开窍中药对牛肾上腺髓质细胞儿茶酚胺分泌的影响_0

开窍中药对牛肾上腺髓质细胞儿茶酚胺分泌的影响_0 开窍中药对牛肾上腺髓质细胞儿茶酚胺分 泌的影响 开窍中药对牛肾上腺髓质细胞儿茶酚胺分泌的影响 毛浩萍?,高秀梅h,赵粉荣,王虹,张晗.,柳原延章,杨佳凤,张德芹,张伯礼(1.天津中医药大学中 医药研究院,方剂学教育部重点实验室,天津市中药药理重点实验室,天津300l93;2.日本产业医科大学医学部药理室日本北九洲807_ 85551 摘要:目的探讨开窍中药冰片,牛黄,麝香,石菖蒲及苏合香对牛肾上腺髓质细胞儿茶酚胺分泌的影响.方法体外培 养牛肾上腺髓质细胞,HPLc—EcD检测其分泌儿茶酚胺的含量,分别考察5种开窍药对乙酰胆碱,藜芦定碱和56mmo1. L一高钾溶液诱导的儿茶酚胺分泌的影响.结果5种开窍中药均显着抑制乙酰胆碱,藜芦定碱诱导的儿茶酚胺分泌(P< 0.05或P<0.O1)而对高钾溶液诱导的儿茶酚胺分泌均无显着影响;对乙酰胆碱诱导的儿茶酚胺分泌的抑制作用随浓度升 高而增强(P<0.05或P<0.01).结论开窍中药具有抑制交感活性作用,且通过乙酰胆碱受体途径和电压依赖型钠离子 通道发挥作用. 关键词:冰片;牛黄;麝香;石菖蒲;苏合香;儿茶酚胺;牛肾上腺髓质细胞 中图分类号:R965文献标识码:A文章编号:1o0l一2494(20o8)20—1555—04 Effects0fTrad-tiOnalChineseMediciIlesf0rInducingResuscitationOnCatechOlamineSecretioninB OV-ne AdrenalMedullaryCells MAOHao.ping,GAOXiu.mei,ZHA0Fen.r(】ng,WANGH0ng,ZHANGHan,YANAGIHARAN.,YANG Jia.feng,ZHANGDe—qin,ZHANGBo-1i(1.胁把0厂r,rn脚Ze,on,.n瑙D厂船f ed;6omor,rnn懈ecnz舰He,砒0砌;铆6omto出胍Z edc聊,.凡300193,;2.Dm0厂?肌0c0fog),,觇巧0ccn砌Z?r0册m0f0触,.,印.n &ooZdc聊,fn807-8555) ABSTRACT:oBJECTIVEToinvestigatetheelkctsoftraditi0nalChinesemedicine(TCM)f0rinducin gresuscitationinclude bome0l,cow_hez0ar,musk,grassleafsweemagrhizomeandstoraxoncatecholarnine(CA)secretionfT omcult1】Tedb0vineadrenal medullan 『cells.MIETHoDSBovineadrenalmedullaryeellswereprimaryculturedatadensitvof5×10cells/weU( 24wells plates,c0star),whichwereusedin3—7d.Thecellswereincubatedwithacetylcholine,veratridineand56 mmol?L一Ks0lution inthepresenceorabsenceoftheabovefivedmgsf_orl0min.Thenthecontentsofcatecholaminesecretedi nt0thesupematantsf_阳m theculturedcellsweredeterrninedbyHPLC—ECDanalvsis.RESULTSIncubationofce11swithal1the indicateddmgsf0rl0min causedasignificantdecreaseinCAsecretioninducedbyacetylcholine(300mol?L)andveratridine(100 rn_0l?LI1)(P< O.O5orJP<0.01),whilenoefctwasobservedf0r56mmol?L-.KinducedCAsecretion.Theinhihition 0fACh—inducedCA secretionflr0mboVineadrenalmedullarycellsshowedadose—dependentmanneCoNCLUSIoNThes eresultssuggest,hatdmgsfor inducingrlesuscitationinhibittheactiVitiesofsympathesisvianicotinicacetylcholinereceptor—ionchanne1pathwayandvoltage— dependentNachannelpathwayina(1renalmedullaryce11s. KEYWoRDS:bomeol;cow南ezoar;musk;grassleafsweemagrhizome;storax;catecholamine.bovineadrenalmedullarycells 儿茶酚胺(catech0lamine,CA)是机体维持正 常生命活动的内源性物质,太过或不及均会造成病 理性损伤.研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,cA与心脑血管疾病,精神 病,肥胖,免疫系统,泌尿系统等疾病有密切的关 系.通过药物干预CA的合成和分泌对于上述疾病 具有重要的意义. 开窍中药是一类以开窍醒神为主要作用的中 药,包括麝香(musk),苏合香(stor戕),石菖蒲 (grassleafsweetnagrhiz0me),牛黄(cow-bez0ar), 冰片(bomeo1),临床用于窍闭神昏,根据药性和 临床适用症不同又分为凉开药和温开药两类.研究 表明,开窍中药具有兴奋中枢神经,抗惊厥,抗 基金项目:国家自然科学基金资助项目(3o67263l,30572348);教育部NcET—D6253计划 作者简介:毛浩萍,女,硕士研究生通讯作者:高秀梅,女,研究员,博士生导师Tel:O2223O5l027E.mail:gaoxiumei@ utcm.edu.cn 中国药学杂志2O08年10月第43卷第20期(Pnm1.,.2oo80以o6er. %Z.43,v0.20?l555? 炎,解痉等作用.近年来开窍药除主要用于昏 迷,冠心病心绞痛等急症外,也广泛用于急性感染 病,神经,精神性疾病等_3J. 鉴于开窍中药主治病症与cA异常导致疾病有 一 定关联性,且开窍中药对肾上腺髓质细胞分泌儿 茶酚胺系统研究未见文献报导,因此本实验采用拟 交感活性的牛肾上腺髓质细胞,研究其对CA分泌 影响,为其临床合理用药提供药理学依据. 1实验材料 1.1药品和试剂 牛肾上腺(天津市北辰屠宰场).KRP缓冲液 由154I砌0l?LI1NaCl,5.6mm0l?L-1KCl,1.1 mmol?LMgSO4,2.2mmol?LCaCl2和l0 mm01?LI1葡萄糖组成,pH7.4;高钾溶液为含56 mmo1?LK的KRP缓冲溶液;MEM培养基和新 生牛血清(co,美国Invitr0gen公司);胶原酶 (Nittazerachin,日本大阪);乙酰胆碱 (acetylch0Hne,ACh),藜芦定碱(veratridine, Ver),肾上腺素(epinephrine,E),去甲肾上腺素 (no叩in印hrine,NE)(sigIIla,美国);乙二胺四 乙酸二钠,磷酸,磷酸二氢钾,高氯酸(PCA)等 均为国产 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯,甲醇,乙腈为国产色谱纯;冰 片,牛黄,麝香,石菖蒲,苏合香均购自安国药 材市场,并由本实验室鉴定合格. 1.2仪器 Alentll00高效液相色谱系统(美国A西lent 公司);DECADE?电化学检测器(荷兰ANTEc LEYDEN公司);台式AuJEGRA一64R高速离心机 (美国贝克曼公司). 1.3药液制备 1.3.1冰片溶液冰片用DMs0配成1O,l,0.1 g.L溶液后,使用时分别用KRP缓冲液稀释200 倍,制成含冰片5O,5,O.5mg?L的含药溶液. 1.3.2牛黄溶液天然牛黄用DMs0配成50,5, 0.5g?L的溶液后,使用时分别用KRP缓冲液 稀释20o倍,制成含牛黄25O,25,2.5mg?L的 含药溶液. 1.3.3麝香溶液天然麝香用DMS0配成l0,1, 0.1g?L的溶液后,使用时分别用KRP缓冲液 稀释200倍,制成含麝香50,5,0.5mg?L的 含药溶液. 1.3.4石菖蒲水煎液称取石菖蒲药材20.Og, 加人 1.3.7Ver溶液Ver用二甲基亚砜(DMSO)配 成20mm0l?L的溶液后,使用时分别用上述药 物溶液或KRP缓冲液稀释20o倍,制成含Ver1o0 m0l?L的缓冲液. 2方法 2.1牛肾上腺髓质细胞原代培养 取新鲜的牛肾上腺用组织切片器切取牛肾上腺 髓质,按照YanagiharaL4所述方法用胶原酶消化成 单个细胞后,以每孔5×10个细胞的密度种植于 24孔细胞培养板(Costar,美国),培养于含10% 新生牛血清,100u?mL青霉素,100mg?LI1链 霉素,0.25mg?L两性酶素B和30l?L阿 糖胞苷的MEM培养基中.置于37?含5%CO/ 95%空气细胞培养箱中培养3,7d内使用. 2.2牛肾上腺髓质细胞中cA的分泌 将培养的牛肾上腺髓质细胞用KRP缓冲液冲 洗3次后于37?水浴中孵育,分别加入5oo反 应液(含药物及相应刺激剂的KI缓冲液或含药 的高K缓冲液).lOmin后取出反应液,加入 2OooL2mo1?LPcA溶液终止反应.采用氢 氧化铝吸附法浓缩提纯分泌至反应液中的肾上腺素 和去甲肾上腺素],HPLC—ECD检测肾上腺素和 去甲肾上腺素的量,两者之和作为细胞分泌CA的 量. 反应结束后,取对照孔细胞,用20oo去 离子水洗刮收集细胞悬液,加入50o2m01. LI1PCA.300Or?min离心lOmin后,取上清 液25OL,加入1800L水和450L2m0l?LI1 PcA后进行铝吸附,用HPLC检测肾上腺素和去甲 肾上腺素,两者之和的10倍作为细胞总CA量. 数据用细胞分泌cA量占细胞总cA量的百分比表 示. 2.3牛肾上腺髓质细胞中CA分泌的检测 色谱柱:symmetryShield?RP18Column(3.9 mm×l50mm,5m,waters公司,美国);流动 中国药学杂志20o8年1O月第43卷第20期 相:甲醇.乙腈一水(含磷酸二氢钾0.1mo1.L,, EDTA—Na,0.1mm0l?L-.,辛烷磺酸钠0.25%, pH3.4):10:1:89;流速:1mL?rnin,;柱温: 35?;ECD工作电压为+O.7mV,量程范围0, 200nA;进样量:20. 2.4统计学分析 数据用均值?标准差表示.使用sPSs11.O软 件包进行单因素方差分析.P<0.05表示差异具有 统计学意义. 3结果 3.1开窍药对牛肾上腺髓质细胞中不同刺激剂诱 导的CA分泌的影响 3o0m01?LACh,10om0l?LVer或56 mmo1.LK溶液均能刺激牛肾上腺髓质细胞中 CA的分泌.5mg?L冰片能显着抑制ACh,Ver 引起的CA分泌,抑制率分别为l6.7%,17.1%, 而对高K溶液引起的CA分泌无明显作用(图l A).同样250mg?L牛黄,50mg?L麝香,500 mg?L石菖蒲和5mg?L苏合香与冰片作用类 似,均能显着降低ACh,Ver引起的CA分泌,抑制 率分别为39.5%,11.6%;41.2%,20.5%; 40.2%,9.7%和29.9%,28.2%,并且都对高K 溶液引起的CA分泌无明显作用(图1B,E). 以上结果说明,5种开窍药冰片,牛黄,麝 香,石菖蒲及苏合香均可抑制Ach,Ver诱导的 cA分泌,且对高K诱导的cA分泌无显着影响. 且开窍中药对牛肾上腺髓质细胞CA分泌的影响与 其寒热药性无关. 3.2不同浓度开窍中药对乙酰胆碱诱导的CA分 泌的影响 0.5,5,50mg?L冰片均能抑制300mo1? LAch引起的牛肾上腺髓质细胞分泌CA,且随剂 量增加作用增强,与Ach相比均具有统计学差异 (图2A).同样250mg?L牛黄能显着抑制30o m0l?LACh引起的CA分泌(P<0.01)(图 2B).0.5,5,50mg?L麝香也能抑制ACh引起 的CA分泌,与ACh相比均有统计学差异(图2c). 500mg?L石菖蒲也能抑制ACh引起的CA分泌, 与ACh相比有统计学差异,P<0.0l(图2D). 0.5,5,50mg?L苏合香也能显着抑制Ach引起 的CA分泌(P<O.05,P<0.O1)(图2E). 以上结果说明,开窍药对ACh诱导的CA分泌 均具有抑制作用,且具有剂量依赖关系. 中国药学杂志20o8年lO月第43卷第20期 i+ 图1开窍中药对不同刺激剂诱导牛肾上腺髓质细胞cA分 泌的影响 A一冰片;B一牛黄;c一麝香;D一石菖蒲;E一苏合香.数据用细胞分泌 cA量占细胞总cA量的百分比表示..与相应的刺激剂组相比,)P< 0.05.2)P<O.Ol n昏1EffEctsofb0meol,cow_hezoar,musk,gmssleaf sweetnagrhizomeandstoI_axoncatecholaminesecI?tioninduced bvacetvlch0line.veratridineand56mmol?L_.K A—thecellswereincubatedat37?f0rl0minwi,h【lrwithout5mg?L一 b0me0J;B一25Omg?L一cow-bez0a;C一50mg?L一musk;D,50omg? L一grassleafsweemgrhiz0m.;E一5mg?L一st0raxin,h.presence0rabsence nf3oon0l?Lacetykh0itne,l【x)0l?L一v吖atdineand56mmol?L一1 K.Catech0laminessecretion_sexpressedasthpercentageof山eto catech0larninecontent.1)尸<0()5and2)|p<OOl, c0mparedwilhstimlllaIlts, cormspn?dingly 4讨论 cA类神经递质,是一类重要的生理物质,包 括NE,E和多巴胺(dopamine,DA).NE,E是 由少数脑干神经核,交感神经元,肾上腺髓质细胞 合成分泌;DA是NE生物合成的前体,仅由脑部 的少数神经核产生.由于外周血液中的CA不能进 入血脑屏障,因此外周和中枢神经系统的cA分属 两个独立的代谢系统. E,NE分泌增加,可提高中枢神经系统兴奋 性,增快心率,加强心肌收缩,增加心输出量,升 高血压,减少内脏血流,升高血糖,促进脂肪分解 和氧化等.各种应激是造成cA合成分泌增加的主 要原因,长期的应激会造成一系列的免疫功能异 常,同时加重原发性疾病,如高血压,冠心病,动 脉粥样硬化等.E,NE分泌不足引发抑郁症等. 因此通过药物干预CA的合成和分泌具有重要的治 疗学意义. 肾上腺髓质细胞来源于胚胎神经嵴,它具有交 a,,20080c6er.%.43?0.20 l 01E controlAChQ: St~’sx/mgL 图2不同浓度开窍中药对ACh诱导牛肾上腺髓质细胞分 泌CA的抑制作用 A一冰片;B一牛黄;C一麝香;D一石菖蒲;E一苏合香.数据用细胞分泌 CA量占细胞总CA量的百分比表示,与ACh组相比,)P<0.05,)P<0.01 飚2Effectofbomeol,COW—bezoar,musk,grassleaf sweetflagrhizomeandstoraxonacetylcholine—induced catecholaminesecretion A—Thecellswereineabatedat37?for10rainwithorwithout0.5,50?lg? L—lbomcel;B一2.5-250mg-L一1oow-bezoar;C—n5~50mg?L一1musk: D一5-500nag?L’lgrassleafswcetflagrhizome:E一0.5—50mg?L一1storax inthepresenceof300p.mol?L一ACh.Catecholaminessecretionisexpressedas thepercentageofthetotalcateeholaminecontent.VsACh.1)P<O. 05.2)p<0.01 感神经节后神经元相同的生理和药理学特性,国际 上将其作为拟交感神经的模型,也是研究CA合 成,分泌和重吸收以及药物影响的理想细胞模 型].本实验室成功建立了牛肾上腺髓质细胞培 养方法,并首先在国内将其应用于中药研究. CA分泌受细胞内ca影响,Ca2浓度升高是 诱发CA释放的必要条件J.在神经系统中,动作 电位可以诱导递质释放.当动作电位出现时,Na 内流造成膜去极化,引起膜上电压门控ca?通道开 放,Ca2内流诱导递质释放.本实验和以往 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 均 显示ACh,高K(56mmol?L),藜芦定碱 (veratridine,钠通道开放剂)均可刺激牛肾上腺髓 质细胞分泌CA[8引.ACh是体内重要的生理活性物 质,它与肾上腺髓质细胞膜上的烟碱型ACh受体 (nicotinicacetylcholinereceptor)结合,改变膜的通 透性,使钠内流,引起膜去极化使电压依赖型ca” 通道开放,引起胞内Ca2增加,导致CA的分泌. 中药开窍药分为温开与凉开两类,麝香,苏合 香和石菖蒲属于温开药,而牛黄,冰片为凉开药, ChinPharrn.,,2008October,Vo1.43No.20 很多临床常用的中成药如牛黄降压丸,冠心苏合香 丸,麝香保心丸等含有上述药物,临床主要用于治 疗中风,冠心病,高血压等.以往研究结果显示, 冰片非竞争性抑制nAChR介导的牛肾上腺髓质细胞 分泌CA…,与本实验结果一致;而其他开窍中药 对牛肾上腺髓质细胞分泌CA的影响未见文献报告. 本次实验结果表明,开窍中药麝香,苏合香, 石菖蒲,牛黄,冰片均可以抑制ACh,Ver刺激牛 肾上腺髓质细胞引起的CA的分泌,且呈现一定的 剂量依赖关系,且对高K(56mmo|?L)引起 的CA分泌没有影响. 提示 春节期间物业温馨提示小区春节期间温馨提示物业小区春节温馨提示春节物业温馨提示物业春节期间温馨提示 开窍中药抑制CA分泌 主要与细胞膜上nACh受体和电压依赖型钠离子通 道有关,这也可能是开窍中药治疗心脑血管病的机 制之一,同时也提示开窍药可以用于缓解应激损 伤.另外从本实验结果看来,无论是温开药还是凉 开药对CA分泌均为抑制作用,并无温凉药性之 差.因此,对中医理论中温开与凉开的药理学差异 有待于进一步研究. 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