鸡传染性法氏囊病病毒VP1蛋白影响病毒复制及致病性机制的研究

鸡传染性法氏囊病病毒VP1蛋白影响病毒复制及致病性机制的研究 鸡传染性法氏囊病病毒VP1蛋白影响病毒复制及致病性 机制的研究 密级: 论文编号: 中国农业科学院 学位论文 鸡传染性法氏囊病病毒蛋白影响病毒复 制及致病性机制的研究 : 博士研究生:余飞 ’ ’‘ 指一导 教师:王笑梅‘ 申请学位类别:农学博士 专 业:预防胖 研究 方向:动物病毒分子生物学和免疫学 培养 单位:哈尔滨兽医研究所 中国农业科学院研究生院 提交日期 年月奶.: :球触?岫触:一 一 一一 一一 肌::中国农业科学院 博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 论文题目 鸡传染性法氏囊病病毒蛋白影响病毒复制及致病性的机制研究 动物病毒分子生物学和免 预防兽医 论文作者 余飞 专业 研究方向 疫学 指导教师 王笑梅 培养单位研究所、中心 哈尔滨兽医研究所 硕博 签名 姓名 职称 单 位 专业 硕导口 博导口 评 \\ 硕导口 阅 博导口 \\. 人 硕导口 博导口 。\. 放 口 硕导口 辩 李德山 教授 东北农业大学 生物制药学 主 博导团 席 私切 硕导口 薛飞 研究员 预防兽医学 哈尔滨兽医研究所 博导团 嘲什 硕导口 陈化兰 研究员 预防兽医学 哈尔滨兽医研究所 仍 博导团 一。 答 硕导口 刘思国 研究员 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 博导团 制 知吣 辩 硕导口 仇华吉 研究员 哈尔滨兽医研究所 预防兽医学 博导团 彬 委 硕导口 刘娣 教授 黑龙江省农业科学院 预防兽医学 博导团 /棚 员 硕导口 崔玉东 教授 预防兽医学 黑龙江八一农垦大学 博导团 旒多、东 、 会议 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 秘书 刘春国 ? 论文答辩时间地点 学术报告厅本人声明 果。尽我所知 表或撰写过的 书而使用过的 明确的说明并 研究生签 本人完全 学院有权保留 印或扫描等复 同媒体上发表 研究生签 导师签名的 主 因 蛋白。节段含有一个开放阅读框,编码蛋白,具有依赖的聚合酶活性。 反向遗传技术的成功建立很大程度上推进了的基础研究工作。众多学者对于 的 节段做了相关的研究,发现的蛋白对病毒的毒力、细胞嗜性有重要作用,和 蛋白也对病毒的复制有一定影响。但是,病毒的毒力是由多个因素共同决定 的,对于病毒的 复制和毒力也有影响。目前,关于的研究仍相对滞后,对病毒复制及毒力的影响尚未见 比较深入的报道。 本研究旨在研究与复制及毒力的关系,并研究其影响病毒复制和毒力的分子机制。 本研究首先测定并分析了七株的节段全基因组序列,并将全基因组序列上传到 中。通过遗传进化分析结合致病性实验,所测定的七株病毒均属于超强毒株。根据节段 进化分析,可将节段划分为三个群,本研究测定毒株的节段属于第?群和第?群。通过序列 比对,强毒在蛋白上有八个保守的氨基酸位点,分别是、、、、、 、以及。在节段的部分,和在强毒中是保守的,在部 分,是保守的。 为进一步研究上的保守位点对于病毒的生物学特性是否有影响,本研究根据的三维 结构,构建、和位点突变的端结构域突变株,、、和位点突变的中心 活性结构域突变株和端结构域的突变株。首先以弱毒的节段和超强毒.的 节段为骨架构建株针对节段不同突变的病毒,研究其在细胞上的复制动力学特性,发 现将强毒的节段上的、和位点突变为弱毒的相应位点,可使病毒在细胞 上的复制能力增强。将强毒..的节段上的位点突变为弱毒的相应位点,也可使病 毒在细胞上的复制能力增强。进一步拯救出、、单位点突变的病毒,研究其在 细胞上的复制动力学特性,发现将强毒的,的节段上的位点突变为弱毒的相应位点, 也可使病毒在细胞上的复制能力增强。可见以及突变可提高病毒在细胞的 复制能力。 为研究影响体外复制的位点是不是会进一步对病毒的毒力造成影响,本研究首先构建了 超强毒株的反向遗传系统。以的节段和的节段为骨架拯救出超强毒亲 本毒株。首先将、节段的质粒在细胞上转染,转染 后,将转染的细胞液反复冻融 次,从尾根部接种周龄鸡的法氏囊,在接种后天,拯救各组不同病毒的鸡均出现死 亡,剖检鸡法氏囊出现病变,经测序和电镜分析证实超强毒已成功拯救。将拯救的节段 上不同突变的超强毒进行鸡攻毒实验,发现将强毒的位点由突变为,可使病毒 的致病性增强,将强毒的位点由突变为,可使病毒的致病性增强。 具有依赖的聚合酶活性,研究不同位点突变影响病毒复制及致病性的分子机制。构建了基于节段的系统,并成功用于检测的聚合酶活性。通过聚合酶 活性检测,发现将强毒的位点突变为弱毒的相应位点,可使病毒的聚合酶活 性升 高,而将弱毒的位点突变为强毒的相应位点,病毒的聚合酶活性降低。由此可 见,位点 影响病毒复制及致病性的分子机制之一是由于其影响了病毒的聚合酶活性。 关键词:,,病毒拯救,复制,致病性,聚合酶活性 ? /. ,. .. . ,, , , . 。 ... . .. . , , .. . ,,,, . ’ 陀 , .., ;,,. ., ... . :, 第 . ..鸡传染性法氏囊病的防控? .鸡传染性法氏囊病病毒. .. 病毒粒子? .. 基因组?.. ..病毒编码蛋白... 反向遗传系统 ..几种不同类型的反向遗传系统 .. 反向遗传系统的建立? ..反向遗传学在研究中的应用.决定抗原变异,致病性及细胞嗜性的分子基 础? . 的节段研究进展.问题与展望. .本研究的目的及意义.. 第二章 节段全长克隆及序列分析.材料与方法. ..病毒,鸡胚及实验动物. ..主要试剂及引物合成??. ..主要仪器??.. ..病毒的处理及的提取. ..基因组序列的克隆 ..序列比对及进化分析??. .. 部分二级结构预测?.. ..病毒致病性研究.. .结果??. .. 节段全基因组序列的扩增. .. 节段全基因组序列分析? .. 节段进化分析.. .. 节段二级结构分析? ..致病性实验.讨论??. 第三章 影响弱毒复制位点的鉴定?.. .材料与方法. ..质粒,病毒,细胞,动物? ..主要仪器??.. ..工具酶及主要试剂 ..引物设计与合成.. .. 节段基因修饰及感染性克隆的构建. ..病毒的拯救?.. ..拯救病毒的鉴定.. ..突变病毒白啉外复制动力学分析.结果??. .. 节段基因修饰及感染性克隆的构建.. ..拯救病毒的鉴定.. ..拯救病毒的复制动力学分析. .讨论??. 第四章 上突变位点对病毒致病性的影响??. .材料与方法??.? ?..质粒,细胞,鸡胚,动物? ..主要试剂和工具酶 ..主要仪器.??. .. 反向遗传操作系统的建立?.. .. 节段突变的的拯救 ..拯救病毒的动物感染实验?..??. .结果??. ..拯救超强毒株的鸡病理变化..?. ..拯救超强毒株的鸡的法氏囊病理变化??. .. ?鉴定?.. ..拯救病毒的电镜鉴定??. ..致病性. ..病毒的体内复制动力学?.. .讨论??. 第五章突变位点影响复制及致病性的分子机制. .材料与方法??.? ..质粒,细胞..主要仪器??.. ..主要试剂及工具酶 ..引物的设计与合成??... ..基于节段的 的构建 ..用系统进行聚合酶活性的检测.. 株的区段突变对聚合酶活性影响的检测??.. .. 一株的单点突变对聚合酶活性影响的检测??.. .. 株的突变对聚合酶活性影响的检测.结果??. ..以.的节段为骨架的系统的建立??. ..以的节段为骨架的系统的建立. ??英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 矩氨基酸 鸡胚成纤维细胞 鸡胚半数致死量 ? 加强型绿色荧光蛋白 锤头状核酶 丁肝病毒核酶传染性法氏囊病传染性法氏囊病病毒 ?’间接免疫荧光实验 、 荧光素酶感染倍数 核苷酸非编码区 开放阅读框 依赖的聚合酶 反转录 . 无特定病原体组织培养半数感染量 % 超强毒株 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 第章绪论 .鸡传染性法氏囊病研究概况 鸡传染性法氏囊病也称“甘布罗病”,于年首发于美国地区 ,。 传染性法氏囊病是危害到周龄雏鸡的一种急性,高度接触性传染病,现已遍及全世界主要养 禽地区,是一种国际公认的鸡的重大疫病 ,; .,。鸡传染性法氏 囊病由传染性法氏囊病病毒引起,感染的靶器官是法氏囊。法氏囊是禽类的一种特有的中枢免疫 器官,淋巴细胞在法氏囊组织中分化成熟。鸡感染传染性法氏囊病病毒后,病毒很快即可侵染 靶器官,病毒在靶器官的增殖可造成法氏囊中细胞的裂解,衰竭,最终可引成鸡机体严重的免 疫抑制; 。目前世界各国都有该病的发生,尤其是近年来病毒的 抗原变异和血清亚型的多样性给其防控带来了新的挑战,超强毒株的出现也 使传染性法氏囊病出 现了更高的死亡率,对养鸡业的危害也更加严重 .,; .,。 ..鸡传染性法氏囊病的研究历史 鸡传染性法氏囊病是由于年首次报道并做了全面描述,,当 时由于死于该病的发病鸡肾脏出现了严重的损伤,最初称其为“禽肾病”。随后,和 也证实了的发现 ,并且通过鸡胚成功分离出了 该病的致病因子。因为这种病毒感染能引起法氏囊的特异性病理损伤,年,正式将 这种新的致病因子命名为传染性法氏囊病病毒。年,等报道 感染不仅会引起成年鸡的死亡以及体重降低等病理变化,早期感染还会引起鸡出现 严重的免疫抑制,使鸡对其他疾病的耐受性降低,这种发现使传染性法氏囊病受到了更大的关注 .,。年,等制备了第一株疫苗,将其命名为株”,是从感 染了的鸡法氏囊制作混悬液而制备的。这株减毒活疫苗在当时对于的防控具有很重要的 意义。随后,进一步将‘株”适应鸡胚成纤维细胞,并获得了减毒的‘%株”,并得 到了更广泛的应用 。 年,等报道了可分为两个血清亚型,即血清型和型 .,。型仅对鸡有致病性,而型则主要分离于火鸡,对鸡并不致病。在 年以前,对鸡的致病性都不强,只有不到%的死亡率,并且可以通过预防接种的方式成功 防控。然而,在到年间,在美国出现了传染性法氏囊病病毒抗原变异株 ; .,。株和变异株即是分离于免疫鸡群的两株变异株,变异株在致病性和免疫原性上都与以往的经典毒株有着很大的不同 ; .,。变异株可以逃避经典毒株的疫苗免疫,给传染性法氏囊病的防控带来了很多新的问题。 到了二十世纪九十年代,在欧洲和亚洲的许多国家都报道出现了的超强毒株,超强毒株对 鸡的致死率高达%以上。随着变异株和超强毒株的出现,给传染性法氏囊病的防控带来了新的 问题 .,; .,。中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 ..鸡传染性法氏囊病的致病性研究 感染能引起到周龄的鸡发病以及死亡,而对于周龄以下的雏鸡则通常没有明显 的临床表现,仅仅会引起免疫抑制。这是由于对于鸡的法氏囊具有专嗜性,而且鸡对于 的易感性也取决于其法氏囊的发育程度。只要法氏囊已经发育的鸡,均可以感染而其中以 到周龄鸡最易感,是由于这个日龄的鸡法氏囊发育得最为成熟 .,。很多学 .,; .,; ., 者都认为法氏囊是感染的靶器官 。法氏囊是禽类的一种重要的中枢免疫器官,是鸡的体液免疫器官,是细胞分化与成熟的 场所 .,;.。感染后,病毒即在法氏囊中的淋巴细胞中增殖,从 而破坏了细胞的生长发育,使细胞数量减少,并最终造成整个法氏囊组织的损伤,从而引起 机体的免疫抑制 。除此之外,关于感染引起机体免疫抑制的机制 还有一些其他的说法,比如感染会损伤辅助细胞或其他细胞的功能而造成免疫抑制等等。 具体的机制如何还有待进一步的研究 .,; .,。 在病毒侵染靶器官以后,持续感染机体以及增殖的过程中,也可以同时感染单核巨噬 细胞系。有人认为这些细胞对于病毒在体内的传播以及疾病的发展有很重要的推进作用。巨噬细 胞可以通过释放一些炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子或白介素等加剧疾病的感染,而和?, 细胞能产生干扰素以激活巨噬细胞的活力而起一定作用 .,; 。 ..鸡传染性法氏囊病的流行病学研究 在研究的最早期,?直认为仅仅可以感染鸡,直到年,从火鸡和鸭中也分离出, 证明其宿主也有一定的范围 .,; .,:王永山等,。 但是在自然状态下,只有鸡感染能产生临床症状和病理变化,而火鸡和鸭等则仅仅是病毒 的储存宿主。本病无明显季节性,全年均可发病,且与饲养管理密切相关。的流行特点是潜 伏期短,传播很快,感染率和死亡率高,并且有明显的死亡高峰。为高度接触性传染病,病 源包括粪便,可通过直接接触感染,也可通过病毒污染的各种媒介间接接触而感染。由于 对环境有很强的抵抗力,养过病鸡的鸡舍在清除病鸡后很长时间内对新进鸡仍具有感染性。 感染后,并发症和继发症明显增多,常伴随有新城疫,马立克病疫苗接种失败的现象出现,也容 易继发感染支原体,曲霉菌病等其他疾病,使发病率和死亡率进一步上升张存等, ;金文 杰等, ; 姜世金等,。 ..鸡传染性法氏囊病的诊断 在急性发病的鸡群中,通过特征性的临床症状和病理变化通常能作出初步诊断。该病的特点 是发病快,传播迅速,发病率高,常在发病后到天死亡,并迅速康复。特征的病理变化为: 胸肌,腿肌出血,鸡体严重脱水,法氏囊肿大,浆膜面有黄色粘液渗出,有时有 出血。也有的会 出现法氏囊严重萎缩,呈土黄色,有粘液渗出。进一步的确诊包括病毒分离鉴定,血清学以及分 子生物学等方法。 病毒的分离鉴定包括禽活体接种,鸡胚分离等手段。鸡胚接种后通常于到天死亡,胚体 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 出现通身出血,肝坏死等病变。接种雏鸡也在到天出现死亡,法氏囊出现明显病变。 血清学检测方法包括病毒中和实验,可用来检测血清抗体,并可区分不同血清型和亚型。中 和抗体在病鸡血清中存留时间较长,且中和实验敏感性较高,是一种较理想的诊断方法。 实验能检测大批样品,并且特异性强,敏感性高。免疫扩散实验也可用已知的抗体检测病鸡中的 病毒,操作简便,但是敏感性不如中和实验。 随着核酸分子检测水平的发展,许多分子生物学检测手段包括,荧光定量, ., 结合限制性酶切分析鉴别诊断,等都用于的诊断 ; ; .,; .。分子生物学方法快速高效, 且敏感性高,得到了越来越广泛的应用。 ..鸡传染性法氏囊病的防控 由于对于很多理化条件都有很强的抵抗力,对乙醚,氯仿,吐温,胰蛋白酶都有抵抗 力,对大多数消毒药也有抵抗力,病毒很容易被携带和保存,要消灭鸡舍中的病原是困难的 .,。在畜禽规模化,密集化养殖大力发展的今天,控制的传染也是一件很重要的 。 任务闰成刚等, 。 应用疫苗进行免疫接种是防控的最主要的手段。通常是接种育种鸡,这样可以使刚出壳 的雏鸡获得一定水平的母源抗体以抵御早期感染。用于育种鸡免疫的通常采用灭活疫苗,可以起 到很良好的效果 。 活疫苗对于的防控也十分重要,这一类疫苗主要是通过鸡胚或细胞经过长期传代后致弱 而来,分为中等毒力疫苗和弱毒疫苗。活疫苗通常通过饮水或是滴眼的方式免疫雏鸡。弱毒活疫 苗使用有一定的弊端,比如如何避免母源抗体的干扰,而且通常还有一定残存的毒力,并且还有 毒力返强的危险,这些都可能会带来一定程度的免疫抑制。中等毒力活疫苗可以不受母源抗体的 干扰而产生比较强的免疫应答,但由于其残存的毒力较强通常容易引起法氏 囊组织的损伤。 随着分子生物学,免疫学新技术的不断涌现,出现了一批新型疫苗。基因工程亚单位疫苗, 重组活载体疫苗,核酸疫苗,病毒样颗粒等各具优势,新型疫苗的开发也为本病的防治带来曙光。 应用禽痘病毒,火鸡疱疹病毒,禽腺病毒作为载体表达或者多聚蛋白免疫雏鸡,可使鸡体获 得一定的保护 .,; .,;.,。 在防治本病时,还应当采用综合防治措施即卫生措旌和疫苗接种相结合的防治 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ,遵守严 格的兽医卫生措施。首先在选址上,应从选厂址,禽舍朝向,通风透气等禽舍结构建筑开始,从 科学角度出发,保证禽舍温湿度和通风透气良好。同时,也应制定完善的管理体制,实行“全进全 出”的饲养 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 ,尽可能给鸡群创造适宜的环境,减少应激。应加强禽舍的环境的消毒,加强对病 鸡的护理和淘汰,加强隔离消毒及卫生管理。被污染的环境,应该采取严格,彻底,认真 的消毒措施周玉森等‖;于涟等,。 .鸡传染性法氏囊病病毒 .. 病毒粒子属于双病毒科禽双病毒属 .,; .,。为 第一章绪论 中国农业科学院博士学位论文 具有单层衣壳,无囊膜的病毒,外壳由个二十面体对称的壳粒组成。形状为正 二十面体 颗粒,直径约,晶格分布,外表面由组成的三聚体亚单位构成,内衣壳由 组成的三聚体亚单位组成 .,。图一所示为的结构示 .,; 意图以及病毒粒子的电镜照片。在颗粒内部,一些物质包裹着五倍轴,可能由 和组成.,。 图卜 叫的结构图 ,病毒粒子的模型;,完整的病毒粒子电镜图片. . 置酊锄;巍 . 基因组 基因组由,两个节段组成。其中节段长约.,含有两个重叠的开放阅读框 。其中大按顺序编码一个约的多聚前体蛋白,前体蛋白通过翻译后的加工修 饰变为成熟的,,蛋 .,。编码蛋白的基因片段约,编 码蛋白的基因片段约,位于两者之间的编码蛋白。节段长.,有一.,; .,; 个约的,编码一个分子质量约为的蛋白 .,? ,节段的’和’端均存在有非编码区,,节段的’端通过基因组连接蛋白相连.,; 。非编码区存在有茎环状的二级结构,也具有高度保守型。 和节段的非编码区之间存在着同向末端和反向重复互补序列,提示它们在病 毒的生命周期中扮 演着十分重要的角色,可能与病毒的复制,基因组的组装等有关 .。 等将节段’的前,全长’以及缺失了前的’置于缺失启动子的 载体的增强子下游,研究其对报告基因的表达调控。结果发现的前存在一个很强的 .,。病毒的非编码区对于病毒的复制有一定影响。等证实了 启动子元件 病毒的非编码区的末端序列对于病毒基因组的复制至关重要 .,。同时也认为非编 码区的茎环样二级结构而非一级的序列对病毒的复制及毒力有影响, .,。而 关于病毒非编码区的其他的一些顺式作用元件,目前还无相关报道。 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 ? ’ , :翰 镬 一‘ :‘ .‘ 嗡 拍 磕 净’‘......‘........二..二................工......‘............‘二.‘.......一。’ ............?,???..?..??.???????,?‘??????????置留 ?, ? ,? ’.. .. :一.. . 。, . . 喜啼.鲫咿‘., .匮翟匿墼翌雹囊囹圈警耍圈’..‘ 摊酬.,,融蝴‘辨嘲 一帅一撕、.,,忡”?一一?一?忡?甲一?~一’:.掣?’:一,一??岫州?一?~‖ ..‘ , ? ?? ‘ ’’‘ 拍.. ?。。王 ‘匿墓窭蚕嚣匿匿鏊露蚕鍪露圈 图 的基因组结构以及编码的蛋白 病毒的基因组节段编码一个多聚蛋白以及非结构蛋白,多聚蛋白经剪切加工 后形成成熟的 ,和蛋白.节段编码蛋白,是依赖的聚合酶.? . ? , , . , . ..病毒编码蛋白 蛋白具有依赖的聚合酶活性,位于核衣壳的内面,与病毒复制有关,它同时还具有鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性 ; .,。 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 以游离和与基因组结合两种状态存在,与病毒基因组末端通过共价键牢固结合的称,经处理后可使其解离成游离状态,称为 .,; ,。 等发现,的缺乏对于的病毒样颗粒的形成没有影响,而对于病毒基因组的复制是必需 的。说明对于核衣壳的组装是非必需的。等认为和形成的复合物是形成 完整的病毒形态所必需的,是病毒粒子形成的关键 .,。 蛋白是的主要结构蛋白,是病毒衣壳的主要组成成分,占病毒蛋白总量的%。 是病毒的主要宿主保护性抗原,与病毒中和抗体的诱导与识别,病毒毒力变异,抗原漂移, 细胞凋亡的诱导等有很大关系 .,; .,。因此,蛋白一直以 来都是研究的一个热点,众多学者也认为蛋白是决定毒力和细胞嗜性的关键因 素。的到位氨基酸的差异占整个多聚前体蛋白中氨基酸差异的%,这一区域称 作 高变区 .,;, .,。很多研究认为,高变区内的氨基酸残基的 突变是引起毒力变异的重要因素。高变区内包含有两个大亲水区和两个小亲水区,是构成 抗原变异的分子基础。紧邻第二亲水区后是一个富含丝氨酸的七肽区,可能也与毒力相关 .,。上包含有中和性抗原表位,非中和性抗原表位和毒力相关性抗原表位。中 和性表位具有强烈的构象依赖性,非中和性表位是非构象依赖性的。毒力相关性表位也属中和性 表位,具有毒力特异性 .。 蛋白是的另一重要蛋白,分子质量约为,占病毒总量的%。含有群特 异性抗原决定簇,可诱导中和抗体的产生,但反应能力极弱,免疫保护性不强 。对于病毒样颗粒的形成是必要的,对于病毒衣壳的形成和形态的完整是必需的 .,; .,; .,。至少存在两个独立非重叠的非中 .。。 和性抗原表位,其中一个是两个血清型所共有的,另一个是血清型特异的 可与、,相互作用,也可与基因组相互作用 .,。 蛋白是病毒的非结构蛋白,是病毒的蛋白酶。在它的作用下使多聚蛋白前体顺利加工成 ,和。并不是成熟病毒粒子的组成部分,而是与病毒在感染细胞后形成的微管 状结构有关 .,; .,。 蛋白仅存于感染的细胞内,而不存在于病毒粒子中。研究表明,蛋白对于病 毒在体内和体外的复制都不是必需的,但可能与病毒的致病性有关 .,。同时, 也可以诱导细胞凋亡。等认为是一个跨膜蛋 .。 .反向遗传系统 现代遗传学总体策略为“性状一基因”,即从分析生物体表型入手,研究决定这些表型的基因 及其调控。这种研究方向推动了分子遗传学发展及基因工程的诞生。而世纪年代开始的重 组技术又为反向遗传学研究的开展提供了必要的技术支持。反向遗传学从方法上定义,就 是在获得基因序列的基础上通过对基因进行必要的修饰,如定点突变,缺失,插入,从而研究基 因结构和功能的研究策略。这使得体外操作的序列有精确和已知的突变,被修饰的核酸再 导入到机体中研究这些修饰对表型的影响黄耀伟等,。 反向遗传学技术应用于病毒学研究又称为“病毒拯救”。所谓病毒拯救,即从病毒的遗传材料 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 入手,通过必要的方法在培养细胞或易感宿主中重新“复活”病毒,在此基础 上通过修饰病毒的 基因组序列研究病毒的结构和功能。能拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆,是质粒中含有的整 个病毒基因组的拷贝,使本身或体外转录所得的具有感染性。利用反 向遗传的方法开展病毒的功能基因组学研究,对于防治病毒性疾病至关重要,是进行病毒结构与 功能深入研究的必经之路。年,等首次成功拯救出 病毒 .,。 等报道从全长克隆拯救出 年, 噬菌体,这是首次拯救病毒的报 道, .,。 ..几种不同类型的反向遗传系统 在病毒中,反转录病毒是比较容易拯救的,因为其复制周期中有双链环节,只需 转染全长即可复制及整合到宿主基因组中。而非反转录病毒的生命周期中没有 的中间阶段,从某种程度就加大了构建感染性克隆的难度。非反转录病毒的拯救策略主要有 以下几种: 体外转录为感染性再转染,即将所获得的克隆在体外加入所需材料进行转录, 从而获得感染性 .,将感染性直接转染进入细胞或易感动物拯救出活 病毒。一般基因组较小的正链病毒多采用这种方法。通过体外转录获得的感染性转录本稳定 性不高,易降解且产量低。另外,转染产生病毒时,由于 聚合酶的低保真性,使 转录所得的转录物有群体差异,使被拯救病毒感染力较低甚至不产生感染性克隆。直接影响了体 外转录法拯救病毒的效率。不过,对于一些不能体外培养的病毒的拯救,例如丙型肝炎病毒 和戊型肝炎病毒,体外转录法感染宿主动物是唯一可行的拯救方法。基于 聚合酶的体内转录系统是病毒基因组由内源的 聚合酶转录和 复制的病毒拯救系统。痘苗病毒厂 聚合酶系统/啊是目前应用在动物负链病毒 拯救上最为广泛的系统。厂系统中,?,厂先在细胞中表达噬菌体 聚合酶,再由 聚合酶去转录插入启动子的外源病毒基因组,由此实现病毒的拯救。但是哪系统也 有一些局限性。在感染时会产生细胞病变,最终使细胞死亡,从而干扰了病毒的拯救。 另外,在细胞质中进行转录复制,对于在细胞核中转录复制的病毒则无能为力。而且,将拯 救病毒从中纯化出来也使拯救过程更为复杂繁琐。许多学者纷纷寻求替代去表达 聚合酶的系统。如禽痘病毒厂系统,/系统,杆状病毒厂系统,甲病毒厂系统,构建 直接表达 聚合酶的细胞系等, .,;, .,; .,。 聚合酶?拯救系统利用真核生物的聚合酶?来驱动病毒转录。这套系统操作简易, , 生物安全要求不高。启动子一般选用 ,肌动蛋白基因启动子等,都可被真核生 物的聚合酶?识别。聚合酶?系统对于基因组较小的正链病毒应用比较广泛, .,,也经常与其他系统例如聚合酶拯救系统联合使用。 聚合酶拯救系统主要用于拯救流感病毒 .,。在真核生物中, 聚合酶主要负责核糖体的转录,其转录场所在细胞核内,转录产物有精确的’和’末 端,而且很高效,对于在细胞核中复制的病毒的拯救很适用。也有一些在细胞质中复制的病毒应., 用聚合酶拯救系统也可以成功拯救武.,; .,; 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 。 .. 反向遗传系统的建立 是双股双节段的病毒。年,等首次采用体外转录系统拯救出 .,,随后,等也采用体外转录的方法救出病毒 .,。体 外转录试剂盒一般是在 ’端引入帽子结构。可模仿的基因组连接蛋白,在一定 程度上补偿的损失,有利于提高病毒的拯救效率。 基于 聚合酶的体内转录系统相比体外转录有着更高的效率,等应用 聚 合酶的体内转录系统拯救出细胞适应毒,及超强毒。并拯救出一系列的嵌合病毒, 进行了基因功能的研究 .,。 聚合酶?拯救系统也用于的拯救。年,等利用启动子的载体拯救 出了 .,,但是由于启动子不能精确转录,使其拯救效率大为降低。 年,等在病毒的基因组’和’端各加入核酶序列,解决了这个问题,使的拯救更为简易 且高效 .。。随后,等在此基础上又做了进一步的改进,即没有采用’端的 核酶序列,而是将’端基因组序列直接融合到启动子的转录起始位点,而’端则采用了核 酶序列,这种方法使聚合酶?的构建策略更为方便,高效 .,。 胤臼钿掰 疆嘲 觚粥国哪 仃,印 图卜 ?聚合酶?拯救系统 真核表达载体中,两端融合有核酶序列的病毒的两个节段的基因组克隆到增 强子和. . 启动子的下游 . .骶 岫. ..反向遗传学在研究中的应用 自年反向遗传技术首次应用以来,对决定毒力,复制,抗原性的分子机制 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 研究及病毒蛋白功能研究带来了很多新的突破。通过采用反向遗传系统,等 拯救出一系列不 同突变的嵌合病毒,结果发现通过改变超强毒株的基因上的和位点,可以使 超强毒适应鸡胚成纤维细胞 .,。等则将细胞嗜性的关键性位点定位在 的和位点 .,。 应用反向遗传技术,也开展了关于决定毒力的分子机制的研究。目前这些研 究主要集 中于的蛋白上。研究发现,基因上的,和位点不仅可以决定 的细胞嗜性,对其毒力也有决定性作用 .,。以往一直认为决定毒力的主要 因素取决于其蛋白。但是随着研究的不断深入,越来越多的研究者认为的毒力不是由 单个因素决定的,而是由多个蛋白共同参与的 .,,病毒的两个节段对于病毒的毒力 都有影响。等, .,通过反向遗传结合定点突变技术,证实蛋白并非 是病毒复制所必须的蛋白。等也通过拯救一系列病毒结合致病性实验证实可以影响病毒 的复制和毒力 .,。但是这些以外的其他蛋白对于毒力的影响以及影响 毒力的基因位点的确定都还没有进一步的确定。对毒力的分子机制的研究也不是很透彻。 疫苗的研究也随着反向遗传系统的建立而有了新的思路 .,。新型疫苗主要 包括缺失病毒作为标记疫苗的研究和嵌合病毒作为疫苗的研究。最近,本课题组构建了表达 流行毒株主要保护性抗原的重组 ,免疫效果良好 .,。 .决定抗原变异,致病性及细胞嗜性的分子基础 由于聚合酶的低保真性,病毒也呈现出基因型的多样性。在动物机体以及环境的 选择性作用下,不断出现毒力更强,对现有免疫体系有抵抗力的新型病毒。早在年,在美国 的许多实验室就有报道,可以从免疫过疫苗的鸡场分离到的血清型抗原变异 株 ; ,。这些抗原变异株与经典毒株的抗体 不能发生病毒中和反应。单克隆抗体捕捉实验可以观察不同毒株的抗原差异。 年分离的所有经典毒株均可以与,,,,发生中和反应,而美国变异株,, .,; /缺失,而这个表位正是经典毒株最主要的中和表位 ? 。 对不同毒株的基因序列分析表明不同毒株的主要氨基酸差异集中在蛋白的 到位之间,尤其是在到以及到的两个亲水区,这是抗原变异的 分子基础 .,。第一个亲水区的氨基酸不直接结合单抗,但具有稳定抗原表位的 作用,第二个亲水区是与单抗结合必须的。在亲水区内氨基酸的替代都可能产生新的变异株 ., 近年来超强毒株出现了,超强毒在抗原性上没有发生太大的变异,但是能 引起鸡只大量急性死亡,且死亡率高达%以上,病原出现了毒力的变异。目前,的 毒力变异的分子机制也已成为研究的热点。对决定病毒毒力的分子机制的研究对于更好地了解病 毒的致病性有很重要的作用,从而可以更好地防控疾病。对于而言,超强毒株不能适应细 胞培养,随着病毒不断地在鸡胚传代,超强毒株可逐步适应细胞培养。而病毒 对细胞的适应性增 强往往伴随着病毒对鸡的致病性的减弱 ,。通过对超强毒株的原毒及其传代 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 致弱后的细胞适应株进行序列比对分析,发现上的,,位氨基酸位点的改变可以 使超强毒株适应细胞,同时也使毒力大大地减弱 .,。紧邻第二亲水区的高变 区内有一段富含的七肽区,也被认为与的毒力密切相关。 一直是研究的热点,并且被认为是决定毒力的关键性因素。但是, 的毒力是否是由单个蛋白决定的呢其他的蛋白以及两个节段的非编码区?部分是否 对其毒力也有影响呢不少学者也开展了相关的研究工作。等将血清型的毒株 的非编码区与血清型毒株的编码区嵌合而拯救出的病毒对鸡仍然保留有较高的致病性,从而认 为的非编码区部分对病毒的毒力没有影响 .,。等通过将强弱毒的 和蛋白相互置换拯救出嵌合病毒,认为及蛋白都不是毒力的决定性因素 .,。然而,等的研究发现的端对病毒的毒力有影响 .,。 所以,是否是毒力相关蛋白仍有待进一步研究。关于蛋白,也有人推测其与毒力相关,而可以影响病毒复制,在细胞凋亡中也有一定作用 .,; ., 。但是具体是否与毒力有关以及与毒力有关的分子机制仍需进一步证实。 除上述因素外,毒力也可能与两个节段的重排有关。研究者通过系统发生学比较发现 具有分子特征的基因组节段出现的时间比出现的时间提早了多年,而具有 分子特征的基因组节段出现的时间则与出现的时间大体一致。因此推测原始的节段与已发生变异的节段重组是出现;矿毒力变异的决定性因素 .,。而在强毒致弱的过程中,也发生了特定氨基酸的替代,蛋白可能与毒力 有关 .。。等将强毒的节段与弱毒的节段重配的病毒拯救出来,发现嵌 合病毒没有致病性,证明的致病性是两个节段共同作用的结果 .,。 关于病毒的细胞嗜性,是病毒和宿主因素共同决定的结果。病毒能感染一种细胞,首先需要 与细胞表面的病毒受体结合,才能进入细胞。而病毒表面的糖蛋白或农壳蛋白通常是与细胞表面 的受体相结合的蛋白,这些蛋白的突变往往能改变病毒的细胞嗜性。对于很多病毒来说,聚合酶 以及非结构蛋白也对病毒的细胞嗜性和毒力有影响。对于,决定其细胞嗜性的位点在 蛋白的,和位点上,这些位点的突变可以使不能适应细胞培养的超 强毒株适应细胞。节段的蛋白上也有决定细胞嗜性的位点,含有经典强毒株的节 段与疫苗株节段的重配病毒不能在细胞上救出,但可以从细胞中救出。后来证实 上的和位点可以决定病毒能否在细胞上的复制皿 .,。 . 的节段研究进展 基因功能的研究热点一直都聚焦在其节段,关于节段的研究相对较少。主要 原因 是因为编码宿主保护性抗原的基因位于病毒的节段,而且对于的致病 性和细胞嗜性都起着关键性的作用。但是,目前越来越多的研究发现决定致病性的并不是 单个基因,而是由多个蛋白共同作用的结果。病毒的两个节段对病毒的致病性和细胞嗜性均有影 响 .,。的节段,对于的流行也起了很大的作用。 的节段包括、和一个连续的,编码一种蛋白,蛋白,是病毒 的依赖的聚合酶。的一级序列与很多其他物种的聚合酶的一级序 中国农业科学院博士学位论文 第一章绪论 列有一定程度的同源性。关于的的晶体结构方面,已进行了很多深入的研究。目前关 于很多物种的依赖的聚合酶的晶体结构都已有了比较深入的研究。其结构通常包括一 个很保守的核心酶活性区域,形似右手状,包含有手掌、手指和拇指区 .,。手 掌区是其中最保守的区域,手掌区是由从到顺序排列的个基序组成的。这些 基序具体的作用机制还不是很清楚,可能与发挥其聚合酶功能有关。双病毒科的 有着与传统的依赖的聚合酶的晶体结构不同的一些独特的特性。最重要的一个特征就 是,双病毒科的蛋白缺失了聚合酶基序中的必要的“..”序列,而这个序 列在几乎所有的依赖的聚合酶中都是保守的,;。那么,蛋 白是通过怎样的途径来起催化作用呢最近的研究表明,双病毒科的蛋白是一种特殊 的依赖的聚合酶,其包含五个基序的排列顺序不以传统的顺序排列,而变为了 ..,而且基序的序列是】阻,其聚合酶的活性位点只有两个天冬氨酸 。 与其他病毒一样,双病毒科的蛋白负责双链基因组的复制和转录 。在体外的环境下,分离纯化的蛋白可以以病毒的正链为模板进行复制,; .,。双病毒科的蛋白通过一种以蛋白为引物的方法起始的合 成,即利用自身的氨基酸的羧基来引发的合成;。。根据的 三维结构,可将划分为三个功能结构域,即端结构域、端结构域和聚合酶中心活性区结 构域。其中端结构域由至位氨基酸残基构成,在蛋白引物起始基因组复制与转录中起重 要作用。中心活性区域包括到为氨基酸残基,其中包含了依赖的聚合酶所需 的所有基序,主要是具有依赖的聚合酶的功能,端结构域包含有到位氨基 酸,主要也是在蛋白引物起始复制转录中参与一些功能矾;。 一? 甲?’?日?啪啼‘‘?‘”埘??曲?竹“’毕四,?。竹矗 捌 : .?洲‘.,帆?叭’,儿,‘铟釜里匿曼?删饥??年订’? , ?, ?。 一 ?一四懈??一俩嗣奠 ?一?睁酾葡帚神窟鲤孽。麓塑堂 璺 一?四一”椭川.??雠舅邕苎堕笪璺幽 ?.九?,.??.?删自触.,悄 一?????‘褂?一一 一忡??啊丽?眦??日?抽?嘛岬???懈%脚???????眦??目 ?嘲??“打 ??柚? 一州竹‘?帅,??嘶?目..”“瞄。?蚪 图卜 的蛋白的晶体结构示意图 ,带状结构图。其中端和端区域分别标为黄色和红紫色。酶的中心活性区的 手指区标为蓝色,手掌区标为红 色,拇指区标为绿色。,的的二级结构序列。其中保守的基序按照顺序,,,,,, 被标为 灰色显示。 咖. 轧 删戤删 罢眦.谢廿 ”眦 .,.辩 ??巧缸峨 恤? ’ 曲 第一覃绪论 中国农业科学院博士学位论文 . , 关于节段与毒力的关系,最近也有一些报道。目前越来越多的学者倾向于认 为节段也参 与了的致病力的观点。等认为超强毒之所以比经典毒有更强的毒力,节段也 起了一 爸等也发现节段源于非强毒,而节段源于强毒的重 部分作用 .,。 组病毒的毒力比、节段均为强毒的病毒毒力要低妒 ,.。等也证实了蛋白 与病毒的毒力有关 .,。但是,节段究竟是如何影响的毒力,其具体功能位 点以及其分子机制均尚未可知。 .问题与展望 随着分子生物学技术的不断发展,反向遗传技术在中的应用,在的基因功能、 细胞嗜性、,决定毒力的分子基础、免疫抑制的分子机理等方面都有了很大 的进展和新的突破,从 而对也有了较好的防控。但是,仍然还有很多未知的问题等待解决。 关于病毒致弱的分子机理方面。目前的研究已经发现,的蛋白上的、和 位点可以决定病毒对的细胞嗜性,并且对病毒的毒力有至关重要的影响 .,; .,; .,; .,; .,; .,。 但是,法氏囊的损伤程度也可作为 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 毒力的一个 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,不同的细胞适应毒也会引起不同程度的 法氏囊损伤。例如,和都是两株细胞适应毒,其中在细胞上传代的代数比 更多,其中致病性比更低,带来的法氏囊损伤也更轻微 .,。另一 个例子则是,经典毒株和超强毒株的抗原性相似,上的这三个位点都是强毒特征 的,但是超强毒有更高的致死率,法氏囊的损伤也更为严重。这些现象也说明毒力 的强弱并不仅仅是由上的这三个位点决定的,其他的蛋白也会对的毒力有影响,那么 引起这些毒力差异的又是什么呢除了以外,其他的蛋白在的致病性中是否也有作用 呢它们又发挥了怎样的作用是通过怎样的机制发挥作用的呢除了病毒的编码区外, 的非编码区序列对于病毒的毒力以及复制是否也会有影响呢又是如何影响的呢这些问题都有 待进一步的研究。 关于病毒对细胞的入侵,在细胞中的复制、包装等过程,目前也并没有研究透彻。是 通过怎样的方式入侵宿主细胞呢在不同细胞的受体是否不同,又分别是什么引起病毒 细胞嗜性的宿主因素是哪些呢在细胞内的复制是怎样的一个过程呢聚合酶 通过什么样 的方式影响的复制的包装信号有哪些区域这些问题都有待更进一步的研究与探 索。 .本研究的目的及意义 鸡传染性法氏囊病是对世界危害严重的一种禽传染病。关于的基因功能研究,以前主 要是集中在其节段上。然而,越来越多的研究报道也证实了病毒的两个节段对病毒的致病性和 进化都有影响,节段的研究也逐渐成为研究的热点。但是目前关于节段的报道则相对 较少,关于节段与病毒的复制和致病性的分子机制研究很有限。 本研究旨在定位?,蛋白上与复制及毒力相关的区域及位点,并研究其影响复制及致 第一章绪论 中国农业科学院博士学位论文 病性的分子机制。本研究对深入而全面地了解遗传进化和复制以及致病性的分子机制具有 重要意义,为更好地防控鸡传染性法氏囊病提供重要的理论基础。中国农业科学院博士学位论文 第二章节段全长测序及序列分析 第二章 节段全长克隆及序列分析 摘要:传染性法氏囊病病毒可以引起鸡传染性法氏囊病。传染性法氏囊病病 毒的基因组节段编 码具有依赖的聚合酶活性的蛋白。本研究测定并分析了七株中国分离毒株 的节段全基因组序列并进行了致病性实验。通过致病性实验证实这七株病毒均属于超强 毒株,节段的进化分析上属于第群和第?群。通过进化分析,认为属于第?群的分离株 的节段可能来源于未知宿主,而属于第?群的.分离株的节段可能来源于欧洲。有八个 氨基酸残基 ,,,以及在第群和第?群的超强毒株中是 保守的,它们之中有可能包含有节段的毒力标志。而另五个氨基酸残基,,, 以及仅仅在第?群毒株中保守,这几个氨基酸残基可能是地域特征的分子标记。在 和上也有一些特征性的标记。在上,和在超强毒株中是保守的,在 上,在超强毒株中是保守的。 关键词:传染性法氏囊病病毒,节段,进化分析 鸡传染性法氏囊病在世界范围内流行,给养禽业带来了很大损失。起初,传染性法氏囊病可以 被疫苗有效地控制。然而超强毒株的流行使的防控面临了新的挑战,因为超 强毒可以抵御母源抗体的保护,并且其带来的致死率比较高。研究超强毒的致病机制等是近些年 的研究热点。流行病学研究对于研究的起源以及进化是很有帮助的,为进一步研究其毒 力的分子标志提供了理论基础。目前的研究工作大多集中于上,并有了很多突破性的发现, 也找到了上相关的毒力标记。然而近年来研究发现节段对于的流行及其高致病性 也有着很重要的作用,节段的研究也逐步开展起来。但是目前关于节段的研究相对较少, 节段的全基因组序列信息也不是很充分,给下游的基础研究工作带来了障碍。本研究进行了七株 中国分离株的节段全基因组序列的测定和分析,进一步充实了节段的全基因组序列 信息,为后期工作做了铺垫。 .材料与方法 ..病毒,鸡胚及实验动物 七株毒株均分离自传染性法氏囊病发病鸡场的病变严重的法氏囊组织,并由本实验室 处理,保存,病料的详细资料如表.所示。鸡胚和鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研 究所实验动物中心提供。 中国农业科学院博士学位论文 第二章节段全长测序及序列分析 袭.病毒分离株情况 ..主要试剂及引物合成 史蹦 为大连宝生物工程有限公司产品;提所用的试 剂为大连宝生物工程有限公司产品;。 为公司产品;酶 抑制剂和为公司产品;载体购于大连宝生物工程有限公司。质粒提取 试剂盒为公司产品。菌种为本实验室保存。采用分段克隆的策略获得的节 段全基因组序列,分段扩增的引物序列以及用于鉴定阳性克隆的引物序列见表,引物由英骏生 物技术有限公司合成。 表用于节段全长克隆所使用的引物骶..主要仪器 仪,生物安全柜,恒温培养箱上海精科实业有限公司, 第二章节段全长测序及序列分析 中国农业科学院博士学位论文 电泳仪.京市六一仪器厂,负压生物隔离器,连接仪,水浴锅上海一恒科技有限公司,低 温高速离心机 ,混合式研磨仪北京博力飞科技发展有限公司。‘ ..病毒的处理及的提取 病毒的处理方法同前述宇文延青论文宇文延青;所述,具体过程如下:将冻存的法氏 囊病料剪碎,以每克法氏囊组织加毫升的量加入含双抗的,用混合式研磨仪 将组织处理为匀浆状悬液。此悬液可用于病毒的提取和攻毒实验,实验剩余的放于? 冰箱中保存。 的提取是根据试剂盒的说明书进行的,具体方法如下: ; 取病毒悬液皿,置于. 管内,加入 试剂,混匀后室温放置 加入.氯仿于上述匀浆裂解液中,盖紧管盖,用力振荡至充分乳化,室温静 置 ; ; ,离心 吸取上清移入另一新的管中,加入等体积异丙醇,颠倒混匀后放室温静置 畦 ; ,离心 小心弃上清,缓慢加入 ; %乙醇洗涤沉淀,,离心 小心弃去乙醇,待沉淀于室温干燥后,加入 水溶解沉淀,于保存。 ..基因组序列的克隆 ...反转录 选用 ,以为特异性引物进行第一条链的合成。 具体步骤如下: ,然后迅速放 反应体系为:特异性引物弘, , 弘,作用 入冰浴。 取出,在管中加入. 嵋.肛,酶抑制剂/ ,? ,? 。将反转录获得的第一 ,反转录酶“。? 链放.?存放。 节段全基因组序列的扩增与克隆 以反转录所获得的为模板进行节段全基因组序列的扩增。为获得节段全基因 组 序列,采用了分段克隆的策略,即将节段划分为个区段进行克隆,每个区段之 间有一定的重 叠区域。在的节段的保守区域设计了三对引物,引物序列见表。三个区段的 扩增均使 用高保真酶研瓜珊 进行扩增。第一对引物和扩增到 ,? ,? 的序列,程序为:?;? ,个循环;?。 第二对引物和扩增 到 的大小为 的片段,程序为: ,? ,?;? ,个循环;? 。第三对引物和 ,? , 扩增到 ; 的大小为 的片段,程序为:? ? ,个循环;?。 产物的回收,连接,转化。由于使用峡高保真酶扩增的产物是平末端 第二章节段全长测序及序列分析 中国农业科学院博士学位论文 .载体进行’连接之前,先用 酶在产物末端加上,具体步 的,在与 延伸。然后分别将成功扩增了三个片段 骤为在产物中加入.“ 酶,? 的产物用胶回收试剂盒公司进行回收,并用%琼脂糖凝胶电泳检测回收产物 大 一载体, 小及得率。然后与载体进行连接,连接体系“为:在管中加入 , 产物,于连接仪过夜连接。转化过程为:从.冰箱取出保存的 此 感受态细胞,在冰上迅速融化,加入“连接产物,混匀后冰浴 ,?热应激 , ,再冰浴 ,加入 培养液,于?摇床培养 。然后取出, 离心 弃上清,将沉淀重悬,均匀涂布于的平板,在温箱过夜培养。 / 阳性克隆的鉴定。准备灭菌试管,将每个平板上长的菌落各挑取个,加入 管,置于?摇床培养. 。以,为引物,用酶进行菌液鉴定。 . 体系为: ,. , ,和引物各 ,酶. ,:? ,个 “,菌液模板. 。反应程序为:?,? , 。产物通过%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 循环;? 将菌液鉴定为阳性的克隆每个毒株的每个片段各取个重复送英骏生物工程 有限公司进行 测序。将三段所测序列拼接为完整的全长序列,将序列校正并上传于。 ..序列比对及进化分析 在上查找现有的的节段全基因组序列,利用软件对分离毒株的 节段全基因组序列进行序列比对。