人Th17细胞的表型、功能特征及与白色念珠菌感染的关系的研究

人Th17细胞的表型、功能特征及与白色念珠菌感染的关系的研究 中山大学 博士学位论文 人Th17细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的 研究 姓名:周茂华 申请学位级别:博士 专业:免疫学 指导教师:吴长有 20080518人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 细胞参与宿主对抗胞外菌和真菌感染的免疫保护反应,如肺炎克雷伯 菌和白色念珠菌等。然而,关于细胞的研究目前主要集中在动物模型的研 感染中的作用,具有十分重要的意义。 本论文的第一部分,我们运用、、和流式细胞术全 特征,主要研究在不同的多克隆刺激剂刺激后产生.的量,产生. .,,: 的细胞亚群的频率,.与厂型细胞因子的关系,细胞与 细胞的关系,细胞的表型如记忆细胞标志、活化标志和趋化因子表达情况 细 胞:一种新的效 应细胞亚群.细胞与分子免疫学 【】吴长有. 杂志,,:? 等。同时我们还对纯化的细胞中. 刚萼羹 羹一萋薹篓蓑黉囊鬟嚣 . 楚;霎露蓁蓁;鹾隘巨却智巍蜊冀;摹耋引鬻型霪,薹雾錾霎;辩耋积毖湃剿 籁 ,几, 【】 一 ,萎。薹霾石妻减『.蓁薹蓑戮萎冀羹鋈薹螫冀萋璀囊萋雾曩薹茎;蚕羹冀蒂 嫠姜耋萋雾.垡 ,..,,: 黪潜震蜉冀雾羹 , , 【】 ., . ,,:. , , 【】 . . ,,:? .【】 , , 一 : .,,【】 , , ..一 , 面系统地研究了正常人外周血单个核细胞中细胞的表型及功能 表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系,揭示细胞在抗白色念珠菌 究上,而对于人细胞的研究很少。因此,全面系统地研究人细胞的人细胞的表 型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 有 细胞表达,说明细胞不同于细胞。 本论文的第二部分我们首先研究了正常人中白色念珠菌特异性的 细胞。运用、、和流式细胞术等实验手段,我们主 要研究了在热灭活的白色念珠菌的孢子或菌丝刺激后产生.的量, 产生.的阳性细胞频率等。结果表明,白色念珠茵的孢子和菌丝刺激均可大 大增加中. 的表达,检测细胞培养上清液中的. 得到了类似的结果。同样,的结果显示,白色念珠茵的孢子或菌丝刺 激后,中平均大约有个细胞产生.。而且,流式细胞术分析表 明,白色念珠菌的孢子或菌丝刺激后,尽管阳性频率不高,但大多数正 常人中都能检测到产生.的细胞,揭示正常人中存 在一群白色念珠菌特异性的细胞。随后,我们以正常人和白色念珠菌感染 者为研究对象,对比分析了二者在白色念珠菌刺激后产生.的量, 细胞的频率和抗原特异性细胞的表型。结果显示,白色念珠菌感染者 的在白色念珠菌刺激后产生更高的.,抗原特异性的细胞的频 率也高于正常对照,但二者的细胞都呈现记忆细胞的表型。 综上所述,我们的研究证实正常人中存在一群记忆性细胞, 细胞与/细胞及细胞不同。同时发现部分记忆性细胞是 白色念珠菌特异性的,白色念珠菌感染者的在白色念珠菌刺激后产生更 高的.,抗原特异性的细胞的频率也高于正常对照,揭示细胞可 能在宿主抵抗白色念珠菌感染的保护性免疫中具有一定的作用。 关键词:细胞,白细胞介素,流式细胞术,白色念珠菌 姆,? ? ?一 ??? ?? ? ?’’ 』’ 纷口口口口口刀 : .. . ..: .羹尹蒂薯嘿一 . , 溶净。霎耋 蓁墓薹竖々鬟奏一耄勘霞到 冀琴耋蓁萋重雾萋 基萎妻妻紫基篓奏塞蓉萋;雾咄警錾叁塑冀吾晏謇冀琴【;耄蠢『,蹬幢,雾篓 善奏一娶 蓁;蠢垦些羹薹荔霎嚏螽薹蘩奏耄薹芦喜挚篓薹鬟葛蛔强萋翼薹戛饕兽嚣囊 薹薹雾寒鬓蒌霆气辇;壁汗吲事;蓁 霪殳 人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究人】细胞的表 型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 ,,. . . ,. ’ . ,,,,一一 ,, 一 , 一.十一.一 一 .. ? ? 也 一 . 一 ?/? . 一 十 , 一 . .% . .% ? ? , 十 . 一 ?一人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 . 士.% .士.%,., . . , ,, . 一、杭 十 一 十丫十, 啊 一一 一十. 一 谢 ?. , .. “. . . .,, ? ?.. 一 . / 一 . . .. 一 一 ,. 一 ??人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究. 、, . ,,. . / .. 一 . 、, 、析也 . : , , ??原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文是本人在导师的指导下,独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:诗最卑 日期:剑迟年月莎日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定,即: 学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的 电子版和纸质版,有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许 论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅,有权将学位论文的内容编 入有关数据库进行检索,可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论 文。 导师币签 学位论文作者签名:獬 日 么日 日期:《月 日 期掘 托?弘 力, 萨 叛 矗水 叩办%牢,人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 .?一 刖 吾 细胞是非均一的细胞群体,根据不同的分类方法,可将成熟的细胞分为 不同的亚群。年,猢等【】通过对小鼠细胞克隆的研究,发现 小鼠细胞可分为两个不同的功能亚群:细胞和细胞。细胞 产生.和.,通过活化巨噬细胞清除细胞内病原微生物并介导迟发型超敏 反应;细胞产生、.和.,介导由嗜酸性粒细胞引起的炎性反应, 清除细胞外病原微生物并参与变态反应。细胞的分化受.和吖的诱 导,细胞的分化受.的诱导,且叫和.相互拮抗,调控着和 眦细胞的扩增和功能。年,等【】发现,和小鼠一样,人的效应性 细胞也可以分为和眦两个不同的功能亚群。和细胞亚群 的区分迅速在免疫学各个领域得到广泛应用,厂免疫应答与临床各类疾病 之间关系的认识引起了研究者的广泛关注,这其中包括感染性疾病、自身免 疫性 疾病、变态反应性疾病和流产等,随后的一系列研究也证实/眦优势应答类 型与疾病的发生发展及预后具有一定的关系。 实验性自身免疫性脑脊髓炎和胶原诱导的关节炎队属于两种 类型的自身免疫性疾病多发性硬化和类风湿关节炎的动物模型。过去研究发 现, 受体基 体内注射抗.亚单位抗体、敲除.基因或敲除. 因后,可以降低这两种自身免疫性疾病的发生或减轻疾病的严重程度巧】。因 而 传统上认为这两种疾病是由.诱导的细胞所介导【。然而,随着一种新 亚单位的发现, 的细胞因子.与.共同分享.和. ./通路在和的发病中的作用被重新评价。人们比较观察了 ..的特异性亚单位和..的特异性亚单位基因敲 除小鼠与发生的关系。结果发现:当.基因敲除后,对的发 生无明显影响,而当.基因敲除后,可明显降低的发生率和减轻疾 病的严重程度【’引。随后的研究表明,.促进了细胞产生炎性细胞因 子.。当.基因敲除后,降低了.产生的水平或.产生细胞 的频率。体内注射抗.中和性抗体也能够降低的发生或改善疾病的严 重程度。最后人们将来自小鼠的富含产生.的细胞直接转输给人细胞的表型、 功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 正常小鼠后,诱导出了严重的,但输入细胞却未能诱导出,从而 获得了产生.的效应细胞与发生之间的最直接证据【’。在对 的一系列研究中,人们发现了一个新的细胞亚群?细胞,该类细胞不同于 和细胞亚群,它产生.、.和.等促炎症因子,介导炎性反 应、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等的发生和发展【卜】。 .即.,是.家族中最早发现的因子,由等于年 克隆和报道,当时被命名杀伤性淋巴细胞相关抗原,是一个由 个氨基酸组成的同源二聚体,分子量为,基因定位于【。 .家族现有个成员:.、. 、一、一、.和 .【】,,】。..也均为同源二聚体,它们的末端具有保守性,且. 和.具有五个在空间结构上保守的半胱氨酸残基构成的特征性‘半胱氨酸 结’【。在.家族成员中,.和.的氨基酸序列具有高度的同源 性,而且编码它们的基因位点无论在小鼠还是在人,都定位于同一染色体表 一。 表一:.家族成员 关于.的来源,尽管人们在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和人单核细胞内 都检测到了.信号和胞内蛋白,但分泌至胞外的可溶性,蛋白尚未见报 道【瑚】。目前普遍认为.主要是由活化的记忆性细胞所产生【,, 但是,记忆性细胞受刺激后也能产生少量的.,特别是亚 群?。关于.、.和.的研究较少,目前普遍认为这些因子 主要是由多种非造血组织细胞产生。 .是一种强大的促炎因子,也是炎症反应的微调因子.嘶 一一人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 ,具有多重生物学活性,不仅可诱导上皮细胞、内皮细胞或成纤维母细 胞产生.、.、粒细胞集落刺激因子.、和一些趋化因子;诱 导中性粒细胞的增殖、成熟和趋化;刺激巨噬细胞产生. 、肿瘤坏死因子. 和等;还以共刺激分子的形式作用于细胞【?。 细胞发现以来,研究者们对该群细胞的分化调控进行了深入的研究, 大量研究表明,细胞的分化途径不同于和眦细胞,不依赖于与 和眦分化相关的关键信号转导因子、、和,孤独受 体叽印 ,班才是控制细胞分化的转录因子【。 ?诱导编码.和.细胞因子基因的表达,当小鼠缺乏?后, 细胞数量减少,自身免疫性疾病发生率也相应下降。在小鼠,初始的 细胞在.和.的共同诱导下分化为细胞,而在人体,细胞 的诱导条件则为. 和.,.主要参与记忆性细胞的扩增和维持 【粥。另外,最新的研究还发现,.不仅是细胞分泌的特征性细胞因 子之一,还能通过自分泌方式促进,细胞的分化【】。而.家族的另一成 员.,则以依赖于丑盯的方式抑制由..诱导的细胞的分 化,并抑制.的产生,此抑制作用强于吖对.产生的抑制作用【。。 .能干扰细胞的长期增殖和存活。用.刺激已分化的细胞可以 降低.的产生,而诱导吖的产生【。 细胞在疾病中的作用也是研究的热点。如前所述,细胞是一类产 生.的细胞亚群。.属于促炎因子,与许多炎症反应和自身免疫性疾 病的发生和发展有关,在对疾病的研究中发现,.在多种炎症性疾病如类风 湿性关节炎、哮喘、多发性硬化、系统性红斑狼疮和炎症 性肠病中表达上调,并且在此类疾病的慢性、复发过程中发挥关键的作用 【舢。 但另一方面,细胞在机体抵抗病原菌感染中又具有一定的保护作用,正如 和细胞一样,细胞也是人类在进化的压力下而形成的一个抵抗某 种病原菌感染的细胞亚群【。动物模型研究发现,细胞能介导机体对胞外 菌和真菌感染的保护作用,如肺炎克雷伯菌和白色念珠菌等【。 .“等【】在人体细胞研究中发现,正常人外周血中的 记忆性细胞亚群在白色念珠菌刺激后能够增殖,并且产生大量的.。 一一人卟细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 他们在研究中同时还发现,利用菌丝形式的白色念珠菌刺激外周血单核细胞 来源 的树突状细胞后,能在培养上清液中检测到大量的.。如果将的 及单核细胞, 细胞和茵丝形式的白色念珠菌共培养,同时加入. 则选择性地诱导的细胞向细胞分化。但是,关于人细 胞与白色念珠菌感染的确切关系,目前并不完全清楚。 故本研究的第一部分我们全面系统地研究了正常人中细胞的 特征,包括在不同的多克隆刺激剂刺激后产生.的量,产生 的细胞亚群的频率,.与/啦型细胞因子的关系,,细胞与 细胞的关系,细胞的表型如记忆细胞标志、活化标志和趋化因子表达情况 的表达和.的产生进 等。同时我们还对纯化的细胞中. 行了研究。研究正常人细胞的特征,为进一步研究细胞的生理和病 理意义打下基础。 在本研究的第二部分我们首先研究了正常人中白色念珠菌特异性的 细胞。运用、、和流式细胞术等实验手段,我们主 要研究了在热灭活的白色念珠菌的孢子或茵丝刺激后产生.的量, 产生.的阳性细胞频率等。随后,我们以正常人和白色念珠菌感染者为研究 对象,对比分析了二者在白色念珠菌刺激后产生.的量、细胞 的频率和抗原特异性细胞的表型,以期揭示细胞与白色念珠菌感染 的关系。 一一人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 第章人细胞的表型和功能特征的研究 第节材料 .研究对象 健康志愿者人均为广东省人民医院健康体检者,无感染、无免疫性疾病 及半年内未使用免疫抑制剂,血清学检查抗甲、丙、丁、戊型肝炎抗体阴 性,乙肝表面抗原阴性,抗.爱滋病毒抗体阴性,肝肾功能正常, 其中男性例,女性 例,年龄范围~岁,平均年龄.岁。 .主要试剂 表 荧光标记的单克隆抗体一览表 试剂名称 生产厂家 国家 公司 美国 抗人吖单克隆抗体 抗人.单克隆抗体 公司 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 公司 美国 抗人.单克隆抗体 公司 美国 抗人.单克隆抗体 抗人.单克隆抗体 公司 美国 抗人.单克隆抗体 公司 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 公司 美国 抗人单克隆抗体 抗人单克隆抗体 公司 美国 公司 抗人单克隆抗体 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 一一人 细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 抗人?单克隆抗体 公司 美国 抗人.单克隆抗体 公司 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 抗人?单克隆抗体 公司 美国 抗人.单克隆抗体 公司 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 表 细胞分离与培养、、及检测用试剂一览表 试剂名称 生产厂家 国家 抗人. 试剂盒 公司 美国 抗人. 试剂盒 公司 美国 孔平底板 雠公司 美国 聊底物 公司 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 抗人单克隆抗体 公司 美国 植物血凝素 德国 公司 佛波酯 德国 舯公司 德国 钙离子霉素 公司 布雷菲德菌素 德国 肿公司 牛血清白蛋白 北京鼎国生物公司 中国 培养基 公司 美国 胎牛血清 杭州四季清公司 中国 .巯基乙醇、青链霉素 公司 美国 谷氨酰胺 公司 美国 淋巴细胞分离液 上海华精生物公司 中国 多聚葡糖 锄 瑞典 抗人细胞磁珠 德国 公司 一一人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 溶液 美国 公司 逆转录试剂盒 美国 公司 、酶 公司 日本 、溴乙锭 上海生物公司 中国 础【 水公司 日本 上样缓冲液、琼脂糖 公司 日本 表溶液配制用化学试剂~览表 试剂名称 生产厂家 国家 无水乙醇 广州化学试剂厂 中国 广州化学试剂厂 中国 广州化学试剂厂 中国 广州化学试剂厂 中国 广州化学试剂厂 中国 葡萄糖 广州化学试剂厂 中国 ’ 广州化学试剂厂 中国 盐酸 广州化学试剂厂 中国 氢氧化钠 广州化学试剂厂 中国 硫酸 广州化学试剂厂 中国 广州化学试剂厂 中国 广州化学试剂厂 中国 广州化学试剂厂 中国美国 们 多聚甲醛 广州化学试剂厂 中国 美国 酚红 展晨生物公司 中国 台盼兰 展晨生物公司 中国 一一人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 .主要仪器 国家 仪器名称 生产厂家 德国 台式冷冻离心机 新加坡 超净工作台/? 英国 二氧化碳培养箱. ? 日本 倒置显微镜?? 日本 生物显微镜 厦 美国 超低温冰箱 . 美国 通用型酶标仪 美国 流式细胞仪/呻 美国 生物分光光度仪 阻 德国 扩增仪 法国 凝胶成像系统 德国 酸度计 德国 旋涡震荡器 德国 磁力搅拌器 . 美国 水平电泳仪 . 日本 高压灭菌锅 康宝公司 中国 电子消毒柜 昆山市超声仪器公司 中国 超声波清洗器 黄岩真空泵厂 臾石具笠,承, 中国 旋片式真空泵.型 上海分析仪器厂 中国 电子分析天平. 法国 微量移液器 .主要试剂配制 ..磷酸盐缓冲液 . . . 一一人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 . 超纯水 完全溶解后调整值至.~.,定量至。高压灭菌分钟,冷却后 保存。 .. 锄’液 . . . . . 葡萄糖 . %酚红 完全溶解后调整值至.~.,超纯水定量至,无菌.滤膜过 滤,分装,?保存。 ..粉末 包 . ? 一/ ‖ 已灭活 调整值至.?.高压灭菌后会升高.~.,定量至,无菌 .滤膜过滤除菌,?保存。 ..流式细胞术染色用缓冲液、和 ...缓冲液: 见.. ...缓冲液一一人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研 究 . 混匀,调整值至.~.,?保存。 ...缓冲液:. 混匀,调整值至.~.,?保存。 ..细胞固定液%多聚甲醛 多聚甲醛?加热至完全溶解,冷却后调整值至.~.,分装,.?保存。 ..台盼兰计数液.% 台盼兰 . 超纯水 ,取上清液%台盼兰, 台盼兰研磨至溶解,印,离心 加生理盐水稀释至使用浓度.%,过滤,分装,?保存。 ..纯化缓冲液 完全溶解后调整值至.~.,过滤,?保存。 .. 用缓冲液 ...包被缓和液值.,.碳酸盐缓冲液: . . 超纯水 完全溶解后过滤,分装,?保存。 ...封闭液 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 儿 已灭活混匀,过滤,分装,?保存。使用时平衡至室温。 ...洗液 . 吐温.混匀,?保存。使用时平衡至室温。 。..终止液 . 蒸馏水 浓硫酸% . 逐滴加入,用玻棒轻轻搅拌,散热后分装,室温保存。 .. 电泳缓冲液 冰乙酸 . . ’ . 蒸馏水 定量至 充分溶解后,室温保存。 .. / . 水 管内混匀,密封,用锡纸包裹,室温保存。 ..琼脂糖凝胶.% 琼脂糖 . × 微波炉内加热溶解,自然冷却至?时,加入 /。入细胞的表型、功能特征及其 与白色念珠菌感染的关系的研究 第节方法 .细胞制备..脐带血单个核细胞 , 的制备 以枸橼酸钾抗凝负压采血袋无菌采集正常足月胎儿脐带血。 :稀释,充分混匀,置于%、?培养箱 将脐带血以%. 中静置~ 沉降红细胞。 用毛细吸管小心吸取淡黄色上清液含单个核细胞,沿管壁缓慢叠加于淋 巴细胞分离液液面上分离液:标本:,注意保持界面清楚,室温离 。 心, 离心后管内分为三层,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾 层狭窄带单个核细胞,用毛细吸管吸取单个核细胞,置于另一离心管中。 ,洗涤细胞两次。 加入倍以上体积的液,,室温离心 冲 最后一次离心后,弃去上清液,加入 完全培养基悬浮细胞, 混匀。 用台盼兰计数液计数单个核细胞:台盼兰计数液细胞悬液,混 匀后加于白细胞计数板,计数细胞板上两个大方格细胞的总数。总 细胞数× ×?。加入心 完全培养基调整细胞数到所需 浓度。, ..外周血单个核细胞 的制备 无菌抽取正常人外周静脉血~ ,肝素~/血抗凝。 将静脉血用等体积’液稀释,充分混匀。 用毛细吸管小心吸取稀释的静脉血沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液液面 上分离液:抗凝血:,注意保持界面清楚。 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 。 水平离心,室温 离心后管内分为三层,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾 层狭窄带单个核细胞。 用毛细吸管吸取单个核细胞,置于另一离心管中。加入倍以上体积的【’ ,洗涤细胞两次。 液,,室温离心 ?, 最后一次离心后,弃去上清液,加入 完全培养液悬浮细胞, 混匀。 用台盼兰计数液计数单个核细胞:台盼兰计数液细胞悬液,混 匀后取于白细胞计数板,计数细胞板上两个大方格细胞的总数。总 细胞数×××?。加入 完全培养基调整细胞数到所需 浓度。 .. 细胞的纯化 取分离所得的,加入抗磁珠见公司说明书分选 细胞,具体操作如下: ...磁性标记:按照厂家的建议使用抗的磁珠 新鲜分离的加入纯化虢每个细胞加~的纯化虢, 洗两次,印,?,。 用纯化艉重悬细胞每个细胞加此的纯化虢。 加入抗的磁珠每个细胞加此磁珠,?孵育。 用纯化虢洗涤一次,,?,。弃去上清。 加入止纯化虢重悬细胞。 ...磁性分选 根据细胞总数和磁性标记的细胞数,选择合适的柱和架。本试 验选择柱进行磁性分选。 将柱放在磁性分离器的磁场中。 用此纯化髓冲洗柱子一次。 一?入细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 将磁性标记的细胞悬液加于柱上。 收集流下的未标记的细胞,用纯化位重复洗柱三次。 收集到的所有流出液为未标记的细胞。 从分离器上取下柱,放在另一个合适的收集管上。 加入纯化疵于柱子中,快速冲出柱中的液体,即为磁性标记的细胞。 收集磁性标记的细胞并进行细胞计数。 ...流式细胞仪分析分选细胞的纯度 取出部分磁珠分选的细胞,加入 ,平,?,,弃上清。 止。纯化俄重悬细胞。 加入 .抗体,?,避光孵育。 加入 洗两次,砌【,?,,弃上清。 加入此纯化重悬细胞,上机检测。 细胞的纯化率达到%以上,即可用来做下一步实验。 .细胞培养 调整的浓度为×细胞/,培养在孔板中,每孔。加入终 浓度分别为. 进行刺激,以 /和 /的?和. 不加刺激剂的细胞作为对照,%、?培养箱培养 ,准备提取总 。 调整的浓度为×细胞/,培养在孔板中,每孔,每组 设个复孔。分别加入不同的刺激剂.和. 蛐终浓度分 别为. /、和离子霉素终浓度分别为 /和 /和 , /,以不加刺激剂的细胞作为对照,%、?培养箱培养 收集细胞培养后的上清液,酶联免疫分析检测.的产生。 调整的浓度为×细胞/,培养在流式管中,分别加入不同的刺 认终浓度分别为. 激剂终浓度/、.和锄. ‖和 /、和离子霉素终浓度分别为 /和 /,同 时加入终浓度为 /的蛋白转运抑制剂,以不加刺激剂的细胞作为 对照,%、?培养箱培养~ 。观察不同的培养环境对细胞 一?人确细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 亚群分泌.及其它细胞因子的影响时,还需将细胞置于室温、?水浴、 ?培养箱培养,培养完成后进行细胞表面和细胞内抗原染色。 采用浓度为. 叭包被孔板,每孔,?过夜。弃 ,的. 去包被液后,向孔内加入纯化的细胞,细胞浓度为×细胞/, 每孔。再加入.删蛐终浓度为 /,以不加刺激剂的细胞 作为对照,%、?培养箱培养 ,准备提取总。 包被孔板,每孔,?,过夜。 采用浓度为. /的. 弃去包被液后,向孔内加入纯化的细胞,细胞浓度为×细胞几, 每孔。再加入. 终浓度为 /,以不加刺激剂的细 。收集细胞培养后的上清液, 胞作为对照,%、?培养箱培养 酶联免疫分析检测.的产生。 调整纯化的细胞的浓度为×细胞/,培养在流式管中,加入刺 激剂和离子霉素终浓度分别为 /和 /,同时加入终浓度 为 巩的蛋白转运抑制剂,以不加刺激剂的细胞作为对照,%、 ?培养箱培养~ ,进行细胞表面和细胞内细胞因子染色。 .酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中的. . 购于公司,其最低检测限度为. 咖,检测 方法按照公司试剂说明书进行操作,具体 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 如下: 包被:用稀释液稀释.单克隆抗体,/孔包被孔板,放入 湿盒内室温过夜。 /孔,放在摇床摇 洗板:甩去板中液体,用吸水纸拍干板。加入 一分钟,甩去液体,拍干,重复三次,最后一次尽量拍干板。 封闭:加入封闭液孔,放入湿盒内室温放置一小时,封闭板。 稀释标准品和样品。 洗板:重复步骤,洗涤三次。 加入稀释好的样品和标准品/孔。放入湿盒,室温放置两小时。 洗板:重复步骤,洗涤三次。 加入检测抗体/孔。放入湿盒,室温放置两小时。 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 洗板:重复步骤,洗涤三次。 加入冲辣根过氧化物酶/孔。放入湿盒,室温避光放置二十分钟。 洗板:重复步骤,洗涤三次。 加入底物,室温避光显色二十分钟左右。 加入%硫酸中止反应。 .酶标仪检测样本值,通过标准曲线换算得到培养上清液中.的浓度。 的水平 .逆转录聚合酶链反应弭检测. .. 引物的设计和合成 根据引物设计的原则,设计人.的特异性引物和以磷酸甘油醛脱氢酶 并参照【 为内参的特异性引物。利用引物设计软件 上人.和的序列完成的。 ’.一’ .基因的上游引物: ’. .’ .基因的下游引物: ’. .’ 基因的上游引物: ’.一’ 基因的下游引物: 上述引物均委托中山大学医学试剂部合成。 ..总砌她的抽提 取培养小时后的细胞,各种培养条件均取约×个细胞,移入 管内,用洗两次,室温,离心,。 加入啊试剂,用移液器缓慢吹打,使细胞充分被佩溶解。 转移溶解的液体至.瑚的管中,室温静置分钟,使 核蛋白体复合物完全解离。 向管中加入.的氯仿每嘶,盖紧盖子,猛烈摇晃秒, 。 使充分混匀,室温静置~分钟,?,离心 离心后样品分为三层:上层无色的水相,中间相,下层红色的氯仿相,转移 上层水相约.~.至另一个. 埘的管中。 加入.异丙醇每秭,颠倒混匀,室温静置分钟,?, 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 。 离心 ,温和振荡 的%乙醇每 弃去上清液,加入 。 管混匀沉淀,?,离心 用~的处理水于~?溶解一。 生物紫外分光光度计测定的浓度,同时测舵的吸光度比值, 珊‖姗应为.~.,否则重新用抽提总。 ..逆转录反应 管中依次加入 冰浴条件下,在. 总 .远 加水至总体积 将上述混合物置于?水浴分钟,然后置于冰上至少分钟。 准备下面的合成混合物,按下面的顺序依次加入: ×汀缓冲液 . /玎/ 将上面的合成混合物加入到每个劬混合物中,轻 柔混匀并简单的离心收集液体,然后置于?水浴中分钟,进行 合成。 将上述反应混合物置于?水浴分钟终止反应,然后冰上冷却。 简单的离心收集反应产物,加入的 在?孵育分钟去除 ?模板。 将最终的反应产物储存于.?或立即用于反应。 .. 的产物扩增及分析 在离心管中加入产物,以.引物进行常规扩增以摸索 反应的最佳条件。最佳扩增条件为:?秒,?秒,? 一一人细胞的表型、功能特征及英与白色念珠菌感染的关系的研究 分钟,个循环。 在同一离心管中进行.和的扩增。加样如下: 模板 . .上游引物 . .下游引物 . 上游引物 . 下游引物 . /酶 .×彘 水 反应条件为?分钟进入循环 ? 秒 ? 扩增个循环 秒 ? 分钟 ? 分钟,?保存 各, .%琼脂糖凝胶电泳:加入扩增产物和 电压进行电泳。 .凝胶成像系统进行每一条带的灰度分析。并以产物灰度为 标准,计算. /的相对表达量。 . . 试剂盒购自公司,按照试剂盒说明书进行操作,具体 步骤如下: .包被:加入.. 认包被孔板,。过夜。 封闭:用完全培养基洗板次,再用完全培养基封闭。弃去封闭液, 拍干。 终浓度分别为. /和 每孔加入刺激剂.和. ??人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 /,阴性对照不加任何刺激物。每孔加入×个细胞,平行孔,、 。 %的培养箱中培养~ 洗板:除去培养液,用纯净水洗遍,再用..%洗遍。 。 每孔加入生物素标记的抗人.单抗,孵育~ 用..% 洗板次。 。 每孔加入 仃.,室温温育 洗板遍,拍干后加入底物,置暗处反应~ ,待斑点形成后用 纯净水中止反应,并放室温晾干。斑点形成细胞用图像分析 系统 进行检测。.产生细胞按每孔的点数计算,并换算成 /。阴性对照孔的点数为~。 .细胞染色 收集培养的外周血单个核细胞,加入流式缓冲液 ,离心?,, 分钟,洗次。 弃去缓冲洗液,振荡混匀,加入% /管,充分混合后室温避光静置 分钟。 加入缓冲洗液 /管,离心?,,分钟,洗次。 弃去缓冲洗液,加入缓冲液 /管,重悬细胞,?静置过夜。 将细胞分装到流式管中,/管,含细胞约×/管。加入相应的荧光 标记单克隆抗体,?避光静置~分钟。 加入缓冲液 /管,离心?,,分钟,洗次。 弃去缓冲洗液,加入缓冲液重悬细胞,振荡混匀,流式细胞仪检测。 .统计学处理 计量及半计量数据均用均数?标准差表示,数据采用 .统计软件包 进行单因素,检验分析,显著性检验标准为.。 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 第节结果 .多克隆刺激剂在转录及蛋白水平诱导正常人产生 . 的表达,我们利用 为了研究多克隆刺激剂能否在转录水平诱导 刺激,同 技术检测了. 。我们将用.. 时以未刺激细胞作为阴性对照。细胞培养小时后,提取进行检测。结 果发现:在未经任何刺激的情况下,中能检测到少量的一训矾, .“. 伯刺激可增加中. 】刚的表达, ./的比值超过了图。 为了进一步研究正常人在多克隆刺激剂刺激后能否在蛋白水平产生 .,我们从个正常人外周血中分离出用于体外实验研究。 在不同的刺激条件下培养三天,培养完成后用检测其上清液中.的含 量。结果表明图:在未经任何刺激的情况下,正常人不产生一, 经过. 迭刺激后产生大量的.,与未刺激相比,其差异具有显著性 ,产生 .。在培养体系中同时加入共刺激分子. .的量明显增加,与未刺激或与单独使用觚. 认刺激相比,其差异均 有显著性分别为尸.,尸.。 实验中,我们同时还观察了另一种多克隆刺激剂和离子霉素对正常人 产生.的诱导效果。结果表明图:和锄 一样,和离子霉素也能诱导产生.,而且其产生的量远远高于 前者对的刺激,平均高达/。 为了进一步证实以上的结果,我们又用技术在单细胞水平分析了 产生.的细胞频数。图的结果显示:在未经任何刺激的情况下,仅能检测 刺激后,则能检测到数量不等的 到个.产生细胞,加入. .产生细胞,其范围为~/,平均值为/。同 结果相类似,加入.和. 刺激后,.产生细胞大 大增加,与单独使用卸. 刺激相比,.产生细胞的频数大约增加了 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 ~倍。 以上的结果表明多克隆刺激剂在转录及蛋白水平均能诱导正常人产 生.。 .产生.的细胞亚群 文献报道,几类细胞如活化的细胞、细胞、中性粒细胞和嗜 酸细胞均能产生.【.】。为了在单细胞水平明确正常人中.的 来源,我们利用流式细胞术分析了产生.的细胞亚群。经 . 或刺激小时后,进行细胞表面和细 胞内细胞因子染色。典型的流式分析图例显示在图和图分别为 .. 和刺激,图和图显示的则是 例分析的统计图。结果表明:. 和刺 激后,细胞和细胞均能产生.,但.主要由细胞 所产生,在.耻址刺激的条件下,其阳性频率为.士.%, 实测范围为.~.%。在刺激的条件下,其阳性频率为. 士.%,实测范围为.~.%。表达.的细胞的频率在 .粕 和刺激后则分别为.士.%和. 士.%。 也是一种实验中常用的多克隆刺激剂,本研究中我们还观察了刺 激后细胞和细胞中.及其它细胞因子的表达情况。结果显示: 刺激几乎不能诱导.的 终浓度为/的短期~ 表达,其它几种细胞因子如吖、吨和.的表达也很低图。 实验中,我们同时研究了不同的培养环境对细胞亚群分泌.及其它细 和 胞因子的影响,我们将分离的分别用.觚. 刺激,然后置于四种不同的培养环境室温、?水浴、? ,收集培养细胞标记后用流式细 培养箱和?,%培养箱培养~ 胞仪分析。图显示的是细胞和细胞在刺激 的条件下,在四种培养环境培养后分泌.及其它几种细胞因子的一个典型图 例。从图中可以看出,在室温培养的条件下,细胞图和 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 细胞图均不表达细胞因子.、.、和吖,而在?水浴、 ?培养箱和?、%培养箱培养的条件下,细胞和细胞 均表达上述四种细胞因子,但表达这些细胞因子的阳性率不同。细胞高 表达.和.,低表达吖,而细胞高表达.丫,低表达 迭和 和.。在图中,我们例举了不同的培养环境对卸.. 刺激后细胞和细胞表达细胞因子的影响。结果 表明,在室温培养条件下,两种刺激剂均不能诱导.、.、吖和盯一 的表达。在其他培养条件下,同一种刺激剂所诱导的同一种细胞因子的表达 无显 著差异胗.,但与室温培养的条件相比均有显著差异尸.。同时,我 们还能观察到与.. 相比,诱导细胞因子 .、.、叫和.的表达更高。 .多克隆刺激剂在转录及蛋白水平诱导正常人纯化的 细胞产生. 上述的实验表明正常人在多克隆刺激剂刺激后能产生.,而且 .主要由细胞产生。因此,我们采用磁珠分离技术把细胞从 中纯化出来,并用流式细胞术检测细胞的纯化率。如图所示, 磁珠分离后细胞阳性率超过%,随后我们用包被的.可溶性 . 迭刺激细胞,同时以未刺激细胞作为对照。细胞培养小时后, 提取进行检测。结果显示图:与相类似,在未经任何刺激 斟,. 的情况下,纯化的细胞能检测到少量的. 刺激可增加. 的表达,./的比值超过了。 为了进~步研究多克隆刺激剂能否在蛋白水平诱导正常人细胞产生 .,我们将纯化的细胞与. 共培养三天,培 养完成后用检测其上清液中.的含量。结果表明图:在未经任 认 何刺激的情况下,细胞几乎不产生.,经过.. 刺激后产生大量的,其量平均可达/,与未刺激对照相比,其差异 具有显著性尸.。 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 . .与/型细胞因子的关系 为了探讨.与不型细胞因子的关系,经 .. 刺激~小时后,进行细胞表面和细胞内细胞因子 .、小.、.、.染色。首先在前向角协 钍, 对侧向角 ,的双参数点图中圈定淋巴细胞门,然后分析 细胞门中各个细胞因子的表达情况。图是三次独立实验中的一次具有代表 性的图例,图则是其统计结果。结果显示:在表达.的细胞中, 大多数为吖和.双阴性的细胞.士.%,但有大约.士.% 的细胞为吖阴性、.阳性,吖阳性、.阴性细胞或两者同时阳性的 细胞很少。同样,在表达.的细胞中,超过.%的细胞为. 和.双阴性的细胞,仅有.%的细胞为.阴性、.阳性,.阳性、 .阴性或两者同时阳性的细胞几乎检测不到。这些结果迸一步证实:根据细胞 内细胞因子的产生,细胞不同于和眦细胞亚群。 同时我们还观察了刺激后.与厂型细胞因子的 表达情况,结果发现:与.. 迭刺激相类似,.的 细胞很少,同样,.与型细胞因子.或.也几乎没有共表 达,但表达.的细胞几乎都表达.,这一点与. 刺激有所差异图。 纯化的细胞在刺激后也得到了与同样的结 果图。 . 细胞的表型特征 另外,本研究中我们还分析了细胞的表型特征。我们分析了. 和. 。细胞群上膜表面分子、、、、 和的表达。一个具有代表性的流式细胞术分析图例显示在图,图 是三次实验的统计结果。结果表明:大多数产生.的细胞表达 .士.%、.士.%、.士。%、强 .士.%和.士.%,但是只有.土.%的十.十 细胞表达。同.细胞相比,更多的.。细胞表达 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 ,更少的.。细胞表达、、和?。然而, ,一个表达在初始细胞和中央性记忆细胞上的次级淋巴器官归巢受体,在 两个细胞群上的表达却没有差异。 实验中,我们也观察了在刺激后产生.的 细胞的表型特征,我们主要分析了该细胞群表达和的情况。 同样,细胞表现为效应记忆细胞的表型:即?图。 . 中不存在产生.的细胞 以上的结果表明:正常人中存在记忆性的细胞。为了进一步 证实该结果,我们比较了正常成人和足月胎儿脐带血中 细胞表达.和.的情况,因为过去我们已经知道正常脐带血中的 细胞为初始细胞。图显示的是~个具有代表性的流式细胞术分析图例,图 则是其统计结果。从结果中我们可以看出:与以上的结果相一致,正常人 中部分细胞表达.,相反,中检测不到表达.的 细胞。而且,表达.的细胞的频率在和没有 明显差异。这些结果进一步证实了是记忆性而不是初始的细胞表达 广。 . 细胞不同于调节性细胞 由于细胞与调节性细胞具有互相交汇的分化途径,因此, 细胞进行了比较。经 我们将细胞和 刺激~小时后,进行细胞表面和细胞内抗原染色。随后运用流式细胞术分析 /‘和. /. 。细胞中和的 表达。一个有代表性的流式分析图例显示在图。这些结果表明:绝大多数 细胞表达和分别为.士.%和.士.%。 有趣的是,大多数.细胞也表达.士.%,但是仅有 细胞相比,表达 .%的.细胞表达。与 的。细胞的频率较低。同样,与.细胞相比,表达 的.。细胞的频率也较低图。 一?人确】细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 第节讨论 传统上,根据产生的细胞因子的类型和生物学功能,效应性细胞可 以分为和两个亚群。.细胞产生.、小.等细胞因子, 主要参与细胞介导的免疫反应、迟发性过敏反应,并在清除病毒等细胞内致 病因 子方面起着重要作用;而细胞分泌.、.、.、.、.等细胞 因子,主要促进体液免疫反应,中和胞外病原体,并介导过敏性疾病。.和 .相互拮抗,调控着和细胞的扩增和功能】。细胞是一个新发 现的效应性细胞亚群。作为一个独立的细胞亚群, 细胞主 要产生一系列不同于和的细胞因子,如.,.和.等, 我们通常所说的.即.。 在我们的第一部分实验中,我们发现从正常成人外周血中分离出的 在多克隆刺激剂.. 或刺激后,能在转录 及蛋白水平诱导.的产生,并且在.刺激的基础上加入共刺激 分子.后,与单独使用小相比,产生的.的量更高, 这一点与 报道的结果相一致:即共刺激信号能协同细胞活化第 一信号增加.的产生【】。作为一种功能最强大的多克隆刺激剂,它刺 激产生.的量远远高于..刺激所产生的量,这一 点也与两种刺激剂刺激产生其它细胞因子的情况相一致。 .最早发现是由外周血活化的记忆性细胞所产生,但是,之后 的小鼠实验和人类细胞实验均证明记忆性细胞受刺激后也能产生一, 特别是亚犁乏。而且过去有研究报道在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞 和单核细胞中也可检测到.信号和胞内蛋白,但分泌至胞外的可溶性. 蛋白尚未见报道【,。总的来说,.主要是由活化的细胞、 细胞和筇细胞所产生【。细胞缺乏的小鼠和用抗体耗竭细 胞及细胞的小鼠接触内毒素后,其肺部的一浓度相比正常小鼠减少 了%以上【,。这进一步说明在宿主防御反应中,活化的细胞是.的 主要来源。等【报道:刺激后,正常人外周血中可 检测到小于%的细胞。协等【】从正常人外周血中分离纯化 一?入细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 出记忆性细胞,加入和短期刺激后,分析的中 央型记忆细胞和’的效应型记忆细胞中.的表达,结果发现:的 中央型记忆性细胞和’的效应型记忆性细胞表达.的百 分率分别为.%士.%和.%士.%。本研究中,我们将在体外进行 短期刺激培养,然后运用流式细胞术分析产生.的细胞亚群,结果发现: 虽然细胞和细胞都能产生.,但.主要是由细胞 所产生,在.. 刺激的条件下,其阳性频率为.士.%, 在“刺激的条件下,其阳性频率为.士.%,这与 .嘶等的研究结果较一致。表达.的细胞的频率在 .. 和刺激后则分别为.士.%和. 士,%。 实验中我们用刺激未能检测到产生.的细胞,同样,产 生.、吖和.的细胞频率也很低。结果提示:利用流式细胞术分析 细胞内.或其他细胞因子时,可选用、.? 认,不宜选用。 不同培养环境对细胞和细胞产生.及其他细胞因子的实 验显示:室温培养时,几乎检测不到表达细胞因子的细胞,但在?水浴、 / ?培养箱和?、 培养箱中进行培养时,产生.及其他细胞因 子的细胞频率差异不显著尸.,尤其用. 刺激时,结果非常稳 定。提示,温度是重要的条件。的主要作用是维持培养体系的酸碱度,若细 胞在体外只短期~ 刺激培养,对结果无明显影响。。 细胞主要以分泌.而得名。早期人们认为,该细胞不产生心 型细胞因子,但协等明在实验中发现:正常人外周血中少数 【】等在研究中也得到类似的结果, 细胞同时表达.和吖,肋亿 他们同时还发现:在人体,即使已经建立的细胞克隆也能对.产生应 答,从而获得产生吖的能力。人们在动物小鼠的研究也发现了同时表达一 和吖的细胞瞰岗】。本实验中,我们也研究了.的表达与/眦 型细胞因子的关系,结果发现大约有%的细胞也表现为一吖的 表型,但一与啦型细胞因子共表达的细胞几乎检测不到,这与上述几位研 一?人细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 究人员的结果相一致。 传统上,根据亚型表达与否,可将人的细胞分为初始细胞和记忆 细胞。初始细胞表达,记忆细胞表达】。除了表面标 志外,初始细胞在功能方面也与记忆细胞不同,当在体外刺激后,初始 细胞不产生小.或.,只产生低水平的.。在我们的研究中, 细胞的表型分析揭示:大多数产生.的细胞表达效应记忆细胞的表 型,即.。在中检测不到产生.的细胞, 但是产生.的细胞的频率在和却没有差异。这些结 果和过去的报导相一致:即.主要是由活化的细胞特别是记忆性 细胞所产生,而中主要是未接触抗原的细胞】。 根据细胞的表面标志、效应功能、组织归巢能力以及在淋巴器官和非淋巴器 官的分布,人们将记忆细胞至少分为两个亚群:中央型记忆细胞 ?和效应型记忆细胞虢 ?【,。表达 和,而两者均不表达。主要存在于淋巴结、脾脏和血液而不存在 于非淋巴组织,当它再一次接触抗原刺激时产生和.,并迅速增殖,但 对靶细胞的杀伤作用较慢。而细胞主要存在于血液、脾脏和非淋巴组织,当 受到抗原刺激后能迅速产生效应分子【,。我们的结果发现:.%~.% 细胞表达,但是在.. 刺激后,产生.的记 忆性细胞只占总细胞的.%,“刺激后则大多数 细胞都表达.。这些数据也说明单纯依据表型或产生细胞因子的功能来 区分中央型或效应型记忆细胞时结果并非完全一致。 趋化因子是一类能趋化细胞作定向移动的细胞因子,是由小分 子分泌蛋白组成的一个大的细胞因子超家族,在病原体的清除、炎症反应、 移植 排斥、造血、血管生成、肿瘤发生、感染等过程中发挥着重要作用【’。 目前,在人类已发现余种趋化因子。根据蛋白分子氨基端个半胱氨酸的排列 方 式不同,可将趋化因子分为个亚型:、、和。趋化因子受体是异三 聚体蛋白耦联受体,此受体有个跨膜区,又称七跨膜区受体超家族。根据受体 结 合的趋化因子种类的不同将受体分为类:、、及。人趋化因 【 子受体 ,属于类趋化因子受体家族成员 一?入细胞的表型、功能特征及其与白色念珠菌感染的关系的研究 之一,于年由等人通过简并引物的方法克隆成功。目前已发现主要在 记忆性细胞、非成熟树突状细胞、细胞上表达,它的配体现仅发现巨噬细胞 炎 症蛋白. 【,./相互作用在淋巴细胞迁移中发挥重要作用 【“石。也是一种类趋化因子受体,起初认为只表达于细胞上, 所以可将其视为一种细胞的表面标志,并认为?与相关性疾病的形成 和发展密切相关【’。但更深人的研究表明不仅表达于细胞上,在 细胞及 细胞上亦有的表达,并且这种表达与一密切相关【。 .“等】根据细胞表面表达的趋化因子受体的不同,将记忆性 细胞纯化为多个亚群,经过研究发现:.的记忆性细胞亚群 产生.不产生吖,并且该群细胞表达控制细胞分化的转录因子孤独受 体。 .协“等因此提出:细胞具有的表型。我们的 实验结果与上述研究相一致,产生.的细胞几乎都表达和。 调节性细胞是近年来确定的一类具有免疫调节功能的细胞亚群,在维持机 体免疫自稳、调控免疫应答方面起重要作用。是调节性细胞 的特异性标志,与细胞的生长发育和功能维持密切相关,通过病毒载体将基 因被动地转移给无调节活性的。细胞后,可赋予其与调节性细胞相似 的免疫调节活性。所有天然形成的调节性细胞也都表达,。细 胞经过体外诱导具有调节功能并表达和时,细胞内的表达也会 增强【。 锚:又名溶细胞性细胞相关抗原,不表达于静息细胞,只表达在活 化细胞表面。与一样,都是细胞表面的分子的天然受体,是维持体内 细胞稳定的负调控因子,能抑制活化细胞的增殖,与构成一对重要的免疫 调控因子【。 已经知道,细胞与调节性细胞具有互相交汇的分化途径【,在诱导调 节性细胞和细胞分化的过程中,.细胞因子起着十分重要的作用。在 .单独作用下,活化的初始细胞分化为的调节性细胞,而在 .和.共同作用下,活化的初始细胞分化为细胞而不分化为 细胞。本研究中,我们比较了和在细胞和 细胞上的表达,结果显示:.细胞和 细胞