ／ｍｉｎ摇床培养４８ ｈ，当接种量为５％，烟碱质量浓度为６．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率为８２．５９％；烟碱质量浓度为７．００ ｇ／Ｌ时，烟碱降解率和菌株生长呈下降趋势，烟碱降解率为１８．９４％。烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株最适生长温度为３０ ℃并对高温较敏感，当温度高于３７ ℃时，菌株生长受到一定的抑制。 烟碱的毒性很高，目前国内外报道的降解烟碱微生物主要有烟草节杆菌、嗜烟碱节杆菌、氧化节杆菌、纤维单胞菌属、棒杆菌属、阴沟肠杆菌、烟草微球菌、假单胞杆菌、恶臭假单胞杆菌、中间苍白杆菌属等。本研究从湖北省襄阳市烟草种植地中分离得到烟碱降解菌ＳＣＵＥＣ２菌株，该菌株具有高烟碱耐受力和高烟碱降解力，为利用生物技术降解烟碱废弃物和降低烟叶中烟碱含量奠定了基础。 参考文献： ［１］ ＹＵＡＮ Ｙ Ｊ， ＬＵ Ｚ Ｘ， ＨＵＡＮＧ Ｌ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ ＤＮ２ ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００６， １０１（３）：６９１－６９７． ［２］ ＲＡＭＡＮ Ｇ， ＭＯＨＡＮ Ｋ， ＭＡＮＯＨＡＲ Ｖ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ ｎｉｃｏｔｉｎｅ-ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ ＴＮＤ３５ ａｎｄ ｉｔｓ ｎｅｗ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ， ２０１４，２５（１）：９５－１０７． ［３］ ＲＵＡＮ Ａ Ｄ， ＭＩＮ Ｈ， ＰＥＮＧ Ｘ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ ＨＦ－１， ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｎｉｃｏｔｉｎｅ［Ｊ］． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００５， １５６（５－６）：７００－７０６． ［４］ ＬＩＵ Ｙ Ｈ， ＷＡＮＧ Ｌ Ｊ， ＨＵＡＮＧ Ｋ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｎｉｃｏｔｉｎｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ Ｎ１［Ｊ］． ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，２０１４，９（１）： ｅ８４３９９． ［５］ ＢＡＩＴＳＣＨ Ｄ， ＳＡＮＤＵ Ｃ， ＢＲＡＮＤＳＣＨ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｎ ｐＡＯ１ ｏｆ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ａｌｋａｌｏｉｄ ｎｉｃｏｔｉｎｅ： Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ２，６－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００１，１８３（１８）：５２６２－５２６７． ［６］ ＩＧＬＯＩ Ｇ Ｌ， ＢＲＡＮＤＳＣＨ Ｒ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ １６５－ｋｉｌｏｂａｓｅ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＡＯ１ ｆｒｏｍ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐＡＯ１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｕｐｔａｋｅ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００３，１８５（６）：１９７６－１９８６． ［７］ ＭＩＨＡＳＡＮ Ｍ， ＢＲＡＮＤＳＣＨ Ｒ． ｐＡＯ１ ｏｆ Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｒｅａｄ ｏｆ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ｔｒａｉｔｓ ｂｙ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ２０１３，７７（１－２）：２２－３０． ［８］ 孔 雯，先 锋，李长影，等．１株烟碱降解菌的筛选、鉴定及其降解性能的初步研究［Ｊ］．华中农业大学学报，２０１１，３０（１）：３０－３３． ［９］ ＴＡＮＧ Ｈ Ｚ， ＷＡＮＧ Ｌ Ｊ， ＭＥＮＧ Ｘ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｎｏｖｅｌ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ-ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｓｔｒａｉｎ Ｓ１６［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９， ７５（３）： ７７２－７７８． ［１０］ ＴＡＮＧ Ｈ Ｚ， ＷＡＮＧ Ｓ Ｎ， ＭＡ Ｌ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅ， ｅｎｃｏｄｉｎｇ ６－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｓｕｃｃｉｎｏｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｓｔｒａｉｎ Ｓ１６［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，７４（５）：１５６７－１５７４． ［１１］ ＷＡＮＧ Ｌ Ｊ， ＴＡＮＧ Ｈ Ｚ， ＹＵ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｕｎｕｓｕａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｒｕｃｉａｌ ｎｉｃｏｔｉｎｅ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｓ１６［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１４， ９１（６）： １２５２－１２６９． ［１２］ ＷＡＮＧ Ｓ Ｎ，ＬＩＵ Ｚ， ＴＡＮＧ Ｈ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ｂｉｏｔｙｐｅ Ａ ｓｔｒａｉｎ Ｓ１６［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１５３（５）：１５５６－１５６５． ［１３］ 翟贵发，陈素卉，李 涵，等．烟碱降解菌ＣＷ６菌株的分离鉴定及其降解特性［Ｊ］．华中师范大学学报（自然科学版），２０１３， ４７（５）：６７６－６８０． ［１４］ 李晓华，杨晓潼，翟贵发，等．烟碱降解菌ＤＡＢ２菌株的筛选、鉴定和降解特性［Ｊ］．中南民族大学学报（自然科学版），２０１３， ３２（３）：１８－２１． ［１５］ ＷＡＮＧ Ｓ Ｎ， ＨＵＡＮＧ Ｈ Ｙ， ＸＩＥ Ｋ Ｂ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｓ３３ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２， ９５（６）： １５６７－１５７８． ［１６］ ＷＡＮＧ Ｓ Ｎ， ＬＩＵ Ｚ， ＸＵ Ｐ． Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｂｙ ａ ｎｅｗｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ｓｔｒａｉｎ Ｓ３３［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，１０７（３）：８３８－８４７． ［１７］ 孔 雯．烟碱降解菌的分离鉴定、降解特性及其降解途径的初步研究［Ｄ］．武汉：中南民族大学，２０１１． ［１８］ ＧＯＮＧ Ｘ Ｗ， ＹＡＮＧ Ｊ Ｋ， ＤＵＡＮ Ｙ Ｑ， ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｙ２２ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ［Ｊ］． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００９，１６０（３）：２００－２０４． ［１９］ ＭＥＮＧ Ｘ Ｊ， ＬＵ Ｌ Ｌ， ＧＵ Ｇ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ １１２８２２ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ［Ｊ］． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１０， １６１（７）： ６２６－６３３． 1