猪鼻软骨硫酸软骨素双酶法提取工艺研究

115 科技创新导报 Science and Technology Innovation Herald 化 学 工 业 2009 NO.19 Science and Technology Innovation Herald科技创新导报 硫酸软骨素(chondroitin Sulfate,CS) 是 一种酸性粘多糖,易溶于水,不溶于乙醇、 丙酮等有机溶剂,为白色粉末,无臭无味, 广泛分布于哺乳动物结缔组织,如各类软 骨,鼻骨、喉骨、气管,韧带、肌腱等,属于 糖氨聚糖(Glycosaminoglycans,GAGs)类物 质[1]。根据硫酸软骨素的化学组成和结构 差异,又可将其分为 A、B、C、D、E、F、 H等多种,一般含50～70个双糖基单位,分 子量通常在10000～30000之间[2]。 临床上,硫酸软骨素主要用于治疗神 经痛、关节炎、耳鸣以及促进溃疡愈合和 防治高血脂症等。硫酸软骨素还具有抗凝 血和防止血管硬化等活性,对冠心病、心 肌梗塞等心血管病的防治有较好的疗效, 对神经细胞、肾细胞等具有保护作用[3]。在 医药、食品、化妆品工业中具有广泛用途, 市场需求量很大。 通常从哺乳动物组织中提取得到的硫 酸软骨素以CSA、CSC为主。目前,工业生 产中提取硫酸软骨素,有不少工厂生产工 艺仍然采用浓碱法、稀碱法、稀碱稀盐法 等传统工艺,少量精制工艺往往要经过除 杂、脱色等过程,工艺控制繁琐,质量也不 稳定、收率较低,且废料易对环境造成污 染。软骨中的硫酸软骨素与蛋白质多糖结 合形成复合物,用蛋白酶代替稀碱或浓碱 解离软骨,成品收率更高[3～4],本实验用多 种酶进行单因子试验和双酶法主要影响因 子的正交试验,分析不同种类酶对硫酸软 骨素提取收率的影响,这对进一步开展硫 酸软骨素在国内的应用研究和市场开发具 有重要意义。 1 材料与仪器设备 1.1 实验材料及试剂 干燥猪鼻软骨(京崚生物有限公司提 供) 氢氧化钠、浓盐酸、浓硫酸、95%乙 醇、氯化钠(均为分析纯) 第1类酶:酸性蛋白酶(最适pH3.0,酶 活力50000u/g)、碱性蛋白酶(最适pH11. 0, 酶活力200000u/g)、中性蛋白酶(最适 pH 7.5,酶活力80000u/g)、木瓜蛋白酶(最 适pH6.5,酶活力60000～700000u/g)、脂肪 酶(最适pH7.5,酶活力4000u/g)、2号酶(厂 家保密配方);第2类酶:精制复合胰酶(以 下简称胰酶)(最适pH7.5,胰蛋白酶活力> 4000u/g,胰淀粉酶活力>20000u/g,胰脂酶 活力>10000u/g)。酶由无锡市酶制剂厂生 产。 1.2 主要仪器设备 CD－ 308型电动绞磨机(顺德市肯德 利电器实业有限公司)、BS223S型电子天 平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、 DHG－ 9145A型电热鼓风干燥箱(上海一 恒生物科技有限公司)、723型可见光分光 光度计(上海光谱仪器有限公司)、HH6型 恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司) 等。 　　 2 实验方法与结果 2.1 双酶法工艺流程 2.2 双酶法操作过程 干燥软骨室温(25℃)浸泡24小时,80℃ 恒温0.5小时后捞出,清洗,－20℃速冻保 存。实验时,取冻软骨粉碎,以100g/份分 装于烧杯中,另取一份在70℃～80℃恒温干 燥至恒重,测湿骨粉含水量。按1∶1.5的料 液比加入去离子水,分别加入原料1%的第 1类酶,调pH值至对应最适作用范围,50℃ 搅拌酶解2小时,直到残渣是总量的20%左 右时倒去上清液,残渣中再加入0.5%的第1 类酶,再调pH值至对应最适作用范围,50℃ 搅拌酶解1小时。滤去残渣,将2次酶解液 混合,50℃恒温1小时,调pH值至7.5,加入 2%的NaCl和2%的第2类酶进行酶解和盐 解。55℃恒温0.5小时后,80℃恒温5分钟 灭酶。立即过滤。调pH值6.5,用95%乙醇 调至乙醇终浓度至69%,静置12小时以上。 去掉上清液,用10倍体积去离子水溶解沉 淀,加1%的H2O2,脱色0.5小时,75℃恒温5 分钟。过滤,滤液用95%乙醇第二次沉淀(调 乙醇终浓度至69%),去掉上清液,再用95% 乙醇脱水2－3次,80℃恒温干燥至样品含 水率为10%时得成品。 2.3 双酶法主要影响因子正交试验 为进一步优化生产工艺,以料液比、 第1类酶种类、第1类酶用量、第2类酶用 量四个因子按2.2操作过程进行正交试验 (L934)。双酶法影响因子及水平见表1。 2.4 成品含量检测 咔唑法[5]。 3 结果与讨论 3.1 不同种类第1类酶对硫酸软骨素提取 的影响 硫酸软骨素提取方法有稀碱－酶解提 取法[6]、浓碱复合酶酶解提取法[7],以及双 酶酶解法[3,4]等,成品收率各有高低,都是用 一种酶替换稀碱或浓碱完成实验,均未进 行用不同种类第1类酶替换碱进行硫酸软 骨素提取比较实验。本实验分别用酸性蛋 白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋 白酶、脂肪酶,及酶制剂厂家提供的保密 配方酶替换双酶法中的第1类酶进行硫酸 软骨素提取,并用咔唑法检测产品含量。 不同种类第1类酶的提取收率和含量见表 2,重复实验不少于3次。 结果表明,碱性蛋白酶与胰酶、2号酶 与胰酶的提取组合收率比其他3种组合要 高出3%以上,其纯度也达到合格要求(90% 以上)。王凤琴[3]对影响胰酶水解的三个因 素进行了正交试验,结果表明pH值影响最 大,其次是加酶量,影响最小的是温度。本 实验各组组合中胰酶的酶解条件均相同, 而第 1类酶的 pH值均使用各自最适反应 pH值,将酶解温度固定为 50℃,加酶量维 持在1%,比较真实地反映出各类酶对硫酸 软骨素提取的影响。 3.2 双酶法主要影响因子分析 为进一步分析双酶法对硫酸软骨素提 取收率的影响因素,设计了4因子3水平正 交试验,分析料液比、第1类酶种类、第1 类酶用量和第 2类酶用量在不同水平上对 提取收率的影响。影响因子正交试验结果 见表 3。结果表明,双酶法提取最佳工艺 为:A3B1C3D3,即最佳料液比为1∶1.5,第 猪鼻软骨硫酸软骨素双酶法提取工艺研究① 张武先 普晓兰 * 王金华 罗兴桥 刘龙高 (云南昆明西南林学院 云南昆明 650224) 摘 要:以猪鼻软骨为原料,用双酶法提取硫酸软骨素。用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、2号酶、脂肪 酶分别与胰酶组合提取硫酸软骨素,分析不同种类酶对硫酸软骨素提取的影响。通过正交试验得到的最佳提取工艺为:料液比1:1.5,第 1类酶使用碱性蛋白酶,用量为2.5%,第2类酶(胰酶)用量为1.2%,成品收率达到16.740%。 关键词:硫酸软骨素 双酶法 提取 分析 中图分类号:Q81 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2009)07(a)-0115-02 ①通信作者:普晓兰(1956),女,云南石屏人,博士,教授,主要从事植物学的教学与研究 表1 双酶法影响因子及水平 表2 不同种类第1类酶的提取收率和含量 116 科技创新导报 Science and Technology Innovation Herald 2009 NO.19 Science and Technology Innovation Herald 化 学 工 业 科技创新导报 1类酶选用 2号酶最好,最佳用量为2.5%, 第2类酶(即胰酶)的用量以 1.2%为最佳。 四个影响因子中,料液比的极差(R＝5.110) 最大,表明料液比在双酶法提取硫酸软骨 素中影响最大,其次是第 1类酶的用量,再 次是胰酶的用量,影响最小的是第1类酶的 种类。由于生产工艺中必须考虑生产成 本,2号酶的成本是碱性蛋白酶的10倍,且 用量大,但第1类酶的种类在提取工艺中影 响力最小,所以考虑用碱性蛋白酶代替2号 酶,并进行不少于3次的重复验证试验。最 佳工艺验证试验结果见表4,第1类酶选用 2号酶,产品收率达到 16.762%,比选用碱 性蛋白酶高出 0.022%,但第1类酶选用碱 表3 双酶法提取收率影响因子正交试验结果 表4 双酶法最佳工艺验证试验结果 性蛋白酶比其他组合的产品收率都高。因 此,在双酶法提取硫酸软骨素中,选用料液 比1∶1.5,碱性蛋白酶用量2.5%,胰酶用量 1.2%,能达到提高收率,优化生产工艺目 的。 4 结论 在双酶法提取硫酸软骨素工艺中,使 用不同种类第 1类酶时,碱性蛋白酶和厂 家提供的 2号酶比酸性蛋白酶、中性蛋白 酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶提高产品收率3% 以上。操作过程中,选用料液比1:1.5,碱 性蛋白酶用量2.5%,胰酶用量1.2%,能进 一步优化生产工艺。 参考文献 [1]赵锐,张源潮,李华等.硫酸软骨素的研 究近况[J].药物生物技术,1998,5(2): 116-120. 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[7]高华,刘坤,于兹东等.硫酸软骨素生产 新工艺研究[J].青岛大学学报,2003,l8 (4):55-58. 淀。在 UNITANK工艺中采用生物化学协 同除磷,取得了很好的除磷效果。在曝气 生物滤池中采用铝盐进行生物化学协同除 磷,发现投加铝盐后曝气生物滤池出水 TP 小于0.5mg/L[4]。在沸石强化 A/O同步脱 氮除磷工艺的生物－化学除磷研究中、在 SBR反应器中进行生物化学协同除磷研究 [5]、在膜生物反应器中进行化学除磷,均取 得了很好的磷的去除效果。但是我国对生 物化学协同除磷大部分仅限制于小试和中 试,并没有进行大规模的试验。因此,生物 化学协同除磷技术在我国具有很好的应用 前景。 将生物除磷与化学除磷相结合,可以 充分利用生物除磷费用低、化学除磷出水 磷浓度低且比较稳定的优点。对于需要同 时除磷脱氮的场合,可以优先考虑脱氮,辅 助以化学除磷,从而使得出水的氮、磷满 足所要求的标准。 　　 5 技术经济分析 对国内活性污泥法城市污水处理厂的 基建投资、占地面积、人员编制、运行成 本等费用状况进行调查,在此基础上按照 正规设计程序进行规模为2×104m3/d、5× 104m3/d、10×104m3/d的生物化学协同沉 淀法和普通曝气法污水厂的系列设计,并 按照正规工程概算程序进行经费估算,然 后对二者的费用状况进行了比较。其分析 结果显示,在现行价格体系条件下,生物化 学协同沉淀法具有比普通曝气法更优越的 技术经济性能。对于 2× 104m3/d、5× 104m3/d、10×104m3/d规模的城市污水处 理厂,如果在处理效果相同(实际生物化学 协同沉淀法除磷效果优于普通曝气法)的 条件下,生物化学协同沉淀法比普通曝气 法节约工程总投资16%、11%、11%,节约 总成本 15%、14%、10%,节约占地面积 12%、17%、17%。 因此,在取得很好的除磷效果的前提 下,生物化学协同沉淀工艺与普通曝气法 相比,地价越高、电价越高、药价越低、规 模越大,生物化学协同沉淀工艺越经济。 　　 6 结语 生物化学协同除磷法技术基于生物除 磷系统较难稳定实现一级排放标准要求, 而且处理效果直接受到进水磷酸盐浓度以 及 C/P比值影响的现状,提出在生物处理 系统中投加化学除磷剂以保证污水处理系 统的除磷效果。该技术不仅能很好地除 磷,还能有助于有机物的去除。通过正确 地估计生物除磷的能力可计算出化学除磷 所需的药剂量。经济技术分析结果显示, 在现行价格体系条件下,生物化学协同法 具有比普通曝气法更优越的技术经济性 能,而且地价越高,电价越高,药价越低,规 模越大,该法就越经济。因此,生物化学协 同除磷技术在我国具有很好的应用前景。 　　 参考文献 [1] 郑兴灿,张悦,等.化学-生物联合絮凝 的污水强化一级处理工艺[J].中国给水 排水,2000,16(7):29-32. 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