用微分离方法培养肾皮质近曲肾小管和髓质集合管上皮细胞及其生物学特征的研究

用微分离方法培养肾皮质近曲肾小管和髓质集合管上皮细胞及其生物学特征的研究 傅 博 陈香美 李文歌 董 柯 张 颖 于力方 ()解放军总医院肾科, 解放军肾病中心暨重点实验室, 北京 100853 摘要 在肾间质发病过程中, 各段肾小管上皮细胞受到的侵害和发挥的作用不同。 为了探讨不同节段肾小管上皮细胞的生物学特征, 作者利用微分离的方法在解剖显微镜下获取肾脏皮质近曲小管和髓质集合管进行体外培养, 分别得到了纯净的近曲小管和集合管上皮细胞。通过细胞免疫组化和耐高渗实验方法对该两种细胞进行区分和鉴 ( 定, 利用 和细胞株依赖方法检测了该两种上皮细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达血管紧张素 21 受体和分泌白细胞介素26 2EL ISA IIA T IL ) 6的情况。结果: 近曲小管上皮细胞21 受体的分布和分泌 26 的量均显著高于集合管上皮细胞; 在血管紧张素A T IL 刺激下, 近曲小管上皮细胞产生的 26 明显增加, 而集合管上皮细胞则无明显改变。结论: 近曲小管和集合管上 II IL 皮细胞在炎症介质的产生上具有不同的生物学特征。 关键词 肾小管; 微分离; 上皮细胞; 培养 ( ) 肾小管上皮细胞体外培养是研究肾间质发1. 2 近曲小管和集合管的分离和鉴定1大病机理的重要手段。 由于各段肾小管上皮细胞 鼠肾灌注 雄性 大鼠 1 只, 麻醉后, 行腹主 SD 所处的解剖位置和生物学功能的不同, 因而它 动脉插管, 全身肝素化 2 , 将两侧肾脏连同 m in 们在肾间质发病过程中受到的损伤以及发挥的 ( ) 插管剪下, 用型胶原酶 1. 53 灌注消 ƒV m gm l作用也存在着较大的差异, 目前常用的肾小管 化 15 , 用无菌生理盐水终止消化, 取下肾脏 m in 上皮细胞培养方法很难在同一肾脏组织中获取 1 () 放置 缓冲液中。 2肾皮质近曲小管和髓KHB 比较纯一的各段肾小管上皮细胞, 因此不能 在体外分析和比较各段肾小管上皮细胞的生物 质集合管的分离 分别剪取肾脏外侧皮质和内 侧髓质两部分, 在解剖显微镜下利用自行拉制 学特性及差异。 我们根据各段肾小管的形态特 的玻璃吸针, 根据肾小管形态特征分别在皮质 征和解剖位置的不同, 利用微分离技术分别获 挑取近曲小管和在髓质挑取集合管。 将挑好的 取了肾皮质近曲小管和髓质集合管, 成功地培 2 肾小管吸入 25 的细胞培养瓶中, 加入含cm 养出两种肾小管上皮细胞, 并对该两种上皮细 胞的生物学特性进行了比较。 10% 胎 牛 血 清 的 培 养 基, 放 置1640 R PM I () 37?, 5% 孵育箱中培养上皮细胞。3近曲 CO 2 小管和集合管的鉴定; ?形态学特征近 曲小 管是肾小管各段中最粗最长的一段, 直径约 50 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 , 60 管壁呈单层立方上皮, 细胞腔面有大 , Λm 1. 1 材料 雄性大鼠, 体重 160, 180 , 由 SD g量密集的微绒毛, 光镜下为暗色。髓质集合管管 (解放军总医院实验动物中心提供。灌注泵 上海 腔较细, 光镜下颜色较浅。?免疫酶标染色 集 ) 沪 西分析仪厂, 型胶原酶, 血管紧张素 V II 合管上皮细胞生长良好, 经固定后, 加入抗集合 () 公司, 1640 培养液, 胎牛血清, S igm a R PM I () 胰酶 公司, 抗髓质集合管抗体 310 G IBCO G 管上皮细胞单克隆抗体 310, 37?孵育 1 , 洗 Gh (美国大学肾病实验室郝传明博士 V an de rb ilt 涤 后, 加 入 标 记 的 ?孵 育 30, 37F IT C IgG )赠送。 , 在荧光显微镜下观察染色结果。 同时对近m in 曲肾小管上皮细胞进行上述免疫酶标反应和设 立阴性对照。 用同样的方法进行细胞角蛋白染 色反应。 ?髓质集合管耐高渗实验 挑取近曲 小管及集合小管, 分别放置于 1. 5% 、3% 、4. 5% 和 6%溶液中各 10 条, 进行胎酚蓝染 N aC l 色, 记录着色时间。 1. 3 肾小管上皮细胞 21 受体的表达和分 A T ()泌 26 的检测 11 受体的检测 将原代IL A T 近曲小管和集合管上皮细胞消化后, 按 5000 个 细胞ƒ孔加至 96 孔细胞培养板中, 该两种上皮 细胞每个样本均一式双份, 每种上皮细胞共计 () () 附图 近曲肾小管和集合管耐高渗实验 PC T CD 6 个样本, 培养 48 后, 每种上皮细胞中一组用 h 细胞 方法测定细胞膜 受体的表 1 EL ISA A T 3 讨论达, 另一组用掺入法测定细胞的数量。M T T 3. 1 肾小管根据解剖位置依次分为近曲小管() 226 的检测 将原代近曲小管和集合管上 IL ()( )( 位于皮质、髓襻 皮质、髓质、远曲小管 位于 皮细胞消化后, 按 5000 个细胞孔加至 96 孔细 ƒ ) ( )皮质和集合管 主要位于髓质。 研究表明, 在 , 24后 换 为 含 2% 胎 牛 血 清胞 培 养 板 中h 肾间质发病过程中, 上述各段肾小管上皮细胞 - 7( 1640 培养液, 并加入血管紧张素 R P IM II 10受到侵害的程度各不相同, 近曲小管受到的损 ) ( 刺激 48 , 收集上清, 利用 71 26ƒ, m o lL h TD IL 2 伤往往最重, 而集合管受到的损伤常较轻。人 ) 依赖细胞株检测上清中 26 的浓度, 细胞掺 IL 们推测这是由于各段肾小管上皮细胞内在的生 入测量数量。M T T 物学特性不同所致。 但由于目前尚不能培养出 θ1. 4 统计学处理: 数据均用 ?表示, 两组均 x S 同一肾脏组织中纯净的各段上皮细胞, 因此对 数间比较采用 检验。t 在生理和病理条件下各段肾小管上皮细胞的生 2 结果物特性改变缺乏 充分认识。我们根据各段肾小 管解剖位置及形态上的不同, 利用微分离技术 2. 1 上皮细胞免疫酶标染色近曲肾小管和获取了同一肾组织中较纯净的近曲小管和髓质 集合管两种上皮细胞抗细胞角蛋白反应均阳集合管, 并成功地培养出上述两种上皮细胞, 利 性; 集合管上皮细胞抗集合管特异抗体 310G ( 用免疫组化和耐高渗实验 集合管有较强的耐 反应阳性, 而近曲小管上皮细胞则阴性。 ) 高渗能力对上述两种肾小管及其上皮细胞进 2. 2 不同渗透压对近曲肾小管和集合管活性 行了鉴定, 证实为近曲肾小管和集合管上皮细 的影响 在 1. 5% 、3. 0% 、4. 5% 和 6. 0% 四种 胞。浓度的溶液中, 集合管胎酚蓝的着色时间 N aC l 3. 2 我们对上述两种上皮细胞的生物学特性 均显著长于近曲肾小管, 结果见附图所示, 附图 进行了初步研究。血管紧张素 和 26 是机体 II IL 中所示数值均为 5 次观察的平均值。内两种重要的炎症物质, 它们在脏器局部病变 3, 4 的形成过程发挥着重要作用。血管紧张素 II 2. 3 两种上皮细胞表达21 受体和分泌 2 A T IL 5 的生物活性大部分是通过受体介导的。 1 A T 6 的状况 近曲小管上皮细胞 21 受体的分 A T 研究表明, 近曲肾小管上皮细胞是肾小管中产 6, 7 布和分泌 26 的量均显著高于集合管上皮细 IL 生生物活性和炎症物质的主要区域。我们的 胞; 在血管紧张素 刺激下, 近曲小管上皮细 II 实验结果证实 受体主要分布于近曲肾小1 A T 胞产生的 26 有明显增加, 而集合管 上皮细胞IL ( ) 受体和分泌 26 的比较 = 6 两种肾小管上皮细胞表达 1 附表A T IL n 3 )(26 ƒ5×10细胞 IL OD 1 受体 A T 上皮细胞3 ()OD ƒ5×10细胞 对照组血管紧张素刺激组 333 # 近曲小管0. 422?0. 021?0. 048?0. 0510. 4990. 605 0. 311?0. 011 0. 428?0. 034 0. 441?0. 049 集合管 3 与集合管组比较, < 0. 01; # 与血管紧张素 刺激前比较, < 0. 01 P II P 4 R , F e r ra r io CM , S t randho y JW . R ena l H anda 参 考 文 献( ) , 7 : 1ac t io n s o f ang io ten sin In v ivo and in v it ro 1996, 270: 1 B ie st IV D , N o uw en EJ , D romm e SA V , e t a l. stud ie s. A m J P h y sio l, F 141. C h a rac te r iza t io n o f p u re p ro x im a l and h e te ro geneo u s 5 Yo sh ida H , Ko v V , Ich ik aw a I. Po lym o rp h ism s o f 2d ista l h um an tubu la r ce lls in cu ltu re. K idney In t, th e ren in ang io ten sin sy stem gene s in p ro g re ssive 1994, 45: 85. 1996, 50: 732. rena l d isea se s. K idney In t, 6 , , , . 22F ine GN o rm anJ T O ng AC e llce ll C ro ssta lk in 2 K iyam a S, Yo sh io k a T , B u r r MI , e t a l. S t ra teg ic . th e p a tho gene sis o f rena l in te r st it ia l f ib ro sisK idney lo cu s fo r th e ac t iva t io n o f th e sup e ro x ide d ism u ta se ( ) , 1995, 47 49: 48.536. In tsupp le gene in th e nep h ro n. K idney In t, 1995, 47: 7 , , , . 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Tw o k in d s o f ep ith e lia l ce lls w e re iden t if ied b y in d irec t . imm u no f luo re scen ce an d su rv iva l cap ac ity expo sed to d iffe ren t h igh co n cen t ra t io n s o f N aC lT h e () 21 126 d ist r ib u t io n o f an g io ten sin II typ eA T recep to r an d th e cap ac ity o f p ro du c in g in te r leu k in ( ) 26262IL w e re ex am in ed b y EL ISA an d a IL dep en den t ce llu la r st ra in in tw o k in d s o f ep ith e lia l . 1 26 ce llsT h e re su lt s show ed th a t A T recep to r exp re ssio n an d IL re lea se in PC T ep ith e lia l ce lls . 26 w e re sign if ican t ly m o re th an tho se in tho se o f CDT h e cap ac ity o f p ro du c in g IL w a s m a rk ed ly , . en h an ced b y an g io ten sin II st im u la t io n in PC T ep ith e lia l ce llsb u t no t in CD ep ith e lia l ce llsIt w a s co n c lu ded th a t th e re w e re d iffe ren t ch a rac te r ist ic s b e tw een PC T ep ith e lia l ce lls an d CD .ep ith e lia l ce lls in th e p ro du c t io n o f in f lamm a to ry fac to r s Key word s ren a l tu b u le s; m ic ro d issec t io n; ep ith e lia l ce lls; cu ltu re