IPTG诱导浓度_时间及温度对重组促性腺激素释放激素基因表达的影响

IPTG诱导浓度_时间及温度对重组促性腺激素释放激素基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响IPTG诱导浓度、时间及温度对重组促性腺激素释放激素基因表达的影响1,234522金元昌,刘利,苏晓艳,李景鹏,李会东,周建红(1.广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530004;2.湖南科技大学生命科学学院,湖南湘潭411201;3.贺州学院,广西贺州542800;4.湖南科技大学附属医院,湖南湘潭411201;)5.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030()文章编号:10047034200608001703中图分类号:Q786文献标识码:A关键词:促性腺激素释放激素;诱导浓度;外源蛋白;表达()()摘要:以人工合成的促性腺激素释放激素gonadotropinreleasinghormone,GnRH/转运肽TRS基()()因与表达载体pGEX-6p-1相连的重组子pGE-G作为研究对象,转化大肠杆菌BL21ED3plyS。利用IPTG作为诱导剂, 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 比较不同IPTG诱导条件对于表达产物的影响,以确定最佳IPTG诱导条件。结果表明:融合蛋白大部分以包涵体的形式存在,诱导温度为30?;IPTG浓度为012mmol/L时,可溶性融合蛋白GST-GnRH/TRS表达量最大。光密度扫描对表达产物进行初步定量,表明表达产物约占菌体总蛋白的3313%。ββIPTG为异丙基硫-D-代半乳糖苷,是-半;酵母提取物、胰蛋白胨、低熔点琼脂糖,购自北公司京原帄皓生物工程公司。其他试剂均为国产分析纯。乳糖苷酶底物的类似物,有很强的诱导力,在有IPTG诱导物存在的条件下,诱导物可与阻遏蛋白结合成复1.3主要仪器合物,而使阻遏蛋白构象发生改变,阻遏蛋白就不能()高速低温离心机美国,Beckman,电子分析天再与O基因结合,从而促进基因表达。促性腺激素(()帄瑞士,MettlerToledo,移液器法国,Gilson,德国,())()(释放激素GnRH为下丘脑神经元分泌的十肽激素,Eppendorf,-20?冰柜海尔,-70?冰柜日本,下丘脑的GnRH分泌呈典型的脉冲式释放,这是成熟)(()Sanyo,电泳仪美国,Bio-Rad,高压灭菌锅日动物的特征,对于性周期的形成是至关重要的,下丘(())本,Sanyo,超纯水器英国,UVP,凝胶成相仪美[1]脑GnRH脉冲式释放模式的丧失将导致闭经。试()国,Millipore,直流电泳仪DYY-?型,北京六一仪验以IPTG不同浓度、不同诱导时间和不同诱导温度)(器厂,超净工作台FromaScientific18291SN117069对重组GnRH基因进行诱导表达,以研究IPTG诱导)()-15,紫外分光光度计日本,UV-120-02,pHGnRH基因表达的影响。浓度、时间及温度对重组()计pHS-3C型,上海雷磁仪器厂,电热恒温水槽1材料与方法()DK-80型,上海精宏实验设备有限公司,高速台1.1工程菌()式离心机TGL-16型,上海医疗器械六厂,低速离质粒pGEX-6p-1,东北农业大学生命科学学()心机LD4-2型,北京医用离心机厂,水浴摇床()院基因部保存;受体细胞JM109及BL21DE3plyS,()HZS-D型,哈尔滨市东联电子技术开发公司,垂购自PROMEQA公司;重组促性腺激素释放激素/转()直板电泳系统DYY-?型,北京六一仪器厂等。运肽基因的工程菌pGE-G,东北农业大学生命科学1.4方法学院基因部构建。()将含有阳性重组子pGE-G的BL21DE3plysS1.2材料μ菌接种于含Amp100g/mL的LB液体培养基中,37?培养过夜。取上述过夜培养物以1/10的比例X-gal、IPTG、青霉素、低分子质量蛋白标准、丙μ()接种于新鲜的LB含Amp100g/mL液体培养基烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺,购自大连宝生物工程有限[2]中。1.4.1最适诱导剂浓度的选择取4支试管,每管收稿日期:20051008分装扩大培养液2mL,分别按012,016,110,()作者简介:金元昌1969-,男,讲师,硕士研究生.210mmol/L的终浓度加入诱导剂IPTG,37?振荡培HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine?8200618养4h至OD达016。用SDS-PAGE分析、比较,依590据融合蛋白表达量的多少选出最适诱导剂浓度。1.4.2最适诱导时间的选择在余下的10mL扩大培养菌液中,加入终浓度为012mmol/L的IPTG,继续振荡培养,并分别在2,3,4,5,20h后各取出2mL诱导培养菌液,置4?冰箱中终止培养,再用SDS-PAGE分析、比较融合蛋白的表达量,选出最适诱导时间。1、2、5、6、71012mmol/LIPTG诱导2,3,4,5,20h;31未诱导1.4.3最适诱导温度的选择除在37?进行诱导(()的pYC2/BL21DE3plysS;4.标准蛋白质分子质量66,45,)36,29,24,20,14ku;8、9、101016,110,210mmol/LIPTG诱表达外,另在30?进行诱导表达,超声破碎菌体,观导4h。察诱导温度对可溶性融合蛋白所占比例的影响。图2融合蛋白表达的最佳诱导剂浓度和诱导表达时间2结果2.1GST-GnRH/TRS初步表达SDS-PAGE分析2.3不同温度的优化表达SDS-PAGE分析用SDS-PAGE鉴定,结果在24ku与29ku之间取超声破碎处理后的37?诱导菌液上清液和沉()产生1条特异的蛋白带箭头所示,与预期蛋白淀进行SDS-PAGES分析。结果表明,融合蛋白大()GST-GnRH/TR,28ku的大小一致,诱导2h的对部分以包涵体的形式存在。把诱导温度降为30?,()照的非重组PGEX-6P-1产生25kuGST带,而未012mmol/L的IPTG诱导时,可溶性融合蛋白占大多经IPTG诱导的质粒菌的培养物样品无特异带出现数,光密度扫描对其进行定量分析表明,该可溶性融()见图1。()合蛋白约占菌体总可溶性蛋白的3313%见图3。()1.包涵体;2.可溶性蛋白;3.未诱导的pYC2/BL21DE311标准蛋白质分子质量;212h诱导阳性;31诱导前阳性;plysS。412h诱导阴性;514h诱导阳性;614h诱导阴性。图3融合蛋白表达的最佳诱导温度图1重组菌表达产物的凝胶电泳结果2.4表达产物的含量测定2.2不同时间及浓度的优化表达SDS-PAGE分析()光密度扫描对表达产物进行定量分析见图4,SDS-PAGE结果表明,诱导时间和IPTG浓度对第一峰为表达蛋白,对应于NO17。结果表明,融合蛋()GST-GnRH/TRS蛋白的产量无显著影响见图2。白约占菌体总蛋白的3313%。3讨论,强度的盐酸胍溶液可使蛋白质重折叠期间产生聚合()1试验采用IPTG诱导,表达量较高,在摸索了SDS带负电荷并与蛋白质结合形成共价复合物,不利诱导时间和诱导物浓度对蛋白质表达量的影响时,发于纯化,尿素会使融合蛋白的GST部分发生变性,失现并不是诱导时间越长蛋白质表达量越多,也不是诱去与谷胱甘肽琼脂糖珠的结合能力,因而,试验应用[4]导物浓度越大蛋白质表达量越多。其中诱导物IPTG1%的TritonX-100为去垢剂。考虑到包涵体的本身有毒性,对于人类临床药用蛋白质的大批量制复性相当复杂,故采用了一些减少包涵体的措施,如备,IPTG并不是理想的诱导物,而且价格也很昂贵。降低诱导剂的浓度,采用了30?诱导,30?诱导主从目前的研究来看,还没有找到更为理想的诱导物,要以可溶性形式存在,而37?诱导主要以包涵体形凡是用药物诱导法诱导表达目的蛋白均用IPTG诱式存在,这可能与不同温度环境下菌体内微环境的不导。试验研究表明,在实验室条件下小量表达目的蛋同而造成的蛋白溶解度的改变有关。而诱导时间和白质用IPTG诱导还是比较方便的。IPTG浓度对GST-GnRH/TRS蛋白的产量无显著影()2尽管pGEX-6p-1原核表达系统具有上述响。参考文献:优点,并成功地应用于多种蛋白的表达,但在实际操[3][1]孙刚.胎盘内分泌的基础与临床[M].上海:第二军医大学出版作中往往还是存在形成包涵体的问题,因此,要获社,2001:110-111.得GnRH/TRS蛋白,需要裂解菌体并溶解包涵体。J萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[2]裂解菌体的方法有多种,如高压匀浆法、超声破碎法、[M].2版.金冬雁,黎孟枫译.北京:科学出版社,1992.酶溶解法,前两种需要反复多次操作才能裂菌完全,FRANGIONIJV,NEELBG.Solubilizationandpurificationofenzy2[3]()maticallyactiveglutathioneS-transferasepGEXfusionprotein且超声的时间过长或者功率过高,都会显著降低融合()[J].AnalBiochem,1993,2101:179-187.蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠的结合能力,故此研究采用方向东,林来兴妹,高基民,等.重组人G-CSF大肠杆菌表达产[4]酶溶法。包涵体的溶解需要打开包涵体中蛋白质分()物的纯化及鉴定[J].中国生物制品学杂志,1997,101:1-4.子间的非共价键和离子键,使多肽伸展。常用溶解包涵体的变性剂有盐酸胍、尿素、SDS和去垢剂,高离子Effectofinduceconcentration,timeandtemperatureofIPTGontheexpressionoftheGST-GnRH/TRSgene1,234JINYuan2chang,LIULi,SUXiao2yan,etal(1.CuangxiUniversity,Nanning530004,China;2.CollegeofTechnological,HunanUniversity,Xiangtan411201,China;)3.HezhouUniversity,Hezhou542800,China;4.Affiliatedhospital,HunanUniversity,Xiangtan411201,China()Keywords:GonadotropinreleasinghormoneGnRH;inducedconcentration;exogenousprotein;expression()Abstract:TheobjectisrecombinantGnRH2’SgeneandtransportergenewithfusionexpressionvectorpGEX-6p-1,transformedintotheBL21ED3plysSprokaryoticexpressionsystem,inducedandexpressedbyIPTG,analyzedtheeffectofdifferentconcentration、timeandtemperatureofIPTGontheex2pressionoftheGST-GnRH/TRSgene,confirmedthebestinducedconditionofIPTG.SDS-PAGEanalysisshowedthatGST-GnRH/TRSexpressionquantitywasthemostwhentemperatureofIPTGwas30?andconcentrationofIPTGwas0.2mmol/L.Theamountofthegoalproteinwasevaluatedbyden2()()sitometricscanning.ItindicatedthattheproductoftheGST-GnRH/TRSgenewas33%oftotalbacterialproteinofBL21ED3.009?基层园地?3剖检变化病死鹅的口、鼻内有黏液,气管出血,腺胃黏膜脱雏鹅马杜拉霉素中毒的诊治落,心外膜充血,肝脏淤血,小肠黏膜弥漫性出血,肾淤血。1发病情况某个体养殖户饲养18日龄雏鹅214只。20054治疗年7月份,为防治球虫病,用马杜拉霉素拌料饲喂,但无特效解毒药,采用综合治疗措施。立即停喂拌由于称量时失误,将10克马杜拉霉添加到200千克有马杜拉霉素的饲料,更换新料;口服补液盐饮水,任()料纯品添加剂量应为5毫克/千克中,次日雏鹅出鹅自由饮用,症状较重的雏鹅可逐只灌服;饮水中加现中毒症状,并不断有雏鹅死亡,3天内共死亡雏鹅入0.02%维生素C。165只,死亡率高达78%。在临床实践中,要严格掌握马杜拉霉素的用量,2临床症状谨防中毒。(中毒初雏鹅多表现为神经症状,兴奋不安,乱飞,孙宝莹,王金莉李丽锦州医学院畜牧兽医学)乱跑,口流黏液,头向后仰;后期表现为精神沉郁,食院,辽宁锦州121001()010欲部分或全部废绝,部分病鹅拉白色或浅绿色稀便。