第15章 细小病毒科(Parvoviridae)

第十五章细小病毒科(Parvoviridae)一、概述二、细小病毒科基因组的结构与功能三、细小病毒科的基因转录四、病毒蛋白五、病毒复制的内在环境六、基因表达调节（一）细小病毒基因表达本身的调节（二）依赖性细小病毒与辅助病毒在基因表达调节水平上的相互关系七、细小病毒的繁殖八、细小病毒感染的分子病理主要参考文献一、概述　　由于本科病毒体积很小，多数成员的致病性不明或不引起严重疾病，不太引起人们的注意，所以发现较晚。只有在病毒分离培养技术显著提高和电子显微镜广泛应用之后，一些病毒学家才偶然地从一些生物材料如继代细胞系培养物和动物的肿瘤组织中发现了这类病毒，从而找到了为病毒学家早已预言的最小单链DNA病毒。研究表明，本科病毒在自然界的分布极为广泛，并与多种疾病有关，从而才开始引起病毒学者的重视。1．分类现状在国际病毒分类委员会第六次 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 中，根据病毒的宿主不同，该科分成两个亚科，即细小病毒亚科(Parvovirinae)和浓病毒亚科(Densovirinae)，前者的宿主是脊椎动物，后者的是节肢动物。细小病毒亚科分为细小病毒属(Parvovirus)、红病毒属(Erythrovirus)和依赖病毒属(Dependovirus，相当于原来的腺病毒伴随病毒属)。浓病毒亚科下设三个病毒属：浓病毒属(Densovirus)、艾特拉病毒属(Iteravirrus)和康特拉病毒属(Contravirus)。该亚科的成员均分离自节肢动物，有6个正式成员和13个暂定成员。细小病毒科病毒的分类现状见表15-1。表15-1.细小病毒科病毒的分类现状科牙科属代表株成员细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒亚科（Parvovirinae）细小病毒属（Parvovirus）细小病毒r—1（大白鼠病毒，Kilham）。美国阿留申群岛水貂病病毒（Aleutianminkdiseasevirus）牛细小病毒（Bovineparvovirus）猫细小病毒（Felineparvovirus）猫全白细胞减少症病毒（Felingpanleukopeniavirus,FPLV）水貂肠炎病毒（Minkenteritisvirus,MEV）狗细小病毒（Canineparvovirus,CPV）鹅细小病毒（Gooseparvovurus）鼠H1病毒兔细小病毒（Lapineparvovirus）LuⅢ病毒小鼠细小病毒（Minuteofmice,MVM）猪细小病毒（Porcineparvovirus）RT病毒TVX病毒依赖性病毒属（Dependovirus）腺病毒相关病毒1型（Adeno—associatedvirustypeI,AAV1）AAV2型，AAV3型，AAV4型禽AAV，牛AAV，狗AAV，马AAV，羊AAV。红病毒属(Erythrovirus)浓病毒亚科(Densovirinae)浓病毒属（Densovirus）大腊螟浓核症病毒（DensovirusofGalleriamellonella—Lepidoptera）。Junonia,Acheta,Aedes,Bombyx,Diatraea,Nymphalidae和Sibine的浓核症病毒。艾特拉病毒属(Iteravirrus)康特拉病毒属(Contravirus)细小病毒属又称“细小DNA病毒属”，是本病毒科中最主要的病毒属，我们将对其重要代表分别予以叙述。而对其余的病毒属，则只扼要介绍如下。　　依赖病毒属以腺联病毒(AAV)1型为代表种，另包括腺联病毒2型、3型、4型和5型以及鸡腺联病毒、牛腺联病毒、犬腺联病毒、马腺联病毒和绵羊腺联病毒。腺联病毒是一类缺损病毒，它们的基因组不完备，必须在有辅助病毒——腺病毒与之同时存在的条件下，才能复制出有感染性的后代。本属病毒的一个显著特点是其DNA呈互补性，也就是说，在同一种病毒中有的病毒粒子中含有正极性的DNA，有的病毒粒子中含有负极性的DNA，即含有不同极性DNA的病毒粒子同时存在。在DNA提取过程中，不同极性的核酸分子，很容易发生退火，形成互补的双股DNA。上述特性引起了病毒学者的注意。AAV1、AAV2与人类有关，有的研究者发现30%的儿童含有抗AAV抗体，并常同时发现抗腺病毒的抗体。马AAV是Dutto1975年从患呼吸道病驹分离获得的。在比利时，很多牛含有抗牛AAV抗体。犬AAV是从犬肝炎病毒培养物中分离出来的，很多日本犬的血清中含有抗体。禽AAV是从鹌鹑支气管炎病毒培养物中分离来的。腺联病毒的致病性，目前尚不清楚。红病毒属仅有一个成员，即B19病毒(B19V)。B19V是自主复制病毒，与AAV一样，正、负极性的DNA分子均可以作为病毒的基因组。B19V是人的一种病源，主要引起人的皮疹、慢性溶血性贫血和孕妇流产、死胎。其靶器官是骨髓，主要引起骨髓中的成红细胞和外周血液中的网织红细胞的消失。浓病毒亚科病毒均能自我复制，不依靠辅助病毒。其DNA也是互补的，在人工提取过程中能自动形成双股DNA。细小病毒的基因组长约5000nt,在线性单链DNA(ssDNA)分子的3和5端均有发夹结构。3端的发夹结构长115～116nt，5端的长200～242nt。多数成员的基因组既可是负极性DNA分子，也可是正极性DNA分子，而少部分成员的基因组只是负极性的DNA分子。基因组有2个主要的ORF：NSORF和SORF，前者的产物为基因复制和转录所必需，后者编码衣壳蛋白。某些病毒还有一些较小的ORF。鼠细小病毒(MMV)的NSORF编码2种非结构蛋白NS1和NS2，而其SORF则编码3种结构蛋白VP1～3。VP1和VP2的序列大部分相同，只是VP1的氨基端多了一部分氨基酸序列，而VP3则是由VP2在蛋白酶作用下裂解而来。其它大部分细小病毒的结构蛋白的合成亦与此相似。本科病毒无论从大小和形态上，都与小RNA病毒相似，它们之间的相似形态和不同的核酸类型，恰好互相对应。本科病毒的拉丁语名称Parvoviridae中的“Parvo”系细小之意。其共同的形态结构特征是：无囊膜，直径约18～26nm，二十面体对称，衣壳约由32个长3～4nm的壳粒构成。病毒粒子在氯化铯溶液中的浮密度较大，为1.39～1.42g/cm3。立体对称的衣壳包围着一个分子的单股线状DNA。核酸的分子量为1.5×106～2.0×106。碱基中G＋C的含量占核酸总量的41%～53%。本科病毒的一个突出特点是对外界因素具有强大的抵抗力，能耐受脂溶剂和较高温度的处理，而不丧失其感染性。病毒在细胞核内增殖。某些细小病毒需要有辅助病毒的协助才能增殖，另一些细小病毒虽能自行复制，但需依赖细胞有丝分裂过程中的某些功能。　人们提出了许多细小病毒基因组的复制模型。有的模型比较简单，有的则较为复杂。但不同模型的基本点一致，即先以3端发夹结构的3—OH为引物合成基因组的互补链，形成复制型中间体(RF)，再通过RF产生子代病毒的基因组。现以AAV为例说明细小病毒的复制过程(图15-1)。细小病毒科（Parvoviridae）是目前在细胞病毒中属于最小最简单的一类单链线状DNA病毒（Siegletal1985），无包膜，毒粒直径20~26nm，呈二十面体，大部分有3个衣壳蛋白（60~80K），后者氨基酸有重叠，较大分子量的一种在NH2端有附加氨基酸。毒粒内含有单分子的单链DNA，分子量为1.5MD（约5Kb）。具有感染性的毒粒为110S，而缺少DNA的毒粒为65S，在CsCl中的浮密度为1.39~1.42g/ml。可分为三个属：（一）细小病毒属（Parvovirus）本属病毒毒粒内的线状单链DNA分子的5’端和3’端有发夹结构。本属大多数成员的成熟毒粒内含有负链DNA，但其它成员，则掺有1%~50%的正链DNA。大多数成员有血凝素，对不同红细胞有不同活性。病毒在核内繁殖，可以独立复制，病毒的繁殖依赖于宿主细胞的某些功能，在细胞的S期繁殖良好，形成核内包含体。该病毒的自然宿主为猫，牛，狗，鹅，水貂，浣熊，小鼠，猪，家兔，大白鼠等。在实验感染的条件下，其宿主范围更大些。鼠类病毒和LuⅢ在金黄地鼠中也能繁殖。某些病毒种还可以通过胎盘传播，有报道鹅的细小病毒可经卵传代。（二）依赖性病毒属（Dependovirus）即腺病毒伴随病毒属（Adeno—associatedvirus,AAV）在成熟毒粒内或含有正链DNA，或含有负链DNA，来自不同毒粒的正、负单链DNA在试管内可以形成双链DNA结构。所有的AAV均具有共同的抗原性。它不能独立繁殖，它的繁殖依赖于辅助病毒，后者包括腺病毒和疱疹病毒。（三）浓核症病毒属（Densonucleosisvirus,DNV）或浓病毒属（Densovirus）细小病毒属和依赖性病毒属均为脊椎动物病毒，而浓病毒属则为非脊椎动物病毒，主要是从蝴蝶和蛾类分离到的。早于1968年在日本Ina城郊的家蚕（Bombyxmosi）流行了一种病毒病，其病原定名为家蚕核浓缩病毒（Bombyxmoridensonucleosisvirus,BombyxDNV）。这类病毒毒粒约22nm，含有正链或负链DNA，后者在试管内可以形成双链。它可在幼虫、蛹、成虫的大多数组织中独立地繁殖。受染细胞核增大。由于毒粒的积贮形成浓的粗大的核内物质。主要宿主是鳞翅目（Lepidoptera），可能包括双翅目（Diptera）和直翅目（Orthoptera）。二、细小病毒科基因组的结构AAV毒粒中，一半含有正链DNA，一半含有负链DNA；而在能独立繁殖的病毒毒粒中，所包装的正、负链DNA的比例则有较大差别：MVM和H1的毒粒中99%为负链（反义），牛细小病毒毒粒中，75%~80%为负链，而人的B19病毒毒粒中，正负链的比例相等（Bateetal1984,Cotmoreetal1984,Siegletal1985），LuⅢ病毒仅包装负链或根据宿主细胞，正负链机率相等（Batesetal1984）。细小病毒属和依赖性病毒属基因组最大的不同在于其末端序列的组成。AAVDNA有一末端倒置重复序列，145bp（Lusbyetal1980），末端125bp是回文结构，但是总体的回文结构又被2个短的回文序列所中断，后者对称性地位于较大的回文结构中心的任一边。因而末端125bp可折成T形结构（或Y形结构），后者可能作为DNA复制的引物（Bernsetal1983）。这一结构对AAVDNA的复制是十分重要的。至于可以独立繁殖的细小病毒，它的两个末端也呈回文结构，但是，彼此序列不同（Rhodeetal1982），在基负链（或毒粒链）的3’端的回文序列约120bp长，也大约在中央被2个小的回文结构所中断。因此，在折叠时也形成T形（或Y形）结构，就象AAVDNA的情况一样。而DNA链的5’端，其回文序列较长，约160~200bp，其序列与3’端的不同（图11-1，2）。人B19病毒的末端序列是重复的（Shadeetal1986）。图11-1.细小病毒属和依赖性病毒属DNA结构示意图（引自Fraenkel—Conratetal1988）相应的大写和小写字母表示序列互补图11-2.（a）大白鼠K病毒3’端的DNA序列;（b）AAV3’端的DNA序列（引自Fraenkel—Conratetal1988）AAV2以及一些细小病毒属的基因组的全序列已经测定（Lusbyetal1982;Srivastavaetal1983;Rhodeetal1983;Astelletal1984;Shadeetal1986）。家蚕浓核症病毒的基因组大部分序列也已测定（Bandoetal1987）。它们的基本结构是相似的，MVM和AAV2有两个大的ORF，每一个ORF大约占基因组的一半，左侧ORF涉及调节功能，右侧ORF编码结构蛋白（图11—3）。序列分析表明，在人B19病毒，MVM和AAV的左侧调节区，甚至右侧结构蛋白编码区均有明显的同源序列（Shadeetal1986）。人B19与AAV基因组之间的同源性比人B19与MVM之间的同源性稍大些。图11—3（a）MVM基因组结构示意图;（b）AAV2基因组结构示意图mRNA大小以Kb表示之（引自Bernsetal1987）家蚕DNA至少有3个ORF，其中ORF2编码病毒的结构蛋白，它相当于AAV2和MVM的右侧ORF（ORF—R）；而家蚕DNA的ORF1相当于AAV—2和MVM的左侧ORF（ORF—L），后者编码两个非结构蛋白NS1和NS2。同样家蚕DNA的ORF1也编码病毒的非结构蛋白。家蚕DNA与MVM和AAV2不同的是它还有一个ORF3，由基因组的另一条链编码，它编码167个氨基酸，可能是非结构蛋白，这一ORF是昆虫细小病毒和哺乳动物细小病毒的差异所在。比较细小病毒属（H1，MVM），依赖性病毒属（AAV2）和浓病毒属（DNV）的DNA序列，发现家蚕DNV有300个核苷酸与其它二属病毒有很高的同源性。这一同源区位于家蚕DNV的ORF2和相应的哺乳动物细小病毒的ORF—L中（Bandoetal1987），即DNV：1721—2023H1：1407—1701MVM：1404—1699AAV：1271—1562这类病毒的单链DNA，与其它大多数单链DNA噬菌体一样，富有胸腺嘧啶（大约30%）。可以独立繁殖的细小病毒的DNA无感染性，只有双链的AAVDNA在辅助病毒存在的条件下才有感染性。三、细小病毒科的基因转录如图11—2所示，MVM有两个启动子，分别位于4和38基因图单位（mu）（Pinteletal1983;Carteretal1983）。有三个主要转录物，有两个转录物在P4启动子下游，两者在46和48mu处都有一个小的内含子，其中一个有第二个较大的拼接区（10~40mu）。第三个转录物始于38mu，在46和48mu处有一小的内含子。所有三个转录物均终止于95mu处，在5’端有帽子结构，在3’端有聚A。AAV的转录物较小，它有3个启动子，分别位于5mu，19mu和40mu（Lusbyetal1982;Carteretal1983）。在41和46mu处有一内含子，有不同程度的拼接。所有三种转录物均终止于96mu，5’端有帽子结构，3’端有聚A尾。B19病毒更相似于AAV，在感染后期从胞浆提取的主要RNA，均起始于38~40mu，后者翻译成结构蛋白（Jayetal1981）。四、病毒蛋白AAV2毒粒有三种结构蛋白，VP1，92K；VP2，72K和VP3，65K。其中VP3占全部结构蛋白的80%。体外翻译试验的结果表明，所有三种蛋白均由拼接的p40转录物所翻译（Jayetal1981）。能独立繁殖的细小病毒衣壳的三种结构蛋白在大小上与AAV相似。但是，根据宿主细胞种类和感染的时间，其VP2和VP3的相对量有所差异（Johnson1983）。家蚕DNV的右侧转录物ORF2编码所有4种结构蛋白。在独立繁殖的细小病毒属，左侧ORF编码两种非结构蛋白NS1和NS2，各为83K和24K（Cotmoreetal1983）。AAV的非结构蛋白为70K和44K。家蚕DNV的ORF1相当于MVM的ORF—L，编码病毒的非结构蛋白。另外，在能独立复制的细小病毒还存在一种蛋白，大约60K，共价结合于复制型DNA的5’端，这一蛋白可能来源于细胞。五、病毒复制的内在环境虽然所有病毒都是绝对的细胞内宿主的，但是细小病毒科病毒的复制更依赖于细胞的内环境。这也不难理解，因为其基因组很小。能独立繁殖的细小病毒绝对依赖于细胞的繁殖周期。复制型的双链DNA转变成成熟的单链毒粒基因组，要依靠细胞S期的某些功能。至于AAV，必需在辅助病毒存在的条件下才能繁殖。事实上，所有AAV大分子的合成均受辅助病毒的影响。腺病毒（Ad）EIA区对Ad其它早期区的转录是需要的，它对AAV的转录也是需要的（Tratschinetal1984;Laughlinetal1982）。EIB也被证明对AAVDNA复制以及把AAV基因组从整合状态拯救出来是需要的（Laughlinetal1982）。AdE4对AAVDNA复制也是需要的（Richardsonetal1981）。在溶细胞性感染过程中E4编码的几种多肽之一与EIB编码的55KT抗原形成一种复合物（Sarnowetal1984）。Ad的VARNAs对AAV结构蛋白的合成是需要的（Janiketal1982）。现已证明AdE2A（编码一种72K的单链DNA结合蛋白）涉及AAV的一种或所有功能：DNA复制、mRNA从核内转移到胞浆和蛋白的合成（McPhersonetal1982）。除Ad外，HSV也可以作为AAV的辅助病毒。细小病毒利用细胞的DNA聚合酶α和细胞RNA多聚酶Ⅱ。六、基因表达调节（一）细小病毒基因表达本身的调节由左侧ORF编码的早期蛋白对病毒DNA的复制以及调节基因的表达是需要的。细小病毒H1的早期NS1蛋白对P38启动子控制的病毒衣壳蛋白基因的表达起正调节作用。这一反式激活作用的Cis区段（tar）在—137和—116之间。tar区段的作用无方向性，有启动子的功能（Rhode1985;Rhodeetal1987）。H1的tar序列和狗细小病毒（CPV）的tar序列与位于小鼠肉瘤病毒（MSV）LTR中的CCAAT结合蛋白（CBP）的DNA结合位点是同源的（Handaetal1977）（图11—4）。图11—4H1P38和CPV的tar序列与MSVLTR中的CCAAT结合蛋白的DNA结合位点的同源性（引自Rhodeetal1987）星号表示同源性上述的CBP结合位点也出现在HSVtk基因启动子区、α2（Ⅰ）和α1（Ⅱ）胶原蛋白基因启动子区（Kellyetal1978）、卵白蛋白基因（Siegletal1985）和Ad2主要晚期启动子区（Sangeretal1980）。在大多数启动子中，CCAAT序列位于—80处，而细小病毒的tar则位于—120。细小病毒早期NS1的功能在DNA复制的过程中是复杂的，计有四种：⑴对病毒DNA的复制是需要的；⑵抑制细胞DNA复制；⑶对衣壳蛋白基因的启动子起正调节作用；⑷对P4启动子（NS1和NS2基因）和异种启动子起负调节作用。AAV左侧ORF的一个或几个产物对其所有3个启动子均起反式激活作用。（二）依赖性细小病毒与辅助病毒在基因表达调节水平上的相互关系AAV与Ad的混合感染可以明显地抑制Ad的复制。首先，AdEIA可以增强AAVrep基因的表达，而后者又转而对EIA和EIB的表达起抑制作用，同时，当Ad基因的表达只是限于EIA和EIB时，rep基因表达也抑制AAV的P40启动子的晚期基因的表达。其次当Ad的其它基因表达后，则可以改变AAVrep基因产物对P40控制的晚期基因表达，从开始是抑制转而起增强作用，另一方面却不明显改变对AdEIA和EIB表达的抑制作用。此外，AAVrep基因产物可以抑制永久性的细胞转化作用（Bernsetal1987）。七、细小病毒的繁殖细小病毒DNA的复制在细胞核内进行，完全依赖宿主细胞DNA的复制机制，它仅发生在细胞DNA合成的S和L2期。事实上，在不复制它们自己DNA的细胞中，病毒DNA是不能产生的，因为，在动物细胞中DNA合成酶只在S期才有活性。可独立繁殖的和缺失性的细小病毒，其DNA复制的机制原则上相似，它不需环化，也不需要RNA引物。这是由于如图11—1、11—2所示。在其分子3’端自我互补序列可折叠的缘故。这样即可产生对DNA多聚酶作用需要的引物—OH。在分子的一部分有G/C丰富区，继而有A/T丰富区，这是DNA复制起始点的特征，其复制过程如图11—5所示。在复制起始点处对侧链需要一个特异性的缺口。图11-5.AAVDNA复制型双链中间体的形成示意图（引自Fraenkel—Conratetal1988）末端重复序列以ABCDbaEF表示，其中AB指核苷酸1~41，它与ab（核苷酸125—85）互补，C和D是二个较短的自我互补的发夹序列（核苷酸各为42—62和64—84）；E，F代表DNA序列的连续。八、细小病毒感染的分子病理在缺少辅助病毒的条件下，AAV毒粒可以进入细胞核内，然后DNA脱衣壳，整合入细胞基因组，整合的频率很高，如果再经辅助病毒重复感染，这种基因整合又可被拯救出来，拯救频率也很高。独立性细小病毒和依赖性细小病毒常可引起隐性感染。在明显的未发生感染的细胞培养中，常可分离出独立性细小病毒；大约有20%的原代非洲绿猴肾细胞是有依赖性细小病毒的感染（Siegletal1983）。独立性细小病毒可以引起多种疾病，这包括宫内感染，引起胎儿和新生动物死亡、先天性畸形，溶骨性综合症，新生动物的急性致死性疾病，肠炎，肝炎，心肌炎，小脑性共济失调，出血性脑炎，全白细胞减少症，阿留申水貂病等，后者与免疫病理有关（Berns1984）。主要参考文献AstellCRetal:NucleicAcidsResearch,11:999,1984BatesRCetal:JVirol,49:319,1984BauerHJetal:JGenVirol,67:181,1986BandoHetal:JVirol,61:553,1987BernsKIetal:AdvVirolRes,32:243,1987BecerraSPetal:PNAS,82:7919,1985Ben—AsherEetal:JVirol,52:266,1984BernsKIetal:TheParvoviruses,PlenumPress,N.Y.1984BernsKIetal:JGenVirol,68:601,1987BernsKIetal:IntheParvoviruses,p.1—31,EditedbyK.I.Berns,PlenumPress,NewYork,1983BullerRMLetal:JVirol,40:241,1981CarterBJetal:InThePavoviruses,p.67—127,edbyKIBerns,PlenumPress,N.Y.,1983CarterBJetal:InThePavoviruses,p.153—207,edbyKIBerns,PlenumPress,N.Y.,1983Chenkeetal:JVirol,60:1085,1986CheungAMKetal:JVirol,33:739,1980CotmoreSFetal:Virology,129:333,1983Chenkeetal:JVirol,60:1085,1986CotmoreSFetal:JVirol,60:548,1986CotmoreSFetal:AdvVirolRes,33:91,1987CukorGetal:InTheParvoviruses,p.33—66,EdbyKIBerns,PlenumPress,N.Y.,1983DulbeccoRetal:Virology,JBLippincottCompany,1988Fraenkel—ConratHetal:Virology,PrenticeHall,1988GrafLHetal:CellMoleGenet,10:139,1984GreenMRetal:JVirol,36:72,1980aGreenMetal:Cell,22:231,1980bGreenMRetal:JVirol,35:560,1980HermonatPLetal:JVirol,51:329,1984JanikJEetal:PNAS,USA,78:1925,1981JanikJEetal:JCellBiochem,supplement,6:209,1982JayFTetal:PNAS,USA78:2927,1981JohnsonBetal:InTheParvoviruses,p.239—268,EdbyKIBerns,PlenumPress,N.Y.,1983LabowMAetal:JVirol,60:251,1986LaughlinCAetal:JVirology,41:868,1982LaughlinCAetal:Gene,23:65,1983LefebvreRBetal:MoleCellBiol,4:1416,1984LusbyEWetal:JVirol,41:518,1982LusbyEetal:JVirol,34:402,1980MendelsonEetal:JVirol,60:823,1986MerchlinskyMJetal:JVirol,47:227,1983OstroveJetal:Virol,104:502,1980OstroveJMetal:Virol,113:521,1981OzawaKetal:Science,233:883,1986PattisonJRetal:Lancet,1:664,1981PintelDetal:NucleicAcidsRes,11:1019,1983RhodeⅢSLetal:JVirol,61:2807,1987RhodeSL:JVirol,55:886,1985RhodeSLⅢetal:JVirol,41:990,1982RhodeSLⅢetal:JVirol,45:173,1981RichardsonWDetal:Cell,27:133,1981RichardsonWDetal:JVirol,51:404,1984SamulskiRJetal:PNAS,USA,79:2077,1982SamulskiRJetal:Cell,33:135,1983SarnowPetal:JVirol,49:692,1984SchlehoferJRetal:IntJCancer,32:591,1983SenapathyPetal:JMolBiol,79:1,1984SerjeantGRetal:Lancetii:595,1981ShadeROetal:JVirol,58:921,1986SieglG:InTheParvoviruses,p.297—349,ed.byKIBerns,PlenumPressN.Y.,1983SieglG:InTheParvoviruses,p.363—388,ed.byKIBerns,PlenumPressN.Y.,1983bSieglG:InTheParvoviruses,p.389—406,ed.byKIBerns,PlenumPressN.Y.,1983cSieglGetal:Intervirology,23:61,1985SrivastavaAetal:JVirol,45:555,1983TratschinJDetal:JVirol,51:611,1984aTratschinJDetal:MolBiol,4:2072,1984bTratschinJDetal:MolCellBiol,6:2884,19861、概述　　由于本科病毒体积很小，多数成员的致病性不明或不引起严重疾病，不太引起人们的注意，所以发现较晚。只有在病毒分离培养技术显著提高和电子显微镜广泛应用之后，一些病毒学家才偶然地从一些生物材料如继代细胞系培养物和动物的肿瘤组织中发现了这类病毒，从而找到了为病毒学者们早已预言的最小单链DNA病毒。研究表明，本科病毒在自然界的分布极为广泛，并与多种疾病有关，从而才开始引起病毒学者的重视。　　本科病毒无论从大小和形态上，都与小RNA病毒相似，它们之间的相似形态和不同的核酸类型，恰好互相对应。本科病毒的拉丁语名称Parvoviridae中的“Parvo”系细小之意。其共同的形态结构特征是：无囊膜，直径约18～26nm，二十面体对称，衣壳约由32个长3～4nm的壳粒构成。病毒粒子在氯化铯溶液中的浮密度较大，为139～142g/cm3。立体对称的衣壳包围着一个分子的单股线状DNA。核酸的分子量为15×106～20×106。碱基中G＋C的含量占核酸总量的41%～53%。本科病毒的一个突出特点是对外界因素具有强大的抵抗力，能耐受脂溶剂和较高温度的处理，而不丧失其感染性。　　病毒在细胞核内增殖。某些细小病毒需要有辅助病毒的协助才能增殖，另一些细小病毒虽能自行复制，但需依赖细胞有丝分裂过程中的某些功能。根据病毒的宿主不同，该科分成两个亚科，即细小病毒亚科(Parvovirinae)和浓病毒亚科(Densovirinae)，前者的宿主是脊椎动物，后者的是节肢动物。在国际病毒分类委员会第六次报告中，细小病毒亚科分为细小病毒属(Parvovrius)、红病毒属(Erythrovirus)和依赖病毒属(Dependovrius,相当于原来的腺病毒伴随病毒属)。原来的浓病毒属提升为浓病毒亚科。细小病毒属又称“细小DNA病毒属”，是本病毒科中最主要的病毒属，我们将对其重要代表分别予以叙述。而对其余的病毒属，则只扼要介绍如下：　　依赖病毒属以腺联病毒(AAV)1型为代表种，另包括腺联病毒2型、3型、4型和5型以及鸡腺联病毒、牛腺联病毒、犬腺联病毒、马腺联病毒和绵羊腺联病毒。腺联病毒是一类缺损病毒，它们的基因组不完备，必须在有辅助病毒——腺病毒与之同时存在的条件下，才能复制出有感染性的后代。本属病毒的一个显著特点是其DNA呈互补性，也就是说，在同一种病毒中有的病毒粒子中含有正极性的DNA，有的病毒粒子中含有负极性的DNA，即含有不同极性DNA的病毒粒子同时存在。在DNA提取过程中，不同极性的核酸分子，很容易发生退火，形成互补的双股DNA。上述特性引起了病毒学者的注意。AAV1、AAV2与人类有关，有的研究者发现30%的儿童含有抗AAV抗体，并常同时发现抗腺病毒的抗体。马AAV是Dutto1975年从患呼吸道病驹分离获得的。在比利时，很多牛含有抗牛AAV抗体。犬AAV是从犬肝炎病毒培养物中分离出来的，很多日本犬的血清中含有抗体。禽AAV是从鹌鹑支气管炎病毒培养物中分离来的。腺联病毒的致病性，目前尚不清楚。红病毒属该属仅有一个成员，即B19病毒(B19V)。B19V是自主复制病毒，与AAV一样，正、负极性的DNA分子均可以作为病毒的基因组。B19V是人的一种病源，主要引起人的皮疹、慢性溶血性贫血和孕妇流产、死胎。其靶器官是骨髓，主要引起骨髓中的成红细胞和外周血液中的网织红细胞的消失。　　浓病毒亚科下设三个病毒属：浓病毒属(Densovirus)、艾特拉病毒属(Iteravirrus)和康特拉病毒属(Contravirus)。该亚科的成员均分离自节肢动物，有6个正式成员和13个暂定成员。病毒均能自我复制，不依靠辅助病毒。其DNA也是互补的，在人工提取过程中能自动形成双股DNA。细小病毒的基因组长约5000nt,在线性单链DNA(ssDNA)分子的3和5端均有发夹结构。3端的发夹结构长115～116nt，5端的长200～242nt。多数成员的基因组既可是负极性DNA分子，也可是正极性DNA分子，而少部分成员的基因组只是负极性的DNA分子。基因组有2个主要的ORF：NSORF和SORF，前者的产物为基因复制和转录所必需，后者编码衣壳蛋白。某些病毒还有一些较小的ORF。鼠细小病毒(MMV)的NSORF编码2种非结构蛋白NS1和NS2，而其SORF则编码3种结构蛋白VP1～3。VP1和VP2的序列大部分相同，只是VP1的氨基端多了一部分氨基酸序列，而VP3则是由VP2在蛋白酶作用下裂解而来。其它大部分细小病毒的结构蛋白的合成亦与此相似。人们提出了许多细小病毒基因组的复制模型。有的模型比较简单，有的则较为复杂。但不同模型的基本点一致，即先以3端发夹结构的3—OH为引物合成基因组的互补链，形成复制型中间体(RF)，再通过RF产生子代病毒的基因组。现以AAV为例说明细小病毒的复制过程(图15-1)。图15-1.AAV的复制模型由图可见AAV的复制过程如下：①基因组的两端形成发夹结构；②以3端发夹结构的3－OH为引物合成基因组的互补链，形成RF分子，该过程由宿主细胞的DNA聚合酶(如α和δ)催化完成；③在图中箭头处切断亲代链，该过程可能由NS1蛋白催化完成；④以切口处的3－OH为引物，延伸被切断的亲代链，这样亲代链的3末端即发生了倒置重排；⑤在拓扑异构酶作用下，线性双链分子发生重分异构化，即每条链的两端均形成发夹结构；⑥以一条链的3端发夹结构为引物，以另一条链为模板合成一个新的RF分子，同时形成一个子代基因组DNA。RF分子进入新一轮的DNA复制，新合成的基因组既可以作为模板复制新的子代基因组，也可被包装进入衣壳形成子代病毒粒子。从上可以看出AAV的基因有两个特点：一是互补双链均可作为病毒DNA复制的模板链；二是基因组末端的发夹结构发生倒置重排。二、细小病毒属(Parvovirus)　　本属病毒无需辅助病毒即能自行复制，但在DNA复制时，需要正处于有丝分裂过程中的宿主细胞(包括体外培养细胞)某些机能的辅助。病毒粒子含有单股DNA和2～3种结构多肽。本属病毒的血凝作用较强，绝大多数成员能凝集豚鼠红细胞。水貂肠炎病毒虽是本属病毒中发现最早的一种病毒，但揭示本属病毒的共同特性，还是从1959年Kilham等对鼠类细小病毒的系统研究开始的。大鼠细小病毒(RV)是本属病毒的代表种。自鼠类细小病毒发现以后，六十至七十年代相继从多种动物(包括人类)和生物材料(如传代细胞系和用于组织培养的材料)中发现了这类病毒。细小病毒属以小鼠细小病毒(MMV)为代表种(以前为KRV)，其主要成员包括阿留申病毒(ADV)、牛细小病毒(BPV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、貂肠炎病毒(MEV)、犬细小病毒(CPV)、鹅细小病毒(GPV)、H1病毒、兔细小病毒(LPV)、LuⅢ、大鼠Kilham病毒(KRV)、猪细小病毒(PPV)、RT和TVX病毒等。目前该属共有18种病毒，类风湿性关节炎病毒(rheumatoidarthritisvirus)也可能是其成员。据预测其成员仍将不断增多。但到目前为止，只发现其中少数病毒能致发明显临床症状的传染病，而大多数呈潜伏或持续感染状态。很多动物和人的血清中含有很高水平的病毒抗体，但病毒的致病性不清。为此，调查研究这些病毒的致病性是医学和兽医病毒学者以及临床医生的一项重要任务。如猪细小病毒(PPV)开始是从猪瘟病毒培养物中发现的，当时对其致病性一无所知，但通过后来多方面的实验研究，已经证实它是母猪不孕症和引起怀孕母猪流产、死产的主要病原之一。1.形态特点和理化学性质　　病毒粒子为等轴对称的二十面体，无囊膜。分子量约55×106～6×106。据对部分病毒的分析，DNA约占整个病毒粒子重量的25%～34%，DNA分子量为14×106～17×106，沉淀系数为23～27S。在CsCl等密度梯度离心沉淀时，病毒粒子可形成4个主要密度带。大部分感染性病毒粒子存在于138～142g/cm3，少部分感染性粒子存在于145～147g/cm3(可能是不同构型或变异的病毒粒子)。空衣壳和含有不完整DNA基因组的病毒粒子分别存在于130～132g/cm3和135～137g/cm3。　　多数病毒粒子中含有3种多肽：VP1(70～90kDa)、VP2(62～76kDa)和VP3(39～69kDa)。VP2系构成衣壳蛋白的主要成份，是具有血凝活性的物质。Peterson等报道在空衣壳中只含有2种蛋白质——VP1和VP2。研究表明，VP3是VP2的裂解物，它只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现，其相对量随着感染进程的发展而增加。阿留申病毒只有VP1和VP2两种结构蛋白。2.血凝性　　本属病毒几乎都有凝集红细胞的特性，尤其对豚鼠和人的O型红细胞。而且很多毒株能凝集诸如猴、仓鼠、鼠、猫、犬、猪、马、鹅、鸭和鸡等动物的红细胞，而且在不同的病毒株和不同种类的红细胞之间，此种凝集性有质和量上的差别。因此，血凝和血凝抑制试验是病毒鉴定和血清学分析的常用手段。血凝素是一种衣壳蛋白，其性质甚为稳定，在pH2～11之间其性质不改变。6.细小病毒的肿瘤抑制作用　　由于许多细小病毒首次是从肿瘤、肿瘤病毒保存物、肿瘤细胞系或用致癌物处理的实验动物中分离的，所以人们推测细小病毒的存在可能与肿瘤疾病有关。但进一步的研究，发现情况并不是这样。实际上，细小病毒常常具有抑制宿主肿瘤形成的能力。如前所述，细小病毒常常引起持续感染，但研究表明，这种持续感染并不造成肿瘤的增加，恰恰相反，发生持续感染的动物明显地被保护而抵抗肿瘤的形成。出生时感染细小病毒H1或H3而无症状的大鼠，肿瘤发生率明显比未感染的大鼠低。细小病毒不仅能抑制自发的肿瘤，还能有效地抑制实验诱发的肿瘤。细小病毒对诱发肿瘤的抑制相当普遍，包括不同类型的肿瘤以及不同诱变剂(RNA和DNA肿瘤病毒、化学致癌物)引起的肿瘤。但经常从肿瘤组织或细胞中分离出细小病毒，说明病毒并不能彻底抑制肿瘤的发展。常可从肿瘤中分离出细小病毒，最简单的解释，就是肿瘤为这些病毒的增殖提供了适宜的环境条件。细小病毒对细胞的两个主要要求与它们的肿瘤亲和性有直接关系。第一，起始细小病毒DNA的复制，宿主细胞必须进入S期。恶性转化时的无节制的细胞增殖为细小病毒的复制提供了条件。第二，细小病毒感染时，细胞必须处于适宜的分化表型。恶性转化诱导了基因表达进程的改变，导致细胞功能以及异常分化现象的出现，或许都有利于细小病毒对肿瘤的亲和性。(一)猪细小病毒(Porcineparvoviurs)同义名：猪细小DNA病毒　　猪细小病毒(PPV)是Mary和Mahnel于1966年进行猪瘟病毒组织培养时发现的，并认为是培养细胞内潜伏感染的病毒。随后相继从一些正常猪肾细胞培养物和感染猪瘟病毒的猪肾细胞中发现直径为22～23nm的病毒粒子，并认为与Kilham(1959)发现的大鼠细小病毒相似。通过核酸鉴定证明为DNA型。Cartwright等(1967)在对猪的不孕症和流产、死产的病原学研究中，从病料中分离出了猪细小病毒，从而首次证明了它的致病作用。通过血清学鉴定证实，所有上述分离毒株，包括从一些传代细胞系中分离的类似病毒均与PPV同属一型，尽管名称各异。从六十年代中期分离病毒和逐步明确其致病作用以来，已相继从欧洲、美洲、亚洲等很多国家分到病毒或查出抗体。它在猪群中检出率甚高：如美国一些猪群的血清抗体阳性率达50%～80%，丹麦12%～42%，澳大利亚52%，英国19%～56%，德国54%。在日本，据估计约10%的猪流产是由本病毒引起的。我国已先后在北京、上海、吉林、黑龙江、四川和淅江等地分离到了PPV，血清学调查的阳性率为80%。1.形态和理化学特性病毒外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径20～23nm，二十面体等轴立体对称，衣壳由32个壳粒组成。核心含单股线状DNA，分子量为14×106,G＋C＝48%。DNA分子量约占整个病毒粒子分子量(53×106)的265%。病毒粒子在氯化铯中的浮密度为1.37～1.39g/cm3，沉淀系数为105S。图15-2猪细小病毒的免疫电镜(横杠=100nm)——自杨盛华　　与多数细小病毒一样，PPV对加热具有强大的抵抗力。据Cartwright等的试验资料(1967)，当56℃30分钟加热处理时，无论病毒的传染性还是凝集红细胞的能力，都无明显改变。在70℃经2小时加热处理后，其感染力虽有所下降，但并不丧失。但80℃经5分钟加热即可使其失去活性。病毒对酸有较强的抵抗性，在pH3～9间稳定。病毒对乙醚、氯仿等脂溶剂有抵抗力。短时间的(如1小时)胰酶处理对病毒悬液感染性不仅没有影响，而且能提高其感染效价，这可能是由于胰酶使病毒粒子在悬液中进一步分散的缘故。　　组织培养的病毒悬液或保存在pH9甘油缓冲盐水中的病毒，在－20℃和－70℃下，经一年以上的保存，无论其感染效价和血凝性都不减弱。5.流行病学病毒能通过胎盘传染给胎儿，形成垂直传播，这已为很多实验所证实。Lucas等(1974)在被感染的公猪睾丸内发现了病毒，并证明能通过交配传染给母猪。病猪分泌液、排泄物及被其污染的器具均可引起传播。妊娠后期感染的胎儿虽出生后不见异常，但很可能成为传染源。由于本病毒常呈潜伏状态存在，故在进行正常组织培养时，往往出现这种病毒的污染。血清学调查表明PPV感染在猪群中普遍存在，90%以上的老母猪和78%的小母猪呈PPV抗体阳性。部分6～8月龄母猪在第一次怀孕时对PPV无免疫力。在一项调查中，30%的小母猪和公猪的PPV血凝抑制抗体(HI)滴度低于1∶32，说明被动免疫已经降低。相反，98%的成年母猪的HI滴度高于1∶256，它们已产生了主动免疫。新生仔猪从血清阳性母猪的初乳中可获得较高水平的抗PPV抗体，但抗体滴度以后逐渐降低，到6～9月龄时，不能再检出抗体。此时，第一次怀孕的小母猪如果遭受PPV感染，最容易发生繁殖障碍。(二)猫泛白细胞减少症病毒(Felinepanleukopeniavirus)同义名：猫细小病毒，猫传染性肠炎病毒，猫瘟病毒　猫泛白细胞减少症病毒(FPV)引起的传染病以高热、呕吐、白细胞严重减少和肠炎为特征。猫传染性肠炎从本世纪三十年代起，就被一些欧、美学者发现。但病毒的首次分离培养是在1957年(Bilin)。后来Johnson(1964)从一头患类似猫传染性肠炎症状的豹的脾脏分离出了同样的病毒，并鉴定为细小病毒之后，才对本病的研究取得了显著进展。通过对多种动物类似疾病的病原学研究，证明FPV在自然条件下感染猫科和鼬科多种动物，如虎、豹、狮子和浣熊，但以体型较小的猫科动物，包括水貂最为易感。FPV是目前本属病毒中感染范围最宽，致病性最强的一种。因此也是本属中的主要病毒之一。　　由FPV引起的猫泛白细胞减少症，可能存在于世界各地。在欧洲和北美已被认为是猫的重要传染病之一。同时，本病毒还能侵袭属于猫科的多种野生动物，因此，其分布的范围之广是可以想象的。我国张振兴和李刚等人(1982～1984)报道，江苏、安徽、山东、河南、河北、浙江、湖北、四川、陕西、山西等地均有本病发生，并先后从发病或死亡的猫和云豹等动物中分离获得了病毒。1.形态和理化学特性　　病毒粒子外观与本属其它病毒相同，直径20～24nm。核酸由单股DNA组成。DNA的分子量为17×106,G＋C含量为47%。DNA分子量占有病毒粒子总量的285%。病毒粒子的分子量为59×106。衣壳可能由三种多肽组成，分子量为60kDa的占86%，73kDa的占10%，分子量最小的第三种多肽为39kDa，占3%～６%，衣壳中含有约5000nt的单链DNA。象本属其它病毒一样，本病毒对外界因素具有强大的抵抗力。能耐受66℃30分钟加热处理。50%甘油盐水中的含毒组织，在普通冰箱内可保存35～138天。在25℃保存5天的含毒脏器，病毒滴度不降低。Earle液内的含毒组织，无论放置在4℃还是25℃，经13个月，毒力毫不降低。对乙醚、氯仿等脂溶剂和胰蛋白有抵抗性。05%福尔马林能有效地杀灭病毒，是良好的消毒剂。(三)水貂肠炎病毒(Minkenteritisvirus)1949年水貂肠炎病毒(MEV)在加拿大水貂饲养场流行造成了养貂业的巨大损失。通过粪便滤液的人工感染试验，证实是一种病毒性传染病，并称为水貂肠炎病毒。1952年，Wills证明福尔马林灭活的貂组织疫苗可以预防此病，猫白细胞减少症病毒的抗血清也能防止感染。1956年，Wills和Belcher证实FPV疫苗可以预防貂病毒性肠炎。1967年，Johnson在感染貂脏器细胞培养物中分离到了MEV，伴随着病毒增殖，出现短暂的核内包涵体和不同程度的细胞病变。MEV可在猫肾细胞系中生长，接种4～6天后，病毒达最高滴度。无论MEV的形态和理化学特性还是其抗原性、基因组结构特点都与FPV的十分近似，常规的血清学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 不能将两者区分开。两者的基因组在56个酶切点中，仅一个不同。赵新泰(1991)克隆并测定了近全长的MEV基因组序列，MEV基因组全长5064nt，MEV与CPV、FPV的核苷酸序列有很高的同源性，仅5端非编码区有较大差异。　　貂病毒性肠炎的暴发通常是季节性的，一般发生于7、8、9月份。粪口传播是最主要的传播途径。因为MEV象其它细小病毒一样有强大的抵抗力，可在兽笼和土壤里存活一年，饲养人员、流动人员、设备、工具和苍蝇等均可传播病毒。一旦MEV被传入貂场，总是先感染就近的貂，然后传播到整个貂场，一般持续2～3周。水貂肠炎的潜伏期为4～8天，症状与猫泛白细胞减少症近似，特点是肠炎更为严重。特急性病例只表现拒食，不见肠炎症状，于12～24小时死亡。急性型通常于出现症状后4～5天死亡。死亡率因貂的品种和流行情况而异,死亡率的变化幅度很大，低的约10%，高的可达80%，幼龄貂的死亡率更高。人工感染的潜伏期为4～6天，首先出现的症状是腹泻，粪便稀软，24小时后，体温升高，同时，粪便中出现大量粘液、纤维样物和脱落的粘膜。病貂呕吐，呕吐物呈淡黄色水样，含少量透明粘液。病貂拒食，脱水，粪便呈水样，继之死亡。经5～6天不死者，粪便逐渐恢复正常。水貂的病变主要限于肠道及淋巴结，小肠呈急性卡他性到出血性肠炎，内容物水样恶臭，肠系膜淋巴结肿胀。许多种疫苗对预防病毒性肠炎都有效，广泛应用的是福尔马林灭活的细胞培养疫苗，一般繁殖前，对母貂接种一次，仔貂从母貂获得的母源抗体可持续6～8周，断奶时再对仔貂接种一次即可。　　(四)犬细小病毒Canineparvovirus)同义名：犬细小DNA病毒　　犬细小病毒(CPV)于1978年同时从澳大利亚(Kelly)、加拿大(Thomson等)患肠炎的病犬中分离获得，是继1967年Binn等从犬分离的第二种细小病毒。它与Binn早期从健康犬分离的犬极小病毒(Minulevirusofcanine，MVC)在致病性上显著不同，抗原性上也有明显差异。CPV可引起犬出血性腹泻和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高，症状与猫泛白细胞减少症相似。而MVC的致病性迄今尚未明确，虽然某些犬群的抗体阳性率很高(达70%)。　　本病虽发现时间不长，但在欧、美等一些商业性饲犬场，相继有流行和造成幼犬群损失的报道。除上述最早报道的两个国家外，已相继在美国、英国、西德和法国发现，当前已成为犬的一种重要传染病，我国亦有本病的暴发流行，并已分离获得多株病毒。研究报道日趋增多，并发现它在抗原性上与猫泛白细胞减少症病毒有密切关系。Rhode(1985)Reed(1988)分别克隆了犬细小病毒的衣壳蛋白基因和全基因组，并测定了核苷酸序列，基因组全长5233nt。　1.形态和理化特性　CPV具有本属病毒的典型形态和结构，粪便中负染的病毒颗粒外观呈圆形或六边形，直径约20nm。核酸由单股DNA组成。其对外界因素的抵抗力与本属其它病毒相似。(附)犬极小病毒(Minutovirusofcanine)　　犬极小病毒是1967年Binn等从健康犬粪便中分出来的第一种犬细小DNA病毒。其致病性目前尚不清楚。它具有本属病毒所共有的形态和理化学特征。直径约20～21nm。它仅能在5℃下凝集恒河猴和非洲绿猴的红细胞。交叉血凝抑制试验表明，它与细小病毒属的某些成员(H1、MMV、RV、FPV、PPV、RTV、TVX和LuⅢ等)无共同抗原组分。病毒的细胞感染范围很窄，仅能在犬的一种上皮细胞系内增殖，并形成大型核内包涵体。至于MVC与CPV的关系，有人认为两者是同一种病毒的不同病原性的毒株，但也有人根据两者不同的培养特性和不一致的血清学关系，认为两者是不同种的病毒。(五)阿留申病病毒(Alertiandiseasevirus)　　同义名：浆细胞增多症病毒　　阿留申病是水貂的一种缓慢发展的进行性衰弱的疾病，侵害单核巨噬细胞系统，以浆细胞弥漫性增生、产生多量γ球蛋白以及持续性病毒血症为特征，可能属于胶原性疾病，具有超敏和自身免疫现象。　　Harlsough和Gorham于1956年首先发现饲养水貂中的Aleutian病。最初认为，本病仅发生于一种具有特殊青铜色毛皮的水貂。这种水貂是黑褐色水貂的变种，属于同源隐性基因组合，其基因型为aa。由于其毛色与阿留申蓝狐的毛色相似，故称阿留申水貂，相应地将本病称为阿留申病。但后来发现，并不只是阿留申水貂才得此病，其它各种水貂也可发病，只不过发病者较少。1962年，应用死于本病的水貂脏器滤液，接种健康貂，可以使其发病，从而证明该病具