小檗碱-壳聚糖复合膜在桃保鲜中对桃褐腐病菌的控制.

小檗碱-壳聚糖复合膜在桃保鲜中对桃褐腐病菌的控制摘要—简介由真菌桃褐腐病菌引起的桃褐腐病是桃储存期间一种常见的疾病，导致相当大的经济损失。我们前期的研究发现天然生物碱小檗碱对桃褐腐病菌有明显的抑制作用。材料方法：制备具有缓释作用的小檗碱-壳聚糖复合膜（BCCM）应用于桃的保鲜。实验水果储存在4℃环境中，并做以下处理：(I)确保果实是没有外包装的；(ii)在取出果实后立即将其浸在预凝固的BCCM液中然后取出；(iii)果实的涂层用BCCM，或用壳聚糖膜（不含小檗碱）；(iv)用PVC作果实涂层。结果和讨论：在储存40后，由于乙酸的细胞毒性,浸在BCCM溶液中的组显示出高感染率，但涂了BCCM涂层组只有10％的感染率。此外，与涂有壳聚糖膜（无小檗碱）组比，BCCM涂层组能显著降低感染率，清楚地证明了小檗碱的抗菌活性。因此，用BCCM薄膜包装桃果实并保存于4℃环境中，桃果实可以被很好地保存了40天，感染率很低。结论：考虑到其安全性和低成本，小檗碱-壳聚糖复合膜可以适用于在桃存储中疾病的控制。1简介桃(PrunuspersicaL.)是一种在全世界广泛种植，深受人们的喜爱的水果。由于它的收获期大约是在夏天和秋天温度较高时，果实很容易被真菌或细菌侵染，从而迅速腐烂。在众多影响储存的因素中，由子囊真菌桃褐腐病菌引起的桃褐腐病是主要的疾病。在过去的十几年中无数的化学试剂用来控制这种疾病[1,2]，但是由于化学杀菌剂的频繁应用使得桃褐腐菌产生了抗药性[1–5]。显然，常规化学杀菌剂不仅对桃褐腐菌没有作用了，而且也造成了环境的污染，使水果受到污染，进而造成对人类的威胁。由于以上这些原因，有必要从自然界寻求能替代的化合物。近年来，天然药物杀菌剂得到了广泛的研究[6,7]，.我们先前的研究报道小檗碱对桃褐腐菌有显著的抑制作用[8]，这一发现引起了我们用小檗碱控制褐腐病的兴趣。除了小檗碱以外，壳聚糖，一种研究的较为透彻的天然高分子材料，具有多种性能，如抑菌性[9–11],，成膜性，和环境友好性等，而且这些特征已经在植物保护和水果蔬菜的贮存中得到证实[12,13]。在本研究中，整合小檗碱壳聚糖的优点，研究小檗碱-壳聚糖复合膜（以下简称BCCM）制备以及在桃贮存病害控制方面的应用。对实验水果进行浸泡或者涂膜处理，将其储存在4℃环境中，测失重率和感染率。BCCM薄膜表现出显著的抗菌活性和极可观的保鲜效果。由于壳聚糖和小檗碱都是可生物降解、可食用的，BCCM不会带来新一波的“白色污染”，这对人类是有益的。因此，它在桃存储期病害管理方面有广阔的前景。2材料和方法2.1试剂和仪器85％脱乙酰度的壳聚糖，从金壳生物化学有限责任公司（中国）购买。小檗碱购自中国国家机构药品生物制品检定所。其他试剂均为分析纯。恒温振荡器和紫外-可见分光光度计是Varian公司，美国的产品。2.2复合膜的制备根据以前的实验，二十克壳聚糖粉末加入到1000毫升的2％乙酸溶液中，当完全溶解以后再分别按照10%(mL/mL)加入甘油、234.38µg·mL-1加入小檗碱。将混合物在室温下不断地搅拌，直到壳聚糖和小檗碱完全溶解，最终成为高粘度的溶液，然后保温培育以完全去除气泡。将其倒到一个平板铺平后，在室温下空气干燥30小时，将膜轻轻剥离（命名为BCCM）。 无小檗碱的膜被命名为壳聚糖膜（CM）。2.3BCCM中小檗碱释放试验为了确定小檗碱从BCCM的溶解速率，选择pH值6.8磷酸盐缓冲作为发送器。将BCCM的小碎片密封在透析袋中，将透析袋放入磷酸盐缓冲液中。将BCCM碎片用恒温型振荡器在27℃以每分钟100rpm旋转的，在设置的时间采样，每次采样后添加相同剂量的新鲜缓冲液。通过测定溶液在345nm处紫外吸收来测定小檗碱的吸光度，再将其变换为浓度值。小檗碱的的累积释放百分比按照以下公式计算：释放率(%)=C×[V/M]×S其中“C”是在每个取样时间溶液中小檗碱浓度（μg·ml-1）；“V”是采样介质的体积（ml）；“M”表示BCCM的重量（mg）;“S”表示的载药量[14]。2.4BCCM的抗真菌活性的研究从北京市平谷区（中国）商业果园采集桃褐腐菌，培养在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，通过无菌水冲浸生长菌的方式采集孢子。菌丝体经过滤筛选。孢子悬浮液以5×104个·mL-1的浓度均匀地分散在PDA平板，在中心放置一个小片BCCM/CM，一个相同的但没有放BCCM/CM薄片的PDA平板作对照。PDA平板在在27℃下培养并进行后续观察。所有操作都在无菌条件下进行，每个实验重复做三次。2.5桃在4℃下储存Okubao桃是在北京市平谷区是一个主要品种。重量相近的无病果实用自来水进行洗涤并在空气中干燥，三组的水果分别用传统的PVC膜，CM和BCCM封装。没有包装的水果用作对照。所有水果都用无菌针刺一个深3mm，直径4mm的伤口，桃褐腐菌孢子悬浮液（15ml，5×104spores/mL）喷在被刺水果的表面，储存在4℃下进行观察。2.6统计分析每个处理都做3个平行（50*3，一共150），所有数据都用SPSS10.0软件进行分析，所有数据都表示为平均值± 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 差(SEM)。用T-检验对数据进行分析，当P值小于0.5时认为是显著的。3结果3.1小檗碱从BCCM释放所制备的膜是柔性和涉及抗张强度和断裂伸长度（数据未显示）等机械性能合格的膜。小檗碱释放率在第一天达到10％，在随后的日子里，它的释放速率减慢，在第二十天累积释放速率达到30％（图1）。由于小檗碱的缓释作用，BCCM可以持续1个月抑制包括褐腐真菌桃褐腐菌在内的多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。3.2BCCM对桃褐腐菌的抑制通过研究BCCM的抗真菌活性的实验表明，在培养5天以后BCCM对桃褐腐菌的抑制可清晰地观察到（图2）。因为BCCM中小檗碱释放到PDA培养基中，BCCM周围的桃褐腐菌不能生长，相比之下，在CM覆盖的PDA平板由于缺乏小檗碱桃褐腐菌生长良好。3.3桃储存过程中的失重率由于BCCM和CM中的醋酸，浸渍处理的水果显示出明显的化学损伤，为了克服这个缺点，采用涂层处理。不同涂层处理以后的重量损失率（图3）。BCCM涂膜的保水效果优于对照组（P<0.05，表1），但它次于PVC组的，因为PVC有紧密的化学结构。CM和BCCM涂膜保水作用没有明显的差异。所有涂覆处理的水果每日重量损失率比浸渍处理组明显降低，因为BCCM溶液（浸渍处理）中游离乙酸侵蚀水果，促进了微生物入侵，导致腐烂，因此，它的重量损失率是很高的。3.4桃贮存期间的感染率PVC组的感染发病率明显高于对照组（图4，表I）主要是因为紧密的PVC薄膜保持高湿度，这促进了真菌和细菌的感染和传播。值得注意的是，BCCM组的感染发生率比CM低（P<0.05），清楚地表明小檗碱的抗微生物活性（图4）。此外，涂层组日均感染率明显低于浸泡组（BCCM薄膜与BCCM溶液相比：P<0.05，图5）。涂层组中的果实表面无肉眼可见眼的化学损伤（细胞毒性）（图6）。这个结果可以通过下面的原因加以解释：(i)BCCM是固体薄膜，从而减轻了乙酸在桃子表面的吸附；(ii)BCCM薄膜可以防止细菌和真菌感染水果；事实上，在4℃下的水果可以很好的保存，储存后40天观察水果没有萎缩或褶皱。总体而言，BCCM被证实在桃保鲜方面是一种很有前途的包装材料。4讨论褐腐病作为一个主要的采后病，大大降低桃的产量，虽然喷洒或熏蒸化学杀菌剂畅销，但它们在应用中遇到了障碍[15,16]。近年来，常规化学杀真菌剂的市场已经削减，很大量的努力放在生物防治上，混合杀真菌剂[17–19]或天然存在的杀真菌剂，尤其是那些从药用植物中提取的成分[6,7]。在这里，小檗碱和壳聚糖均属于天然化合物。一方面，作为一种引导化合物，它们可能是由结构修饰发展成新的杀真菌剂（非天然化合物），另一方面，由于其生物亲和性，其组合可能在抗微生物活性方面有突出的表现。这种“鸡尾酒”策略是按照中国传统医药中使用不断释放的成分调节疾病，包括主导成分和辅助辅助成分[20]。从我们的研究中可以得出两个主要的结论，(i)该BCCM可以在模拟环境（pH值6.8的磷酸盐缓冲液）中缓慢释放小檗碱，尽管实际的储存条件下可能与模拟条件不同，小檗碱可能会由于果实呼吸引起的高湿度从BCCM逸出。BCCM的抗菌活性远高于CM（不含小檗碱），清楚地表明小檗碱对水果周围病原体的抑制。(ii)用BCCM包装的果实可以在25°C下保存20天或者是在4°C保存40天。本研究的新颖之处是壳聚糖和小檗碱的整合。据我们所知，这是壳聚糖与小檗碱整合用于控制桃褐腐病的第一次报道。BCCM的抗微生物活性可以用以下理由解释：首先，丰富的研究已经验证小檗碱广泛的光谱抗菌性，不仅抑制革兰氏阳性菌[21],，同时抑制革兰氏阴性菌[22],；第二，小檗碱延缓一些真菌的缓生长[23]，例如我们之前报道的小檗碱抑制桃褐腐菌[8]。除此之外，壳聚糖也有抑菌作用[24]。小檗碱与壳聚糖的结合可能会有更广阔的抑菌范围，经过BCCM处理的水果表面微生物的数量应该减少。作为一种可食用的化合物，壳聚糖是自然界中少有的研究较为透彻的基础聚合物。它的生物可降解性、生物亲和性、低毒性、成膜可塑性以及良好的渗透性已经引起人们广泛的兴趣。此外，壳聚糖可以诱导植物产生防御反应，令人遗憾的是，制备BCCM时，壳聚糖是用醋酸溶解的，对水果造成了意外的损坏，因此虽然成分相同，但是BCCM溶液浸泡不适于储存桃。不过，我们可以设想的最终目标是：紧贴在水果上的BCCM会抑制大多数围绕水果的微生物，但没有细胞毒性。为了实现这一目标，深入研究是必需的，包括选择适当的膜成分和成膜的优化方法。关于小檗碱在水果上的残留，它很可能被监控，但有一个阈值极限，低于该含量对于消费者没有危险。低剂量的小檗碱残留物是安全的，因为小檗碱是一种传统的止泻药，亚洲人使用了几个世纪。与浸渍处理相比，BCCM涂层处理更有优势，进一步的优化，含有小檗碱复合膜可以适用在桃保鲜过程中疾病的控制。图1小檗碱-壳聚糖复合膜中小檗碱的体外释放（20天以上）实验图2小檗碱-壳聚糖复合膜（BCCM）体外抑制桃褐腐菌实验三种不同的处理（对照组：没有涂层；培养基中间盖一小片壳聚糖膜；培养基中间盖一小片小檗碱-壳聚糖复合膜（BCCM））图3储存在4℃下不同包装处理的桃子的失重率（CM壳聚糖膜；BCCM小檗碱-壳聚糖复合膜；PVC聚氯乙烯薄膜）表1在4℃下存储40天后不同包装处理的桃子的性能（CM壳聚糖膜；BCCM小檗碱-壳聚糖复合膜；PVC聚氯乙烯薄膜）所有结果都是与对照组相比较*表示与对照组相比有更高的感染率图4储存在4℃下不同包装处理的桃子的感染发病率（CM壳聚糖膜；BCCM小檗碱-壳聚糖复合膜；PVC聚氯乙烯薄膜）图5用小檗碱-壳聚糖复合膜（BCCM）处理的桃子与用浸泡在BCCM溶液（预凝固）中的桃子感染发病率的比较图6不同包装处理的桃子的存储40天后的状态（CM壳聚糖膜；BCCM小檗碱-壳聚糖复合膜；PVC聚氯乙烯薄膜）致谢本工作是由北京市科协中国科技的北京金桥项目资助。References[1]HolbI.J.,SchnabelG.,DifferentialeffectoftriazolesonmycelialgrowthanddiseasemeasurementsofMoniliniafructicolaisolateswithreducedsensitivitytoDMIfungicides,CropProt.26(2007)753–759.[2]LuoC.X.,SchnabelG.,ThecytochromeP450lanosterol14-demethylasegeneisademethylationinhibitorfungicideresistancedeterminantinMoniliniafructicolafieldisolatesfromGeorgia,Appl.Environ.Microbiol.74(2008)359–366.[3]MaZ.H.,YoshimuraM.A.,MichailidesT.J.,IdentificationandcharacterizationofbenzimidazoleresistanceinMoniliniafructicolafromstonefruitorchardsinCalifornia,Appl.Environ.Microbiol.69(2003)7145–7152.[4]LuoY.,MaZ.H.,MichailidesT.J.,QuantificationofalleleE198Ainbeta-tubulinconferringbenzimidazoleresistanceinMoniliniafructicolausingreal-timePCR,PestManag.Sci.63(2007)1178–1184.[5]HolbI.J.,SchnabelG.,ThebenefitsofcombiningelementalsulfurwithaDMIfungicidetocontrolMoniliniafructicolaisolatesresistanttopropiconazole,PestManag.Sci.64(2008)156–64.[6]PonceA.G.,RouraS.I.,delValleC.E.,MoreiraM.R.,Antimicrobialandantioxidantactivitiesofediblecoatingsenrichedwithnaturalplantextracts:invitroandinvivostudies,PostharvestBiol.Technol.49(2008)294–300.[7]FengX.Y.,WangB.G.,LiW.S.,ShiL.,CaoJ.K.,JiangW.B.,Preharvestapplicationofphellodendronbarkextractscontrolsbrownrotandmaintainsqualityofpeento-shapedpeach,HortScience43(2008)1857–1863.[8]HouD.Y.,YanC.Q.,LiuH.X.,GeX.Z.,XuW.J.,TianP.F.,BerberineasanaturalcompoundinhibitsthedevelopmentofbrownrotfungusMoniliniafructicola,CropProt.29(2010)979–984.[9]HelanderI.M.,Nurmiaho-LassilaE.L.,AhvenainenR.,RhoadesJ.,RollerS.,ChitosandisruptsthebarrierpropertiesoftheoutermembraneofGram-negativebacteria,Int.J.FoodMicrobiol.71(2001)235–244.[10]TakahashiT.,ImaiM.,SuzukiI.,SawaiJ.,Growthinhibitoryeffectonbacteriaofchitosanmembranesregulatedwithdeacetylationdegree,Biochem.Eng.J.40(2008)485-491.[11]HosseiniM.H.,RazaviS.H.,MousaviM.A.,Antimicrobial,physicalandmechanicalpropertiesofchitosan-basedfilmsincorporatedwiththyme,cloveandcinnamonessentialoils,J.FoodProcess.Preserv.33(2009)727–743.[12]CampanielloD.,BevilacquaA.,SinigagliaM.,CorboM.R.,Chitosan:antimicrobialactivityandpotentialapplicationsforpreservingminimallyprocessedstrawberries,FoodMicrobiol.25(2008)992–1000.[13]SangsuwanJ.,RattanapanoneN.,RachtanapunP.,Effectofchitosan/methylcellulosefilmsonmicrobialandqualitycharacteristicsoffresh-cutcantaloupeandpineapple,PostharvestBiol.Technol.49(2008)403–410.[14]YuC.Y.,ZhangX.C.,ZhouF.Z.,ZhangX.Z.,ChengS.X.,ZhuoR.X.,Sustainedreleaseofantineoplasticdrugsfromchitosan-reinforcedalginatemicroparticledrugdeliverysystems,Int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