金雀异黄酮对去卵巢大鼠海马突触体素表达的影响

金雀异黄酮对去卵巢大鼠海马突触体素 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响 金雀异黄酮对去卵巢大鼠海马突触体素表 达的影响 CmNESEJOURNAL0FANATOMYVo1.28No.22005解剖学杂志2005年第28卷第2期 金雀异黄酮对去卵巢大鼠海马突触体素表达的影响 朱建华郭开华袁群芳徐杰 (中山大学基础医学院解剖学教研室,广州510089) 摘要目的:研究金雀异黄酮对去卵巢大鼠海马突触体素的影响,以探讨金雀异黄酮对女性更 年期后中枢神经系统退行性变的 作用机制.方法:用免疫组化结合图像 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 的方法,测量分析去卵巢后不同时间点以及给予 金雀异黄酮替代治疗后海马CA区 辐射层和齿状回分子层突触体素免疫阳性产物的平均光密度变化.结果:去卵巢后大鼠CA 区辐射层和DG分子层突触体素 免疫阳性产物的平均光密度值逐渐降低,4周后与假手术组和苯甲酸雌二醇组相比有显着 差异;金雀异黄酮组治疗后海马突触 体素免疫阳性产物平均光密度恢复.结论:金雀异黄酮能恢复去卵巢大鼠海马突触密度,延 缓女性更年期后中枢神经系统的退 行性变. 关键词金雀异黄酮;突触体素;神经退行性变;雌激素替代疗法 Effectsofgenisteinonhippocampalsynaptophysinexpressioninovariectomizedrats ZHUJian—Hua,GUOKai—Hua,YUANQun—Fang,XUJie (DepartmentofAnatomy,SchoolofPre-dinicalMedicine,SunEat-senUniversity,u510080,China) AbstractObjective:Tostudytheeffectsofgenisteinonhippocampalsynaptophysinexpressioninovariectomizedratsandtoexplorenlechanislns ofgenisteinoncentralneurodegenerationafterfemaleclimacteric.Methods:ImmtmohistoehemistryandimageanalysiswereusedtonleaSul~and analyzemeanopticaldensity(MOD)changesofsynaptophysinimmtmo-positiveproductsofradiationlayerofCAandmolecularofdentategyms atdifferenttimeafterovariectomyandgenisteinreplacementtherapy.Resu/ts:TheMODofsynaptophysinimmuno-positiveproductsofradiation layerofCAt一 3andmolecularlayerofdentategymsweredecreasedprogressivelyafterovariectomy.Thereweresignificantdifferencecomparedwith sham-operatedandestradiolbenzoatetreatedgroups,andtheMODofsynaptophysinimmuno-positiveproductrestoredaftergenisteinreplacement treatment.Conclusion:GenisteinCanrestorehippocampalsynapsedensityofovariectomizedratsandpostponecentralneurodegenerationofpostm— enopausalwomen. Keywordsgenistein;synaptophysin;neurodegeneration;estrogenreplacementtherapy 雌激素替代疗法是以往防治女性更年期后老年 性痴呆的一种重要方法,但由于存在一些副作用,使 其应用受到了限制….文献报道植物雌激素中金雀 异黄酮(Genistein,Gs)具有较弱的雌激素活性,但没 有普通雌激素的副作用J,而且我们的研究表明其能 增加去卵巢大鼠体内抗氧化能力,降低细胞膜性结构 的氧化损伤],恢复去卵巢大鼠的学习记忆能力_4], 但是对海马突触体素表达的影响尚无文献报道.本实 验的目的就是通过免疫组化结合图像分析的方法研究 Gs对去卵巢大鼠海马突触体素的影响,探讨Gs对女 性更年期后中枢神经系统退行性变的作用机制. 1材料和方法 1.1实验试剂小鼠抗人重组突触体素单克隆抗体 (Biogenex公司);SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德 生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有限公司);金雀异黄酮(Gs),西安交大保赛 生物技术股份有限公司(批号:02122601,纯度:98. 5%);苯甲酸雌二醇(EB,上海通用药业股份有限公 司).其它常用试剂为国产分析纯. 1.2动物分组92只3月龄健康雌性SD大鼠,体 重200,250g,由中山大学实验动物中心提供,用完 全随机分组法分为4个组,即:去卵巢对照组(OVX), 假手术组(sham),苯甲酸雌二醇治疗组(EB)及金雀 异黄酮治疗组(Gs).每组动物23只,又按术后存活 时间分成3d(3只),1周(3只),2周(3只),4周(5 只),8周(9只)共5个时间点. 1.3模型制备用10g/L戊巴比妥钠(3.5ml/kg体 * 广东省自然科学基金重点项目(010086,04105332);现工作单位:云南大理学院人体解剖学教 研室;通讯作者 一 l72— 重)腹膜腔注射麻醉,将大鼠俯卧,在背部中1/3处剪 毛,用碘酒,酒精局部消毒皮肤,沿背部正中线向下做 2,3cm长的切口,切开皮肤,再于左右两肋下沿肩 胛线剪开腰肌,用镊子将卵巢和子宫角牵出,在输卵 管处结扎,然后切断输卵管,将双侧卵巢摘除,逐层缝 合肌肉和皮肤切口.假手术组摘除卵巢周围约0.5g 的脂肪组织,保留双侧卵巢. 1.4给药术后动物都分组饲养于不锈钢鼠笼中, 每笼4,5只,自然明暗周期,自由取食.术后第2天 开始腹部皮下注射给药,隔日1次.给药剂量:(1)假 手术组:生理盐水5Ol;(2)去卵巢对照组:生理盐水 5O;(3)Gs组:Gs250ttg溶于5Ol二甲基亚砜;(4) 苯甲酸雌二醇组:EB50ttg. 1.5海马组织切片和免疫组化染色大鼠存活期满 后常规灌注固定,在脑立体定位仪上切取海马组织 块.组织块经4%多聚甲醛后固定4h后,再依次入 10%,20%和3O%蔗糖磷酸盐缓冲液直至组织沉底. 用半导体恒温冰冻切片机切片,片厚40/,m,隔3取 1,进行突触体素免疫组化染色.阴性对照以10g/L 牛血清白蛋白代替小鼠抗突触体素单克隆抗体. 1.6图像分析及数据处理用光学显微观察免疫组 化标记突触素的切片,基本明确突触素标记的部位后 采用LeicaQwin图像分析系统测定海马CA.,C区 辐射层和齿状回(dentategyrus,DG)分子层内突触体 素免疫反应产物的灰度值.每只动物随机测定的3 张切片,每张切片在CA,CA2,CA和DG区各测定2 个视野,并测定同一张切片上胼胝体的灰度值作为背 景,计算CA区辐射层和DG分子层的平均光密度 值(MOD)j,用各测试区的MOD进行分析和比较,以 避免染色过程中的非特异性染色等导致的误差J. MOD的计算公式: 平均光密度(MoD)=Lg(雨茬孝) 使用SPSS11.0统计软件包,采用单因素方差分析 (one—wayanalysisofvariance,one—wayANOVA)进行多 组均数总的差异性比较,用LSD-t检验或Durtnett-t检 验进行同一时间点内不同处理组MOD以及同一处理 不同时间点MOD两两比较. 2结果 空白对照染色切片无免疫阳性产物,未显出海马 的层次(图1).突触体素免疫组化染色海马呈层状 结构,cA,cA2,cA,区始层和辐射层突触体素免疫阳 性产物密度高于锥体层及腔隙分子层(图2).光镜 下放射层内免疫反应产物多为细小颗粒,呈弥散分 布,但在CA区放射层基部及齿状回的门区可看到 较大的颗粒状免疫反应产物.Sham组,Gs组和EB 组染色较OVX组深,CA区及门区大颗粒状免疫阳 性较多(图3—6). 各组CA区放射层突触体素免疫阳性产物的 MOD不存在区间差异(P>0.05);在3d,1周和2周三个 时间点各组之间不存在总的统计学差异,但在4周和8 周两个时间点存在着总的统计学差异(P值分别为:0. 003和0.0130);各处理组不同时间点的方差分析,Sham 组,EB组和Gs组不存在总的统计学差异,但OVX组不 同时间点之间存在总的统计学差异(P=O.003). 3d,1周和2周3个时间点DG分子层的突触体素 免疫阳性产物MOD的单因素方差分析,不存在总的统 计学差异(P>0.05),但4周和8周两个时间点各组之 间存在总的统计学差异(P值分别为:O.004和0.000); 各处理组不同时间点的方差分析,OVX组不同时间点 之间存在总的统计学差异(P=0.001),但Sham组,EB 组和Gs组不存在总的统计学差异(P>0.05).均数间 差别的多重比较结果见表1,2. 3讨论 突触体素(synaptophysin)由位于核周的高尔基复 合体合成,以轴突运输的形式运输至神经终末,结合 到小型囊泡膜上,在钙离子依赖性的神经递质(如乙 酰胆碱,谷氨酸等)的释放过程中起着重要作用7]. 突触体素是突触终末特异性标记物,通过免疫组化 和图象分析计算突触体素的数量能准确反映神经元 突触密度的变化状况l8].老年雌性小鼠或去卵巢大 鼠海马突触体素的密度降低,学习记忆能力下降,给 予雌激素替代治疗后大鼠海马突触体素的密度和学 习记忆能力恢复?J. 本实验结果表明,去卵巢后海马CA区辐射层 及DG分子层内突触体素免疫反应产物的MOD值均 较Sham组明显降低,给予EB或Gs替代治疗后突触 体素免疫阳性产物MOD值增加,与Sham组比较无显 着性统计学差异.提示去卵巢之后,海马突触密度下 降,神经元突触联系减少,Gs替代治疗与雌二醇替代 治疗均能恢复去卵巢大鼠海马突触体素密度,这可能 是去卵巢后大鼠学习记忆能力减退,但给予Gs替代 治疗后学习记忆能力恢复的机制之一.Gs能增强体 内抗氧化酶活性,并能通过结构性的和化学性的抗氧 化作用减少神经元膜系统和DNA等的氧化损伤,维 持钙离子稳态,保护神经元免受氧化应激和持续钙超 载的损伤,增加海马等有关部位的神经元的突触密 度,维持学习记忆的神经活动].有希望作为 一 173— 一 种雌激素替代药物用于防治女性更年期后中枢神经系统的退行性变. 表1CAl,3区放射层突触体素免疫阳性产物MOD(j?s) Tab1MODofsynaptophysinimmunopositiveproductofradiationlayeratCAldsubregions(五?s) ComparedwithOVXgroup.P<O.05.P<O.01:comparedwith3daysafterovariectomy,P<O.05 ,P<O.01;compared withoneweek’afterovariectomy.?P<0.05 表2齿状回分子层突触体素免疫阳性产物MOD(x?s) Tab2MODoflayersynaptophysinimmunopositiveproductofmolecularatdentategyrus(x?s) ComparedwithOVXgroup.?P<O. 05.??P<O. 01;comparedwith3daysafterovariectomy,P<O.Ol;compar~with1week afterovariectomy.P<O.05 去卵巢后大鼠cA区辐射层和DG分子层突触 体素免疫阳性产物的MOD值降低是随着时间而累积 的过程.2周时DG分子层免疫阳性产物的MOD值 已经显着低于Sham组和EB组,4,8周时OVX组大 鼠cA区辐射层和DG分子层突触体素免疫阳性产 物的MOD值均较其它3组降低更加明显,提示应用 EB或Gs进行替代治疗宜及早进行. 图版说明(图见插3) 图1海马空白对照染色,×25. 图2假手术组海马突触体素免疫组化染色,×25. 图3海马CAz区辐射层突触体素免疫组织化学染色,×200.A:假手 术组;B:苯甲酸雌二醇组;C:金雀异黄酮组;D:去卵巢对照组. Ex~tionofr~,rts(Seeinsert3) Fig1Hippocampusofemptycontrol(immunohisteehemistrystaining),×25. Fig2Hippocampalsynaptophysininsham?operatedgroup(immunohistoche— mistrystaining).×25. Fig3MolecularlayersynaptophysininhippeeampalCA2area(immunohisto— chemistrystaining).×200.A:sham—operatedgroup;B:estradiol benzoategroup;C:genisteingroup:D:ovariectomizedcontrolgroup. 参考文献 1GlazierMG.BowmanMA.Areviewoftheevidencefortheuseofphy— toestrogensasareplacementfortraditionalestrogenreplacementtherapy. 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