【doc】醋酸棉酚对人射出精子Ca^2＋内流和大鼠输精管收缩反应的影响

【doc】醋酸棉酚对人射出精子Ca^2＋内流和大鼠输精管收缩反应的影响 醋酸棉酚对人射出精子Ca^2，内流和大鼠 输精管收缩反应的影响 第l8卷第5期 1996年10月 中国医学科学院 ACTAACADEMIAEMEDICINAESINICAE Vol18.No.5 October,1996 )-1r-]f 醋酸棉酚对人射出精子Ca+内流和大鼠 输精管收缩反应的影响 吴亭沙玉申韩风云段金虹程锅#-———一__?——一 (国家计划生育委员会科学技术研究所,北京100081) 尸7/'L f A提要本实验旨在观察醋酸棉酚对人射出精子Ca跨膜转运和对离体大鼠输 精管收缩作用的影响.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明.醋酸棉酚抑制人射出精子Ca"_内流,并呈量一致依 赖关亲.醋酸棉酚破坏精子膜内,外Ca浓度梯度的动态平衡,可能是其抑制精子活 力的重要机理之一.但醋酸棉酚对高K一诱发离体大鼠输精管平滑肌的收缩作用没 有影响,可能醋酸棉酚对大鼠精子膜有选择?l生的作用. 关键词壁堕堕簟鱼王毡王兰塑大鼠堕兰{6{,' 中图号R979.2 棉酚抑制精子活力的机理,已为不少学者所研究.p6s6等报告,棉酚抑制人射出精子能 量代谢.致糖降解减少,进而使精子活力逐渐丧失Natwar等指出,醋酸棉酚干扰人 射出精 子线粒体的能量生成系统,导致精子失活.Wichmann等报道棉酚阻断精子能量产生,使人 射出精子内ATP浓度快速下降,精子活力丧失.Hong等报告,棉酚影响精子活力,此作用 与药物浓度,作用时间和温度有关.Kanwar等0用棉酚与人射出精子中分离的胞膜囊泡作 用,发现棉酚抑制ca内流,而ca"_在调节精子鞭毛活动中起关键性作用.Lindemann等指 出,钙作为潜在的信使可激活哺乳动物精子的腺苷酸环化酶Hong等认为,钙离子是人精子 功能的关键调节者.为此,本实验观察醋酸棉酚(GAA)对人射出精子Ca内流和离体大鼠输 精管平滑肌收缩的影响,以探讨GAA对精子活力影响的药理学机理. 材料和方法 一 ,药品与试剂醋酸棉酚由本所药化室惠赠;Ca购自中国科学院原子能研究所,放 射比度88.8MBq./ml(2.4mCi/m1),pH4,6;DMSO,硝苯啶(NIF),KCI为Sigma公司产品; BayK8644由Bayer制药厂馈赠. 二,动物SD大鼠由本所动物室提供,雄性,体重298~34g. 三,人精液取自9名有生育史健康男性,年龄2g,41岁(平均33岁). 四,方法 1.精子制备:按Silvestroni等方法改进.供精者禁欲3,5d,手淫取精,液化,以标准实 验技术对精液体积,精子活率和浓度作常规检查.精液移至经消毒的刻度离心管内.用低浓度 CaC.1(1.2mmol/L)及3mg/mlBSA的Bww培养液1O倍稀释,室温下离心600Xg10min, 中国医学科学院基础医学研究所 中国医学科学院 弃上清,沉淀重复洗1次,再悬浮在上述BWW培养液中,调节精子浓度为15×10/ml,置 37?孵箱中备用,整个操作在2h内完成. 2."ca"内流测定:按Si]vestroni等法改进取上述制备的精子悬浮液每试管lml,分别 加入用DMSO配制成不同浓度的GAA,NIF,BayK8644和DMSO各1o.对照组加Bww 液,37?温孵10min.各试管再分别加入16.65KBq/ml(0.45#Ci/m1)'~CaCI10l,同样条件下 继续温孵10rain.各试管反应液分别经Whatman(2.4cmGF/C)滤膜减压过滤,并轻柔,快速 地用800~1含4mmol/LEDTA的冷NaCI(0.9)液洗3次,30s内完成操作.取上述各试管滤 液500~1,各加无水乙醇4ml,二甲苯闪烁液16ml,经LKB1217RACKBETA闪烁仪记数. 3.离体大鼠输精管(RVD)实验:大鼠拉断颈椎,剖腹取两侧输精管,剥去周围结缔组织, 悬挂于含10mlKrebs液,37?恒温浴槽中,通入95O+8%CO.,15min换液1次,平衡 60rain后试药,负荷0.1g,药物效应曲线经换能器连接XWT一204型平衡仪自动描记张力变 化 4.统计学处理:实验结果以;土5表示,组间比较用t检验. 结果 一 ,精子活率样品精子活率均在80以上,最终悬浮在Bww培养液中的精子呈中等 或快速前向运动 二,不同时间内ca'摄取人射出精子在含有标记"ca"的Bww培养液中温孵后, 对ca摄取在起始阶段较快速,以后摄取较缓慢.至60min时仍有摄取,其问均无统计学差 异(图1). 三,GAA对ca内流的影响不同浓度的GAA均可抑制人射出精子对ca的摄取, 并呈量.效依赖关系.GAA浓度在10mol/I时,可显着地抑制ca的摄取(尸<0.05)NIF 对ca摄取也有明显的抑制作用,同样显示量效依赖关系.钙通道激动剂BayK8644也可 促进"ca内流,溶剂DMSO对ca摄取无影响(表1). 表1GAA,NIF和BayK8644对人射出精于"ca摄取的影响 Tab】e1EffectsofGAA,NIF.andBayK8644on'Ca一uptake inhumanejaculatedsperm(10×10/m1)at10rain *P<O05.*P<0.01.…P<0001comparedwithcontrol 四,GAA对"ca内流的抑制率药物浓度在10mol/L时,GAA和NIF对ca内流 的抑制率分别为26.68和44.48;而BayK8644可增加:ca内流,增加率为10.19(表 2). 5期醋酸棉酚对人射出精于Ca一内流和大鼠输精管收缩反应的影响 表2GAA,NIF和BayK8644对人射出精子Ca一摄取的抑制率和增加率() Table2ofinhibitionbyGAAtNIFtandpromotionbyBayK8644 of?auptakeinhumanejaculatedsperm 6D(min 囝1人射出精子在不同时间对ca抖的摄取 Fig1ThetimecourseofCa一uptakebyhuman ejaculatedsperm log(mot/L 图2GAA和NIF对高K诱发离体大鼠输精管收缩 效应的抑制作用 Fig2InhibitionofhighKinducedspontaneouscon— tractionoftheisolatedRVDbyGAAandNIF *P<O.001comparedwithNIF 五,GAA对高K一去极化诱发RVD收缩效应的影响高K一诱发肌膜去极化,激活依赖 电位的ca通道开放,促进ca内流增加,诱发平滑肌收缩KC1在lOOmmol/L时,可明显诱 发RVD自发收缩但GAA对此收缩效应的抑制作用很弱,在10mol/L时抑制率仅为 3.01,10一mol/L时抑制率为2.49.与此相比,NIF浓度在10mol/L时抑制率达 87.43,在10mol/L时抑制率为12.58.呈量一效依赖关系(图2). 六,ca对高K一诱发离体RVD自发收缩的影响高K诱发离体RVD收缩的强度和 频率受各药物浓度的调控,当无外源性ca时,高K对平滑肌张力无影响;加入外源性ca 后,RVD收缩效应产生(图3). 一 一,?. 中国医学科学院18卷 Ca~:h=0CaCI2 0.625mmol/L 圈3Ca对高K(1OOmraol/L)诱发离体大鼠 输精管自发收缩的影响 Fig3Influenceof?a一contractionsonhigh K一(100mmol/L)inducedspontaneous contrfletn 讨论 哺乳动物和无脊椎动物精子游动,受鞭毛 轴丝支配,而鞭毛功能又受精子内Ca调控. 在生理状况下,精子跨膜Ca梯度浓度保持相 对稳定状态,随着Ca浓度的变化,鞭毛活动 也发生变化,当精子内Ca水平低于10-9mol/ L时.精子呈对称波形式游动;高于10mol/L 时,精子呈不对称游动或活动被抑制,表明 Ca.在调节精子鞭毛轴丝功能中具有重要作 用.精子外ca参与精子获能,顶体反应等过 程;但在人射出精子中加入高浓度CaCI (127.32mmol/L),则精子在1rain内全部失 活,可见精子膜内,外ca浓度变化都影响 精子活力.GAA抑制人射出精子Ca内流与 Kanwar等报道的结果一致,NIF也有同样的 抑制作用,且两者都显示出量效依赖关系. Placzek等报告,钙拮抗剂NIF,verapamil和 diltiazen对人射出精子活力均有抑制作用,其 中以NIF作用最强,但它们的作用机理尚不清 楚.Kanwar等一认为棉酚抑制精子活力的机 理.与精子胞膜的结构和功能有关.本实验表明GAA阻断ca内流,导致精子膜内,外Ca2+ 梯度浓度失去相对动态平衡,使控制鞭毛轴丝活动的内ca浓度的变化,这可能是其重要机 理之一.Natwar等"报告棉酚抑制钙泵一Ca一ATPase活性,也影响精子内Ca+外排,从而 使上述精子内,外ca平衡破坏进一步加重.但GAA并不影响离体RVD收缩,这可能是因 为GAA仅对人射出精子的ca摄取有选择性抑制作用.笔者在研究雷公藤单体Tw.和T 抗生育作用时,同样发现它们能抑制人射出精子的Ca内流,而不影响离体大鼠胸主动脉和 输精管平滑肌的收缩一,提示GAA,Tw.和T有着共同致精子失活而不育的药理作用,如 能从中寻找到其结构中的活性部位,则可能进一步研制出有特色的男性抗生育药. 参考文献 1.Pds6H,WiehmannK,JdnneJ,etal,Gossypo[,apowerfulinhibitorofhumpermatoz0a metabolism.Lancet,1980,i:885. 2-KaliaNR?VasudevM.EffectofgossypolaceticacidOnthemotilityandATPaseactivityofhumansPer. matozoa.Andrologia,1981.13(2):95. 3.WichmannK,KapyahoKtSinervirtaR,eta1.Effectofgossypo[onthemotilityandmetabolismhuman spermatozoaJReprodFert,1983,69:259. 4.HongCY,HuangJJ?WuP.Theinhibitoryofgossypol0nhumanspermmotility:relationshipwith time,temperatureandConcentration.HumanToxical,1989,8:49. 5.KanwarU,]~atlaA,SanyalS,et.Gossypo[inhibitionofCaATPaseinhumanejaculatedspermato. 5期酷酸棉酚对人射出精子ca.内流和大鼠输精管收缩反应的影响379 zoalp}asmamembranevesicles.Contraception,】989,39(4):431 6.LindemannCB,KanousS.Regulationofmammalianspermmotility.ArchAndrolt1989,23:1. 7.HongCY.ChiangBN,TurnerP.Calciumionisthekeyregulatorofhumanspermfunction.Lancet, l984,ii?】449. 8.S[1vestroniL,MendktoA.Calciumuptakeinhumanspermatozoa:characterizati0nandmechanisms. ArchAndrol,1989,23:87. 9.VijayaraghavanSskins.quantitationofbovinespern2cyto— plasmiccalciumwithQu[n2andFura一2: evidencethatexternalcalciumdosenothavedirectaccesstothespermcytoplasm.CeltCalciumt1989, l0:24ll 10.袁慰如,秦国强,袁慰平,等.体外c8_及其螫合剂对人类精子活力影响的研究.生 殖与避孕,1990,10 (3):30. 11PlaczekR一 0hlingH,WallerUtetat.Cacliumantagonistsinhibitthemotilityofwashedhumansper— matozoa.Andrologia,1987,19(6):640 l2.吴亭,沙玉申.雷藤氯内酯醇,雷藤素甲对人射出精子钙内流的影响.中国药理学 会通讯,1995,12(4): 5. 13吴亭,抄玉申.雷藤氯内酯醇抑制人射出精子ca+内流,不影响大鼠胸主动脉,输 精管收缩反应.中国 药理学通报,1996,待发表. EffectsofGossypolAceticAcidORHumanEjaculatedSpermCa InfluxandRatVasDeferensContractionAction WuTingShaYushenHanFengyun DuanJinbongChengJinxuan (NationalResearchInstituteforPamJ]yPlanning,Beijing100081) Ithasbeenreportedthatgossypolaceticacid(GAA)inhibitsspermmotilityandcalcium playsanimportantroleinregulatingthefunctionofthespermflagella.Inordertoexplore themechanismbywhichGAAinhibitsspermmotility,theeffectsofGAAonhumaneiacu 1atedspermCa.influxandisolatedratvasdefetenscontractionactionwerestudied.There— sultsshowedthatGAAinhihitedspermCainfluxinadose—dependentmanner.and breakedthedynamicequilibriumofsperminternalandexternalCagradientconcentrations. ItmaybeoneofimportantmechanismbywhichGAAinhibitsspermmotility.ButGAAex— ertsn0effectonthehighKinducedcontractionofsmoothmuscleofisolatedratVaSdefer— ens.ItiSlikelythatGAAhasselectiveactiononthespermmembraneoftherats, Keywordsgossypoaceticacid;Ca";spermmotility{ratvasdeferens (1995--09—15收稿)