胶束液相色谱法同时测定血浆中的苯巴比妥、艾司唑仑和氯硝西泮

胶束液相色谱法同时测定血浆中的苯巴比妥、艾司唑仑和氯硝西泮 胶束液相色谱法同时测定血浆中的苯巴比 妥、艾司唑仑和氯硝西泮 20l0年10月 October20l0 色谱 ChineseJournalofChromatography Vo1.28No.10 959,964 研究论文DOI:10.3724/SP.J.1l23.2010.00959 摘要:采用胶束液相色谱法(MLC)分离测定血浆中苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮,运用三相平衡理论探讨了流动 相中 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面活性剂浓度(C),氢离子浓度(C),助表面活性剂浓度(C)对溶质保留行为的影响,同时运用多元线性 回归建立了保留因子的对数(1ogk)与溶质性质参数和流动相组成之间的相关模型.结果表明,溶质保留因子(k) 随C,C和C的增加而减小,与理论模型完全一致.而且logk与溶质的疏水性常数的对数(1ogP)和电离常数 ()以及C,C和C之间呈现良好的多元线性关系.在确定的色谱条件下,血浆中的3种药物与其他组分之间 有较好的分离效果.3种药物的血药浓度分别在2.5,50mg/L,0.25,5.0mg/L和0.05,5.0mg/L问具有良好 的线性关系.本方法简便,准确,重现性良好,灵敏度高.3种药物的最低检出限(S/N=3)分别为l0.27,1.17, 0.867ng,平均加标回收率范围分别为99.80%,102.9%,94.00%,98.20%和96.30%,98.70%. 关键词:胶束液相色谱;苯巴比妥;艾司唑仑;氯硝西泮;血浆 中图分类号:0658文献标识码:A文章编号:l000—87l3(2010)10—0959—06 Abstract:Ananalyticalmethodbasedonmicellarliquidchromatographyhasbeendeveloped forsimultaneousdeterminationofphenobarbital,estazolamandclonazepaminhumanplasma. Theeffectsoftheconcentrationsofsurfactant,cosurfactantandhydrogenioninmobilephase (hereafterabbreviatedrespectivelyasCM,CandCH)ontheretentionbehaviorofthe3 compoundswereinvestigatedintermsofthree— phaseequilibriumtheory.Thequantitativerela- tionshipsbetweenthelogarithmofretentionfactor(1ogk)andtheparametersofsolutesprop— ertiesandthecompositionofmobilephaseweresetwithmultiplelinearregressionmethod. Theexperimentalresultsshowedthattheretentionfactors(k)ofsolutesweredecreasedwith theincreaseoftheconcentrationofsurfactant,cosurfactantandhydrogenioninthemobile phase.TheeffectsofchangesofCM,CHandConretentionfactorswerefullyconsistentwith thetheoreticalmodeling.Andthereisbettermultielementlinearrelationshipbetweenthelogk ofsolutesandthelogarithmofhydrophobicparameter(1ogP)andionizationconstant(K.)of solutesandCM,CHandCinthemobilephase.Theseparationefficiencybetweenphenobarbi- tal,estazolam,clonazepamandothercomponentsinhumanplasmawasbetterunderthe selectedchromatographicconditions.Thelinearitiesweregoodintherangesof2.5— 50mg/L 通讯联系人:施介华,教授.Tel:(0571)88320064.E-mail:shijh@zjut.edu.ca. 收稿日期:2010-07—05 ? 960?色谱第28卷 ofphenobarbital,0.25—5.0mg/Lofestazolamand0.05—5.0mg/Lofclonazepam. The methodissimple,accurateandreproducibleforthedeterminationofphenobarbital,estazolam andclonazepam.Thelimitsofdetection(LODs)forphenobarbital,estazolamandclonazepa m werefoundtobe10.27,1.17and0.867ng(S/N:3),respectively.Therecoveriesofthe methodforthedeterminationofphenobarbital,estazolamandclonazepamwere99.80%一 102.9%,94.00%一98.20%and96.30%一98.70%,respectively. Keywords:micellarliquidchromatography;phenobarbital;estazolam;clonazepam;huma n plasma 苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮是临床常用的 药物,主要用于镇静,催眠和抗焦虑.疗效肯定,副 作用小….但大剂量使用也会引起中毒,甚至昏 迷.在急诊抢救病例中,迅速查明药物种类并测定 血药浓度对诊断和医治十分重要.为了提高临床用 药的有效性和安全性,用药过程中进行治疗药物的 血药浓度监测也已达成共识.目前血浆和尿液中苯 巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮的测定国内外已有报 道,主要采用高效液相色谱(HPLC)法,测定前 都必须进行血浆和尿液样品前处理.常用的前处理 方法有固相萃取法,高氯酸沉淀法,甲醇沉淀法和乙 腈沉淀法….这些前处理方法存在着操作烦琐,易 增加实验误差等缺陷. 胶束液相色谱(micellarliquidchromatogra- phy,MLC)是以胶束液作为流动相的HPLC系统. 胶束流动相毒性小(避免大量使用甲醇,乙腈),消 耗费用低,而且可通过改变表面活性剂种类及流动 相组成以改变药物的洗脱时间和次序,提高了色谱 选择性;特别是在生物样品分析测定过程中无需样 品前处理,可直接进样分析,克服了常规HPLC测试 生物试样需进行试样前处理的缺陷,受到了人们越 来越多的关注.本文采用MLC法直接测定人 血浆中苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮的含量,该方 法无需对血浆样品进行冗长的预处理,可以直接进 行分析,减少实验误差,提高测定准确度. 1实验部分 1.1仪器与试剂 Alliance2695型高效液相色谱仪,2998二极管 阵列检测器和Empower色谱工作站(美国Waters 公司);pHS-4型酸度计(杭州亚美电子仪器厂). 苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮对照品(中国药品生物制品检定所);十六烷基三甲基溴化铵(CTAB, 99%,上海伯奥生物科技有限公司),吐温20(Tween 20,浙江温州清明化工有限公司);十二烷基硫酸钠 (SDS,99%,美国Sigma公司);甲醇(色谱纯,上海 陆都试剂有限公司);其他所用试剂均为分析纯. 1.2色谱条件 XTerraRP18色谱柱(250mmx4.6mm,5 txm);流动相为胶束溶液(含50mmol/LSDS,6% (v/V)异丁醇和25mmol/LKHPO4,pH=3.5), 流速为1.0mL/min;检测波长为254nm;柱温为35 oC;进样量为50仙L. 1.3溶液的制备 1.3.1流动相的配制 精密称取3.402gKH:PO,用蒸馏水溶解,转 移至1L容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,配成25 mmol/L的KH2PO缓冲溶液. 精密称取14.565gSDS置于1L容量瓶中,加 入60mL异丁醇,用上述缓冲液溶解并稀释至刻度 (85%磷酸调节pH至3.5),过滤后待用. 1.3.2对照品溶液的配制 精密称取50mg苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西 泮对照品分别置于50mL容量瓶中,用流动相溶解 并稀释至刻度,摇匀,配成1g/L的标准储备液,并 避光保存.使用前准确吸取一定量3种药物的标准 储备液,用流动相稀释至一定浓度制成标准溶液. 准确吸取一定量标准溶液和2mL空白血浆混合, 置于l0mL容量瓶中,用流动相稀释得到不同血药 浓度的对照品溶液,摇匀备用. 1.3.3空白样品溶液的配制 取2mL空白血浆(杭州市血液中心)于l0mL 容量瓶中,并用流动相稀释至刻度,用0.22m尼 龙膜过滤后待用. 1.3.4样品溶液的配制 取2mL血浆样品(浙江工业大学药学院)置于 10mL容量瓶中,并用流动相稀释至刻度,超声混匀,用0.22m尼龙膜过滤后待测. 2结果与讨论 2.1表面活性剂的选择 考察了3种不同类型的表面活性剂(SDS, 第l0期施介华,等:胶束液相色谱法同时测定血浆中的苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝 西泮.961? CTAB和Tween20)对苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝 西泮分离的影响.由于CTAB不能有效地溶解蛋 白,在色谱分析中可能会引起蛋白沉淀,因此不能作 为流动相使用.试验结果表明,以Tween20的胶 束溶液为流动相时,苯巴比妥和艾司唑仑均不能与 血浆中的其他组分实现良好的分离;以SDS的胶束 溶液为流动相时,3种药物均与血浆中其他组分具 有较好的分离效果(如图l所示).因此选择以 SDS表面活性剂构成的胶束溶液作为流动相较为 合适. 2.2胶束溶液组分对溶质保留行为的影响 2.2.1SDS浓度的影响 苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮具有一定的酸 碱性.不同酸碱性的溶质分子在水相中存在 着电离平衡.令HA为质子化的溶质,A为去质子 化的溶质,那么在MLC体系中,不同酸碱性的溶质 分子的保留因子(k)可定义为: k:B:…1=——() CA+CHA+CAM+CHAM 其中C和C分别为溶质以去质子化的形式存在 于修饰固定相(S)和水相中的浓度;C和CHA分别 为溶质以质子化的形式存在于修饰固定相和水相中 的浓度;C和C分别为溶质以去质子化和质子 化的形式存在于胶束相中的溶质的浓度. 1 k:8 s f/mlFi 图1表面活性剂对苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮 的保留行为影响 Fig.1Effectofsurfactantontheretentionbehavior ofphenobarbital,estazolamandclonazepam Peaks:1.phenobarbital;2estazolam;3.clonazepam. 根据Armstrong等提出的:在MLC体系中 溶质的保留和选择性主要取决于溶质在水相,胶束 相和固定相之间的三相分配平衡,式(1)可改写为: HAs J_——' Ka1+AsDc. +? 警 式(2)中,C为流动相中氢离子的浓度;为质子 化溶质的电离常数;C为表面活性剂的浓度;为 相比(固定相体积与流动相体积的比值);C为助 表面活性剂的浓度..和.表示纯胶束体系中 溶质A和HA在水相与固定相问的分配常数; 和表示纯胶束体系中溶质A和HA在水相与 胶束相之间的分配常数..,.,.和 HA.分别为助表面活性剂对对应分配常数影响的 修正系数. 结果表明,当C和水相pH值一定时,苯巴比 妥,艾司唑仑和氯硝西泮的保留因子随流动相中 SDS浓度(C)的增加而逐渐减小.这是由于在 MLC体系中,溶质的保留和选择性主要取决于溶质 在水相,胶束相和固定相之间的竞争分配'".当 csns浓度增加,胶束浓度随之增大,3个药物在流动 相中的分配系数增大,从而导致3种药物的k减小. (2) 而且3种药物的保留因子倒数(1/k)与C之间呈 现良好的线性关系,其线性回归方程分别为:1/k= 0.0015C+0.1297(=0.9995)(苯巴比妥), 1/k=0.0026CsDs+0.0354(=0.9990)(艾司唑 仑),1/k=0.0014CsDs+0.0170(7.=0.9985)(氯 硝西泮),与理论保留模型完全吻合. 另外还发现,随着C..增加,分离度减小,当 .小于50mmol/L时,苯巴比妥,艾司唑仑,氯硝 西泮以及血浆中的各组分之间能达到基线分离.综 合考虑,选择Cs.s为50mmol/L. 2.2.2助表面活性剂的影响 MLC存在柱效较低的缺陷,原因是溶质由胶束 相或由固定相扩散到水相的速率小于由水相分配到 胶束相或固定相的速率.为提高柱效,往往在流动 相中添加有机醇类化合物作为助表面活性剂.有机 醇类化合物可改变流动相的溶剂强度,并润湿键合 ? 962?色谱第28卷 烷基固定相的表面,增加溶质从胶束相或固定相扩 散到水相的速率,减少传质时问,从而提高柱效.同 时结果表明,有机醇的种类对3种药物的理论塔板 数(?)也有着显着影响.而且随着有机醇类化合物 的碳链增长,药物的保留时问降低;对于碳数相同的 醇,其支链增加会导致溶质的保留降低,出峰速率增 加.综合考虑有机醇对柱效,分离效果和k的影响, 选择异丁醇作为助表面活性剂. 当pH值一定时,苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西 泮的游离态和离子态比例恒定,因而可视为整体溶 质,则保留模型(2)可改写为: 1 k:8巫=8———————————————二—一(3)' . 1+KAMDC ?一 式(3)中,和分别为溶质在水相与固定相 和水相与胶束相问的表观分配常数;K.和. 分别为助表面活性剂对对应表观分配常数影响的修 正系数.从式(3)可知,当表面活性剂和水相的pH 值一定,溶质的1/k与C成正比.实验结果表明, 3种药物的保留因子随异丁醇浓度的增加而减小, 且1/k与C呈现良好的线性关系(见表1).这是 因为当加入异丁醇时,流动相极性降低,结合型溶质 在水相一胶束相和水相一固定相的平衡发生改变,溶 质倾向于分配到流动相中,使得保留降低.实验结 果表明,保留模型(2)和(3)能较好地反映流动相中 C对3种药物在MLC体系中保留行为的影响.当 异丁醇体积分数为6%时,3种药物与血浆中其他组 分能达到基线分离.故选择异丁醇含量为6%. 表1保留因子与助表面活性剂异丁醇浓度之间的关系 Table1Relationshipsbetweenretentionfactor(k)and concentrationofisobutanolascosurfactant 2.2.3PH值的影响 实验结果表明,随着流动相pH值增大,苯巴比 妥,艾司唑仑和氯硝西泮的k值随之减小.这是由 于酸性药物随着pH值增大,离子化程度增加,即溶 质分子由游离态转化为离子态,使其在流动相中的 溶解度增大,保留能力减弱.而碱性溶质随着pH 值增大,非离子化程度增加,使其与SDS修饰固定 相间的静电作用力减弱,固定相上的保留能力随之 减弱.当pH=3.5时,血浆中3种药物及其他组分 之间具有良好的分离效果.因此选择流动相的pH 为3.5. 由式(2)可知,当胶束溶液中SDS,异丁醇浓度 一 定时,酸,碱性药物的保留模型可简化为: b+c laC '4 +1J 式(4)中,a,b和c分别是与溶质在三相分配系数 相关的常数.式(4)两边取对数,再经级数展开可 得Ink=E+F?C(E和F为常数).试验结果表 明,3种药物的Ink与之间呈现良好的线性关系 (见表2).这说明建立的酸,碱性药物在MLC体系 中的保留模型(式(2)或式(4))能较好地反映流动 相中氢离子浓度或pH值对酸,碱性药物在MLC体 系中保留行为的影响. 表2保留因子与氢离子浓度之间的相关性 Table2Relationshipsbetweenretentionfactor(k) andconcentrationofhydrogenion 2.2.4保留因子与溶质和流动相性质间的相关性 分析 试验结果表明,苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮 的k值随流动相组成的变化而改变,而且流动相组 成的改变对溶质保留能力的影响与理论模型(式 (2))完全一致.同时还可发现,在相同流动相中不 同溶质的k值也明显存在差异.有研究结果表明, 在HPLC体系中化合物的log与溶质的疏水性常 数(P)的对数(1ogP)问具有线性相关性?.但我 们的实验结果表明,3种药物的logk与其相应的 logP问无相关性.这是由于酸,碱性药物的保留不 仅取决于疏水作用还与其离子化程度密切相关.经 多元线性回归分析发现,在MLC体系中3种药物的 logjc与其logP,K以及C,C,C之间具有良好 的多元线性关系,其回归方程为: logk=1.0869+0.102961ogP+9.5846Ka一 6.690CM+24.3719CH一4.5624C (r=0.9902,n:42,SD=0.027)(5) 方程(5)反映了在MLC体系中3种药物的性质 (1ogP,K)和流动相组成对溶质保留行为的影响. logP和C反映了溶质的疏水性影响,和C反 映了溶质离子化程度的影响,c反映了胶束团数目 第10期施介华,等:胶束液相色谱法同时测定血浆中的苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝 西泮.963? 的影响.离子化程度越大,其疏水性越弱,则和 C间接反映了疏水性的影响.回归方程中系数绝 对值越大,相应的参数对保留因子的影响越大.通 过对式(5)中各参数的系数绝对值大小比较可知, 影响溶质保留因子大小的参数次序为:C>K> C>C>logP.当流动相组成一定时,3种药物 在色谱柱上的保留能力的大小主要取决于溶质的离 子化程度和疏水性的强弱. 2.3柱温的影响 提高MLC柱效的另一个方法是提高柱温.柱 温升高有利于提高传质速度,从而可以提高柱效. 实验结果表明,随着柱温的升高,苯巴比妥,艾司唑 仑和氯硝西泮的保留因子逐渐减小,柱效增大.综 合考虑保留因子,柱效和分离度,选择柱温为35?. 2.4方法的专属性和稳定性 通过上述试验确定1.2节所述同时测定血浆中 苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮的色谱条件.在此 色谱操作条件下,3种药物的保留时间分别为 10.21,13.66,22.07min,整个分析过程可在30min 内完成.血浆中的3种药物与其他组分之间达到基 线分离,血浆中杂质对测定无干扰(见图2).这表 明本法具有较高的专属性,血浆中的杂质不干扰测 定.将样品溶液在室温下放置24h测定,其峰面积 基本一致,无杂质峰产生,表明在24h内供试液是 稳定的(见表3).对照品溶液在室温避光条件下保 存半个月之内其峰面积也基本一致. 表3稳定性试验结果(以峰面积测定值表示) Table3Resultsforstabilitytest(thestabilityisindicatedbypeakarea)?V?S t|raint}mint/rain 图2对照品溶液和血浆样品的色谱图 Fig.2Chromatogramsofarefereneesubstancesolutionandhumanplasmasamples Peaks:1.phenobarbital;2.estazolam;3.clonazepam. 2.5标准曲线的制作 将不同浓度的苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮 标准溶液在1.2节所述色谱条件下分别进行分析测 定.以浓度C为横坐标,峰面积A(V?S)为纵坐 标绘制标准曲线.结果表明,3种药物的血药浓度 分别在2.5,50mg/L,0.25,5.0mg/L和0.05, 5.0mg/L时,其浓度与对应峰面积呈良好的线性关 系,其线性回归方程分别为:A,=1599.8C.+375.6 (r=0.9999),A2=16331C2+945.6(= 0.9999),A=23957C十4917.2(r=0.9997);下 标1,2,3分别代表苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮. 在确定的色谱条件下,苯巴比妥,艾司唑仑和氯 硝西泮的最低检出限(S/N=3)分别为10.27, 1.17,0.867ng;最低检测血药浓度(S/N=3)分别 为0.21,0.0234和0.O173mg/L;定量限(?= 10)分别为34.25,3.9,2.89ng. 2.6回收率与精密度测定 空白血浆样品中添加苯巴比妥,艾司唑仑和氯 硝西泮对照品,配制成高,中,低3个不同浓度试样, 在选定的色谱条件下测定方法的回收率,测定结果 如表4所示.结果表明该方法具有高的准确度和较 好的重现性,能满足体内药物分析 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 . ? 964?色谱第28卷 2.7血浆样品的测定 运用所建立的方法测定了3个血浆试样中苯巴 比妥,艾司唑仑和氯硝西泮的血药浓度,测定结果如 表5所示.结果表明,该方法能满足3种药物的血 药浓度的测定要求. 表5血浆样品中苯巴比妥,艾司唑仑和氯硝西泮的含量测定结果 Table5Determinationresultsforthecontentofthe 3compoundsinhumanplasmasamplesmg/L 3结语 本文通过考察胶束溶液流动相的组成对苯巴比 妥,艾司唑仑和氯硝西泮保留因子和分离效果的影 响,建立了MLC法分离测定血浆中3种药物的方 法.该方法克服了常规HPLC在测定生物样品时样 品预处理冗长的缺陷.该方法简便,准确,重现性良 好,灵敏度高.3种药物的保留因子随着流动相中 表面活性剂浓度,助表面活性剂浓度和氢离子浓度 的增加而减小,与理论模型完全一致. 参考文献: [1] [2] [3] PharmacopoeiaCommissionofPeople'SRepublicofChina. 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