酶工程亲和层析.

五、亲和层析由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：功能层析（functionchromatography）生物专一吸附（biospecificadsorption）选择层析（selectivechromatography）1.原理利用生物大分子与配基间所具有的专一而又可逆的亲和力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附，杂质则不被吸附，从层析柱流出，变换洗脱条件，即可将欲分离的物质洗脱下来，实现分离提纯。+CCC配基蛋白质1.配基固相化2.亲和吸附固体载体3.解吸附Affinitychromatography2.基质（载体、母体）的选择理想的基质应满足以下要求：①高度的亲水性。②极低的非特异性吸附性（惰性）。③具有足够的化学基团。④适当的多孔性。⑤较好的理化稳定性。可被应用的基质：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。最常用的是琼脂糖，Sepharose1B到10B3.配体（配基）的选择一对可逆结合的生物分子中与载体相偶联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体，辅酶等。优良配体须具备的条件：1）与待纯化的物质有较强的亲和力。2）具有与基质共价结合的基团。目的产物与相应的配基所要分离的目的产物相应的配基酶抗体凝集素激素底物、抑制剂、辅酶（辅因子）抗原、病毒、细胞多糖、糖蛋白、细胞受体受体、载体蛋白4.偶联（亲和吸附剂的制备）配体一定，改造载体（基质）1）基质活化：不同的载体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基2）引入连接臂又称手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose4B常用手臂5.操作：1）层析前：制备亲和层析剂选择根据欲分离物质特性配基选择根据配基分子大小及基团特性载体2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。包括：非专一性洗脱和专一性洗脱偶联亲和层析剂非专一性洗脱：改变温度改变pH值改变离子强度专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似物）被吸附物质结合竞争性地与配体结合6.应用1）纯化大分子物质如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的结构与功能：分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。7.亲和层析方法根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析(1)共价亲和层析共价亲和层析是生物大分子中的功能性基团与层析剂上配基形成可逆性的共价键的一种分子分离方法。具有共价反应活性的巯基亲和层析剂可用葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为母体。通过溴化氰(BrCN)活化,先后用谷胱甘肽及2’,2’-吡啶基二硫基化合物处理,而得到谷胱甘肽型巯基层析剂。(2)疏水层析酶蛋白通常含有疏水性较强的氨基酸,如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸等。采用氨基烷烃与BrCN活化的琼脂糖进行反应,就可形成改性的琼脂糖。酶蛋白可以与亲和层析剂上改性琼脂糖的烷基发生疏水结合反应,而得以分离。将一系列长度不同的碳氢化合物接到琼脂糖载体上,从而得到一系列相应的疏水性琼脂糖层析剂,可用它们分离纯化某些酶和蛋白质。疏水亲和吸附通常在高浓度盐溶液的条件下进行。通过逐步降低盐浓度,可以将疏水吸附的组分洗脱出来。环境的温度和pH值对疏水吸附和洗脱都有影响,要根据情况进行必要的控制。(3)金属离子亲和层析蛋白类酶和其他蛋白质 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面的某些氨基酸残基,如组氨酸的咪唑基团,半胱氨酸的巯基,色氨酸的吲哚基团,可与金属离子亲和结合。用螯合剂可以将金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等)鳌合到母体(如交联化的琼脂、葡聚糖等)的表面上制成金属亲和层析剂。将金属亲和层析剂装进层析柱,浸泡平衡,洗涤后,将含有酶等生物活性物质的样品柱上,与金属配基有亲和力的分子都将被留在柱内,其余组分则流出柱外。洗脱：可通过改变盐的浓度,或改变pH值等降低金属离子和蛋白质之间的亲和常数的方法。或用竞争性试剂,如咪唑、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等,将蛋白质置换下来。洗脱方式：分级洗脱或梯度洗脱方式主要优点：可用不同的金属离子结合到螯合载体上,并可用一种更强的螯合剂将所使用的金属离子洗脱下来,从而实现母体的再生。螯合剂较稳定,金属的亲和特性不会大幅下降。通过选择适宜的金属离子,可实现蛋白质和配基之间的不同吸附。在大多数情况下,从亲和层析柱上洗脱下来的酶,仍然具有生物活性。(4)免疫亲和层析抗原和抗体是一种生物分子对,它们之间具有高度专一的亲和力。用适当的方法将抗原(或抗体)结合到母体上,制成亲和层析剂,便可用来高效地分离和纯化与其互补的抗体(或抗原)。免疫亲和层析又称为抗体亲和层析,除了可以采用抗原或抗体作为配基以外,通常还采用用蛋白A或蛋白G作为配基使用。蛋白A或蛋白G对于各种来源的免疫球蛋白IgG的Fc区域都具有高度专一的亲和性,与各种母体(如琼脂糖等)结合后,广泛作为亲和层析剂使用。蛋白A是从金黄色葡萄球菌中得到的一种相对分子质量为42000的蛋白质。蛋白A分子的6个区域中,有5个可与IgG结合。通常1分子蛋白A至少可结合2分子的IgG。蛋白G是一种细胞表面蛋白,是Ⅲ型Fc受体。蛋白G对于IgG有很强的结合亲和力,但对白蛋白的亲和结合力较弱。蛋白A和蛋白G对IgG的专一性有所不同,蛋白A的结合专一性较强,而蛋白G的结合专一性较弱,所以蛋白G可以与更多的IgG亚种结合,更适应于一般抗体的分离纯化。(5)染料亲和层析一些有机染料,如蒽醌化合物、偶氮化合物等,具有类似于NAD+的结构。一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶,对这些染料有一定的亲和力。常用的有机染料是二羟偶氮化合物。以这些染料作为配基,共价偶联到纤维素或琼脂糖等母体上,制得染料亲和层析剂。已成功地用于以NAD+、NADP+、ATP为辅酶的多种酶的分离纯化。(6)凝集素(lectin)亲和层析凝集素是一类能与糖的残基专一而又可逆结合的蛋白质。它们能与多糖、糖蛋白及红细胞和肿瘤细胞的凝集体等亲和结合。凝集素亲和层析可以用于各种糖蛋白的分离纯化。例如,胞外超氧化歧化酶(ECSOD)具有3种同工酶,都是含铜锌离子的糖蛋白。用肝素、琼脂糖凝胶等为母体,以凝集素为配基制成亲和层析剂进行亲和层析,可以将这3种同工酶分离纯化。六、层析聚焦层析聚焦是将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起,实现组分分离的技术。在层析系统中,柱内装上多缓冲离子交换剂,当加进两性电解质载体的多缓冲溶液流过层析柱时,在层析柱内形成稳定的pH梯度。欲分离酶液中的各个组分在此系统中会移动到(聚焦于)与其等电点相当的pH位置上,从而使不同等电点的组分得以分离。1.交换剂和缓冲液体系(1)多缓冲离子交换剂:用于色谱聚焦的离子交换剂是一种专门开发的多缓冲离子交换剂,如PBE118(适用于等电点在pH8～11的两性电解质的分离)和PEB94(适用于等电点在pH4～9的两性电介质的分离)离子交换剂。它们是以交联琼脂糖6B(sepharose6B)为母体,并在糖基上通过醚键偶合上配基制成的。商品通常是以悬浮液形式提供。(2)多缓冲溶液:是专门开发的含有两性电解质载体(由分子质量不同的多种组分的多羧基多氨基化合物组成)的多缓冲溶液。如Pharmacia-LKB公司专门生产的Poly-buffer96和Polybuffer74,分别适用于pH6～9和pH4～7范围的层析聚焦,与这两种多缓冲溶液相匹配的多缓冲离子交换剂是PBE94。对于pH9以上的层析聚焦,则选用含有pH8～10.5的两性电解质载体的多缓冲液,并配以相应的多缓冲离子交换剂PBE118。多缓冲溶液通常以无菌的液体形式提供,用前加以稀释。2.pH梯度的形成层析聚焦系统的pH梯度,是利用多缓冲离子交换剂本身的带电基团的缓冲作用自动形成的。例如,选用阴离子交换剂PBE94装进层析柱,选择与之配套的PB96为多缓冲液。先用起始多缓冲液平衡到pH9,再用pH6的多缓冲液流经层析柱,开始时流出液的pH值接近于9,随着洗脱液的不断加入,流出液的pH值逐步下降,最后流出液的pH值达到6。柱内就形成了从pH6到pH9的连续升高的pH梯度。3.层析聚焦的操作过程(1)多缓冲离子交换剂和多缓冲溶液选择:根据欲分离的组分的等电点,选择适宜的多缓冲离子交换剂和多缓冲溶液。(2)形成pH梯度:将离子交换剂装进层析柱,用pH9的起始缓冲液进行平衡,再用pH6的多缓冲液流过层析柱,直至流出液从pH9降低到pH6为止。层析柱内就形成了从pH6到pH9连续升高的pH梯度。(3)上柱聚焦:将酶液加到层析柱中,让其慢慢流过层析柱。在上柱过程中,当环境的pH值低于该酶的等电点时,该酶带正电,不与阴离子交换剂发生交换,而随着流动相向下移动;当环境的pH值稍高于该酶的等电点时,该酶分子带负电荷,可与离子交换剂结合,不再移动;而走在后面的相同的酶,仍以洗脱液的流动速度下移,直至稍低于其等电点处与离子交换剂结合,从而实现聚焦。(4)洗脱:用pH6的多缓冲液PB96作为洗脱液进行洗脱，在洗脱过程中,阴离子交换柱内环境的pH值不断下降,当pH值低于酶的等电点时,酶又重新带上正电荷,脱离离子交换剂而被洗脱;移至pH值大于等电点的位置时,又重新与离子交换剂结合,这样不断重复洗脱—吸附—再洗脱的过程,直至从层析柱上流出。(5)再生:洗脱完成后,离子交换树脂可以经过再生处理,反复使用。再生过程与上述步骤(2)相同,即先用pH9的起始缓冲液进行平衡,再用pH6的多缓冲液流过层析柱,直至流出液的pH值从pH9降低到pH6为止。