受精液和精子处理方法对水牛卵母细胞体外受精的影响

受精液和精子处理方法对水牛卵母细胞体外受精的影响 受精液和精子处理方法对水牛卵母细胞体 外受精的影响 第29卷第6期试验研究 受精液和精子处理方法对水牛卵母细胞体外受精的影响 杨红远,关莎莎,洪琼花 (1.云南省畜牧兽医科学院,昆明650224;2.云南农业大学) 摘要:研究了不同受精液和精子处理方法对沼泽型水牛卵母细胞体外受精卵裂率 的影响.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,使用BO液和TALP 液对卵裂率没有显着影响(尸>o.05).Percoll离心法和离心洗涤法对卵母细胞受 精卵裂率也没有显着影响(P>O.05). 关键词:受精液;卵裂率;Percoll;离心洗涤 EffectofIVFFluidsandSpermSelectionMethodsonOocyteCleavageinSwampBuffalo YangHong—yuan,GuanSha—sha.,HongQiong—hua (1.AcademyofYunnanAnimalHusbandryandVeterinary,Kunming650224;2.YunnanAgriculturalUniversity) Abstract:ThisstudywascarriedouttoinvestigatetheeffectofIVFfluidsandspermselectionmethodsonoocytecleavage.Inexperi ment1,after25hofIVM,oocyteswerefertilizedinBOandTALPfluidsrespectively.Inexperiment2,thefrozen—thawedspermwas submittedtowashintwomethods:Percollcentrifugationandcentrifugalwashing.TheresultsshowedthatthetwoIVFfluidsinthe studyhadnosignificantlydifferenteffectoncleavage,withthecleavagerate47.86inBOand54.73inTALP,andsodidthetwo spermselectionmethods(5O.13,45.85). Keywords:IVFfluids;cleavage;Percoll;centrifugalwashing 在过去的几十年里,研究人员针对不同的动物开发了多种 卵母细胞体外受精液,常用的有BO,TALP,KRB,SOF,DM等. 研究发现,这些受精液成分中没有某个动物受精所绝对必须的 成分.因此在后来研究中,这些液体常被借用于其他动物的体 外受精中,如在仓鼠卵母细胞体外受精研究中配制出的TALP 液被引入到黄牛的体外受精中,效果良好.但是,不同动物,某 种受精液的作用效果可能并不相同.在山羊卵母细胞的体外受 精中,BO液的受精率要高于TALP液].因此,选择适宜的受 精液对体外受精的效果有重要的影响. 用于体外受精的冷冻精液,除了精浆外,还含有抗冻剂,细 子获能,有的能 胞碎片和污染物等成分,这些物质有的能抑制精 阻碍精卵融合.因此在受精前应尽可能地把它们分离出去,筛 选富含活力强的精子,以利于卵母细胞受精过程的完成.然而 有效的精液洗涤方法是获得适用于体外受精精子的重要 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 . 1材料与方法 1.1药品TCM199液体(Gibco,批号:1206794),FSH(ICP biolimited,批号:6444),LH(AnimalHealthCanadaInc,批号: L083V—F052).本试验所用试剂,除非特别声明,均购自Sigma 公司. 1.2仪器体视显微镜:型号SZX9型,日本生产;电子天平: 型号BP3100S,德国生产;恒温板:型号HP一4530,日本生产; 收藕日期{2009—08—04, 基金项目:云南省省院省校科技合作计划(2006YX08)和云南省自 然科学基金项目(2007C256Ml|资助)? 作者简介:杨红远(1978一,男,助理研究员硕士. 通讯住者:洪琼花(1968一女,研究员,硕士生导师. 文章编号:1007—9726(2009)06—0005一o2{0圈分类号:S82氟83) 超纯水仪:MiILi—Q,美国生产;高压灭菌器:型号SS245,日本生 产;数显恒温水浴锅:型号HH一420S,江苏金坛市环保仪器厂生 产;广口小保温杯:型号L,日本生产;倒置荧光显微镜:型号IX 71,日本生产;离心机:型号TDL一40B,上海安亭科学仪器厂生 产;超净工作台:型号BCM-1000,苏州苏净集团安泰公司生产; PH仪:型号828,美国生产. 1.3卵母细胞的采集从昆明市水牛屠宰场收集水牛卵巢,置 于37?生理盐水中4h内运回实验室.用带16#针头的1O mL注射器先吸取约1mLPBS,然后抽取卵巢表面直径2,8 mm卵泡中的卵丘一卵母细胞复合体(COCs).抽取5,1O枚卵 巢后将抽取液注入15mL尖底离心管,离心管置于37?水浴锅 中.抽取液静置使COCs沉降后弃上清,下部液体连同沉淀物 移人中6omm培养皿中,于实体显微镜下挑选出的COCs各在 PBS和成熟液中清洗3遍后进入成熟培养. 14卯母细胞的分级根据卵母细胞外卵丘细胞的有无和数 量,从卵巢中获取的卵母细胞最多可分为4级:A级为卵母细胞 外围有3层以上的卵丘细胞完全包裹,卵丘细胞致密卵母细胞 胞质均匀;B级为卵母细胞外围卵丘细胞少于3层但完全包裹, 卵丘细胞致密卵母细胞胞质均匀;C级为卵丘细胞在卵母细胞 周围包裹的不完全,卵母细胞胞质均匀度较差;D级为卵母细胞 外仅有少量或没有卵丘细胞存在,卵母细胞胞质不均匀或有碎 裂.本试验所用卵母细胞为A,B级. 1.5成熟液和培养方法成熟培养液:TCM199+10灭活的 胎牛血清(FBS)+10~tg/mLFSH+10ffg/mLLH+1,ug/mL E.十10mM半胱氨酸.成熟培养液在培养箱中预先平衡2h. 成熟培养时间为25h.卵母细胞培养用35mm培养皿 (Nunc),每小滴7OML培养液放入1O,15枚COCs,覆盖石蜡 油.培养条件为5COz的空气,38.5?,饱和湿度. 鳍中国草食动物2009钲 利用腹腔镜技术观察发情藏羊黄体的研究 晁生玉,赵鑫z,扎西卓玛,巴文胜,李桂香,高玉兰,王成林,杨安圈,王照忠,张王花,孟 智杰.,张居农 (1.青海省海西州畜牧兽医工作站,德令哈817000;2.石河子大学动物科技学院,新 疆832003) 摘要:利用腹腔内窥镜观察发情藏系-g-~q-宫及黄体情况.结果表明:参试藏系母羊 双侧均有黄体的有12只,占30~;单 侧有黄体的23只,占57.5%:黄体发育率87.5%.说明试验所选 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 对藏系母羊的诱 导发情和超数排卵效果显着(P< 0.O1).由腹腔内窥镜观察也可得知,母羊的发情调控效果较好. 关键词:腹腔镜;藏羊;黄体 腹腔镜技术是应用腹腔内窥镜对母羊子宫或卵巢进行观察 收耩日期:2009—08一O8 作者简介:晁生玉(1966一),男,推广研究员,本科. 通讯作者:张居农(1954一),男,教授,硕士生导师. 文章编号:1007—9726(2009)06—0006—03(中图分类号:S826.3) 或实施操作的一种新技术.由于母羊特殊的生理解剖特点,无 法进行直肠检查,只能以手术来观察子宫或卵巢的发育情况. 在生产实际中,不仅手术的|丁作量大,同时造成对母羊不必要的 手术损伤,增加了生殖器官粘连的发生率.与其他传统方法相 比,腹腔镜技术具有对母羊生殖器官损伤小,减少手术的盲目性 等优点,在母羊繁殖技术方面也有,泛的应用.为探讨发情调 ,—;产t,,,j,;,0,0,, 16卵母细胞的体外受精和离心洗涤法对卵裂率无显着性影响,结果见表2. 受精液1:BO液+20ffg/mI肝素十10mg/mIBSA; 获能液:BON+2og/mL肝素;!竺兰兰竺 受精液2:TAIP液+20ffg/mL肝素+6mg/mLBSA 获能液2:TALP液+20/~g/mI肝素. 取预先平衡至38.5?的获能液3mL嚣于15mL尖底离心 管中,取出水牛冻精1支,在38.5.C水浴中2OS解冻,将解冻后 的精液移入离心管内,离心(300g,8min)弃上清,再加入获能 液混匀,再离心洗涤弃上清,加入受精液可用于受精,精子终浓 度为1×10.个/mL.受精滴为每滴100L内培养1O,15枚 卵母细胞.受精条件为5%co,100湿度和38.5?二氧化碳 培养箱培养.配子共孵育时间23h. 1.7Percoll离心法在15mL尖底玻璃离心管中依次加入 9O和45Percoll各2mL.然后,将解冻后的精液加入Per— coll液顶层,离心(300g,20rain).吸取沉淀转入加有4mI受 精液的另一只15mL尖底玻璃离心管中,混匀.离心(100g, 10min),吸取沉淀用受精液稀释后置于C0.培养箱中备用. 9OPercoll液:18mLPercoll液+2.1mLSPTL(10×)+ 0.2mLSPAD(100×)十0.4mLstockB(5×);45Percoll液: 10mL90Percoll液+10mISPTI(1×);10×SPTL液: 4.675gNaC1+0.23gKC1+0.0398gNaH2PO4?H20+ 1.192gHEPES+1.302gHEPENa+3.68mI乳酸钠+ 0.06g青霉素G;100×SPAD液:CaCI2?H2O0.308g+MgC12 ? 6H2O+10mL超纯水;50×stockB液:NaHCO31.05g用1O ml_超纯水溶解. 18卵裂判断受精48h后,检查卵裂. 1.9统计分析采用sAS统计软件ANOVA程序分析. 2结果 2.1体外受精液对受精卵裂率的影响由表l可知,TAIP受 精液的卵裂率稍大于BO受精液,但是,两者差异不显着(P> 0.05). 22精液不同处理方法对受精卵裂率的影响Percoll离心法 注:同列数据上标不同小写字母表示差异显着(P<0.05),相同小 写字母表示差异不显着(.P>O.05).下同. 表2精液不同处理方法对受精卵裂率的影响 3讨论 在精液的处理方法上,Percoll离心法的优点是精子回收率 高,尤其对少精,弱精效果显着,能回收较多的精子并明显增加 其活力.本试验中也发现,Percoll离0后的精液精子活力高, 杂质少.但也有人认为Percoll离心对精子可能造成损害.离 心洗涤法操作简单,精子利用率高;也有人认为其对死活精子的 分选作用差,容易对精子造成损伤.本试验结果表明,这两种精 子处理的方法对卵裂率的影响没有显着性差异.尽管这两种精 子处理方法对精子有损伤,但这种损伤可能都没有达到影响受 精率的程度,或者两者对精子的损伤程度相差不大.但是,必须 注意的一点是Percoll离心法的成本高,程序复杂.因此,实际 上=离心洗涤法更加实用. 参考文献 [1]刘海军,侯蓉,张美佳,等.山羊卵泡卵母细胞体外成熟体外受精研 究[J].天津农业科学,2001,7(3):3538. 2]彭礼繁,罗光彬,袁水桥.不同共培养体细胞和胎牛血清对牛体外受 精后早期胚胎的影响[J].中国草食动物,2007,27(4):35. [3]马红.奶牛卵母细胞化学激活与电激活比较研究[J].中国草食动 物,2009,29(3):38-39.