[doc] 表皮生长因子、成熟时间和牛卵泡液对山羊卵母细胞体外成熟的影响

[doc] 表皮生长因子、成熟时间和牛卵泡液对山羊卵母细胞体外成熟的影响 表皮生长因子、成熟时间和牛卵泡液对山羊 卵母细胞体外成熟的影响 安徽农学通报,AnhuiAgfi.Sci.Bul1.2006,12(5):55—57 表皮生长因子,成熟时间和牛卵泡液对 . 山羊卵母细胞体外成熟的影响 韩伟陶勇章美玲方俊顺刘建明邱志芳张锐陈华朱必龙章孝荣 (安徽农业大学动物科技学院,安徽合肥230036) 摘要:卵母细胞的体外成熟受多种因素的影响,成熟效率仍有待提高.本实验研究了表皮生长因子(EGF),成熟时 间和牛卵泡液(bFF)对山羊卵母细胞核成熟的影响.培养液中添加10—30ng/n~的EGF对山羊卵母细胞第一极体 (PB1)排出率无显着影响;体外成熟17h时第一极体排出率与成熟19h无显着差异,而明显低于其他组(P<0.05),在 成熟19—25h间第一极体排出率没有显着变化;10%bFF在胎牛血清(FBS)有无的条件下对山羊卵母细胞第一极体 排出率均无显着影响.结果表明:不同的成熟时间对极体的排除率有一定的影响;而添加一定剂量的EGF,bFF对黄 淮山羊卵母细胞的核成熟无明显影响. 关键词:表皮生长因子;牛卵泡液;卵母细胞;体外成熟 中图分类号Q25文献标识码B文章编号lOO7—7731(2006)一55—03 随着体外受精,核移植等胚胎工程技术研究的深入开 展,对卵母细胞的需求量也越来越大.与依靠超排技术获 得卵母细胞的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 相比,从屠宰的卵巢收集卵母细胞已成 为生产和研究中获得卵母细胞的主要途径,但因取自屠宰 卵巢的卵母细胞大都处于GV期,尚不成熟,需要在体外 培养成熟.因此,研究卵母细胞的体外成熟培养,提高卵 母细胞体外成熟的数量和质量,对开展胚胎工程技术研究 具有十分重要的意义.在研究中,人们尝试在培养液中加 入一些因子,其中表皮生长因子(EGF)最为常用.EGF可 通过刺激卵泡中颗粒细胞的增殖分化,抑制其凋亡或联合 促性腺激素及多肽因子来调节卵母细胞的成熟….有报 道称,30.g/ml的EGF能明显促进牛卵母细胞第一极体 (PB1)的排出,而50.g/ml的EGF能促进牛卵母细胞 成熟后体外受精效率.在山羊,此前有研究发现,低浓 度的EGF(10.g/m1)并不能明显提高山羊卵母细胞的 PB1排出率.体外培养体系中,更高浓度的EGF是否 能影响山羊卵母细胞的成熟,有待进一步研究.卵母细胞 体外成熟时,培养时间会影响成熟的效率.牛卵母细胞体 外成熟12h后,开始排出极体,在14,16h间PB1排出数 显着高于其他时间间隔,成熟18h进行体外受精,胚胎具 有较好的发育能力.山羊卵母细胞体外成熟时间范围 大都在20,24hJ.对山羊卵母细胞体外成熟时间的 研究,可以了解具体的最适合的培养时间,对于实验室工 作具有明显意义,有助于合理安排实验时间,并提高成熟 效率.卵泡液作为卵母细胞体内成熟的微环境,对卵母细 胞减数分裂具有抑制作用,这已在此前的研究工作中达成 共识.来源于牛优势卵泡(直径西>8mm)的卵泡液能提 高牛卵母细胞的发育能力.还有学者研究了直径在2 , 3mm的牛,绵羊和山羊卵泡的卵泡液对山羊卵母细胞 55 核成熟的影响,结果发现50%和100%山羊卵泡液均不能 对山羊卵母细胞减数分裂产生抑制作用,而100%牛卵泡 液能够部分抑制山羊卵母细胞核成熟恢复,但效果低于 100%绵羊卵泡液,证明了异种卵泡液对卵母细胞成熟 的作用.但优势卵泡的牛卵泡液能否用于山羊卵母细胞 体外成熟很少见报道.针对以上研究现状,本实验拟研究 不同浓度的EGF,不同体外成熟时间和来源于卵泡直径大 于8mm的牛卵泡液对黄淮山羊卵母细胞体外成熟的影 响,旨在为进一步开展山羊胚胎工程的研究打下基础. 1材料与方法 1.1试剂 配制DBPS(无Ca”Mg”)所用试剂采用国产商品, 其余试剂均购自Sigma公司. 1.2山羊卵母细胞的采集与培养 将刚屠宰山羊的卵巢置于预热的含双抗的生理盐水 中,5—8h内带到实验室,用75%酒精喷洒其表面,并剪去 输卵管等附属组织,再用含双抗的生理盐水清洗2—3次 后置于盛有生理盐水的烧杯中,烧杯放在恒温水浴锅内. 然后用切剖法收集卵丘一卵母细胞复合体(COCs),即将 处理好的卵巢放入平皿中,用刀切割1—6mm的卵泡,使 得COCs进入DPBS中,恒温操作台上静置3,5rain后,在 体视显微镜下挑取包裹完整的COCs用于培养.基础培 养液M199(earls)添加lOl~g/mlFSH,lOlzg/mlLH,1g/m1 E2,10%胎牛血清(FBS),0.3mM丙酮酸钠,75IU/ml青, 链霉素.采用微滴培养,每501~1液滴培养lO枚卵,石蜡 油覆盖,在38.5?,5%CO和饱和湿度条件下进行成熟培 养. 1.3牛卵泡液的获得 选择没有黄体的卵巢,用注射器抽吸表面直径大于 基金项目:安徽省”十五”科技攻关课胚(项目编号:04003005) 作者简介:韩伟(1978一),男,硕士研究生.主要从事哺乳动物胚胎工程研究.收稿日期;2006—04—17 56 8mm的卵泡,将获得的卵泡液放入1.5ml离心管中以 2000r/min离心5—8min,取上清,滤菌,一20?冷冻保存. 1.4成熟判定 参照张涌等判定山羊卵母细胞核成熟的方法:以 PB1的排出作为卵母细胞成熟的判断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 .在一定培养 时间后(根据实验设计),用0.1%透明质酸酶脱去卵丘细 胞,体式显微镜下观察PB1的排出情况. 1.5实验设计 实验一,EGF对山羊卵母细胞体外成熟的影响 分别在基础培养液中添加0ng/ml,10ng/ml,20ng/ ml,30ng/ml的EGF,培养19h后比PB1排出的差异. 实验二,成熟时间对山羊卵母细胞体外成熟的影响 分别培养山羊卵母细胞17h,19h,21h,23h和25h,比 较不同培养时间对PB1排出的影响. 实验三.bFF和血清对山羊卵母细胞体外成熟的影响 在实验二的基础上,选择体外培养时间21h,比较三 种不同培养液(分别含10%FBS,10%bFF,10%FBS+10% bFF)对PB1排出的影响. 所有试验重复三次以上,试验数据用方差分析 (SAS8.0软件)统计分析. 2结果 2.1EGF的浓度对山羊卵母细胞体外成熟的影响 在体外培养液中添加0ng/n1l,10ng/ml,20ng/ml,30 ng/ml的EGF对山羊卵母细胞PBI的排出率没有明显影 响. 表lEGF对山羊卵母细胞体外成熟的影响 注:上标注同字母表示差异不显着(P>0.05) 2.2成熟时间对山羊卵母细胞体外成熟的影响 体外成熟17h时PB1排出率(56.37%)显着低于成熟 21,25h(P<0.05),而与成熟19h无差异;成熟19—25h, PB1排出率升高趋势,但无显着差异. 表2成熟时间对山羊卵母细胞体外成熟的影响 注:上标注不同字母表示差异显着(P<0.05) 表3bFF和血清对山羊卵母细胞体外成熟的影响 注:上标注同字母表示差异不显着(P>0.05) 2.3bFF和血清对山羊卵母细胞体外成熟的影响 bFF对山羊卵母细胞PB1的排出有一定的影响,添加 10%bFF或以10%bFF代替10%FBS会降低山羊卵母细 胞PB1排出率,但各组之间无显着性差异. 3讨论 3.1EGF对山羊卵母细胞体外成熟的影响 EGF作为最常用的一种生长因子,已经发现能够促进 多种动物卵母细胞的成熟.添加EGF能够促进猪的卵母 细胞成熟,提高体外受精率和胚胎发育能力.Park 等认为EGF的浓度低于30ng/ml时对牛卵母细胞核 成熟没有明显作用,但有利于胚胎的发育.研究也发现 EGF对猫卵母细胞胞质的成熟有促进作用,25ng/ml的 EGF能提高其受精胚的卵裂率和囊胚率,但添加EGF对 MII期卵母细胞获得率上没有差异.以上结果可能说 明EGF对卵母细胞胞质成熟具有促进作用,能够提高卵 的质量和继续发育能力.本试验在山羊卵母细胞体外成 熟液中添加10,30ng/ml的EGF没有提高第一极体的排 出率,这和鲁进等0人对山羊的研究结果一致.但EGF 的加入对山羊卵母细胞的后期发育可能存在有利的影响. 3.2成熟时间对山羊卵母细胞成熟的影响 卵母细胞体外成熟时,成熟时间过长或过短都不不利 于卵母细胞成熟.过长会使细胞膜透明带老化,细胞内累 积的营养物质消耗及有害成分的增加;过短卵母细胞不能 合成足够的蛋白质和mRNA等,不能达到完全成熟. 胞质成熟会滞后于核的成熟.有报道,山羊卵母核成熟后 再继续培养3,4h有利胞质成熟.另有研究表明,卵 母细胞成熟时间会影响核移植时的去核率,因为随着体外 培养时间的延长,核和极体的位置会发生偏移,说明适 当的成熟时间不但能保证了卵母细胞的成熟率又能在核 移植中准确去核.而我们发现,山羊卵母细胞体外成熟 17h时极体排出率为56.37%明显低于21,25h(P>0. 05),而与19h无显着差异,随着时间延长,成熟19h至25h 其极体排出率没有显着差异.考虑到去核率和极体排出 率,建议用于核移植研究的山羊卵母细胞体外成熟19, 21h去核.去核的胞质体可以经再培养几h后才注核,以 使胞质获得成熟来提高胚胎的发育能力. 3.3bFF和血清对山羊卵母细胞体外成熟的影响 卵泡液作为卵母细胞发育的微环境对卵母细胞的发 育起主要调节作用,卵泡液中含有的促性腺激素,雌激 素,孕酮以及多种细胞生长因子,如转化生长因子(TGF), 胰岛素样生长因子(IGF)等对卵母细胞的成熟和受精后 胚胎的发育都具有重要的促进作用.卵泡液成分因卵 泡所处的情期不同而变化.用3%绵羊大卵泡(> 8ram)卵泡液液配合5%发情牛血清能充分满足绵羊卵母 细胞的体外成熟培养的需要.在牛的体外成熟液中添 加来源于不同大小卵泡的卵泡液均可促进成熟,添加 10%来源于不同大小卵泡的混合bFF可以促进卵母细胞 的受精以及受精后的发育J.10%的猪卵泡液对猪卵母 细胞体外成熟有一定的促进作用,但浓度(40%)太高则 相对抑制卵子核成熟进程.也有报道显示,用卵泡液 完全代替血清,卵母细胞的体外成熟率降低.我们研 究发现,体外成熟液中添加10%的来源于优势卵泡的bFF 或以10%bFF完全代替10%’FBS,对山羊卵母细胞PB1排 出率没有显着影响.由于本研究未进行受精实验,添加 bFF成熟的卵母细胞对胚胎发育潜能的影响不得而知. 总之,体外成熟黄淮山羊卵母细胞时,添加一定剂量 的EGF对第一极体排出率无显着影响;培养17h时第一 极体排出率与19h无显着差异,但与其他时间组差异显 着;10%牛优势卵泡的卵泡液培养山羊卵母细胞效果不如 血清好. 参考文献 [1]吕述彦.EGF调节小鼠GV期卵母细胞发育成熟的实验研究.东 南大学硕士论文,2001. [2]李向臣,丛日华,安志兴,王超,张涌.EGF和FBS对牛孤雌胚胎 发育的影响[J].西北农林科技大学,2004,32(4):51—54. [3]李兵兵,卢克焕.生长因子对卵母细胞体外成熟及早期胚胎体外 发育的影响[J].广西农业大学,1994,13(1):11—15. [4]赵晓娥,李向臣,高立功,吴月红,山灵,刘风军,王永胜,张涌.山 羊卵母细胞的体外成熟研究[J].中国农学通报,2005,21(9): l一3. [5]ParkYS,KimSS,KimJM,ParkHD,ByunMD.Theeffectsofdu— rationofinvitromaturationofbovineoocytesonsubsequentdevelop— ment,qualityandtransferofembryos[J].Theriogenology,2005,64 (1):123—134. [6]郭继彤,安志兴,李煜,李雪峰,李裕强,郭泽坤,张涌.成年耳细 胞克隆山羊[J].中国科学,2002,32(1):77—83. [7]ApimeteetumrongM,ThuangsanthiaA,LeingcharoenN, YiengvisavakulV,HarintharanonA,KunavongkritA,Sumretprasong J,VignonX,TechakumphuM.TheEffectofActivationProtocolson theDevelopmentofClonedGoatEmbryos[J].JVetMedSci,2004, 66(12):1529—1534. [8]KeeferCL,BaldassarreH,KeystonR,WangB,BhatiaB,Bilodeau AS,ZhouJF,LeducM,DowneyBR,LazarisA,KaratzasCN.Gen— erationofdwarfgoat(Caprahircus)clonesfollowingnucleartransfer withtransfectedandnontransfectedfetalfibroblastsandinvitro——ma.. turedoocytes[J].BiolReprod,2001,64(3):849—856. [9]AliA,CoenenK,BousquetD,SirardMA.Originofbovinefollicu— larfluidanditseffectduringinvitromaturationonthedevelopmental competenceofbovineoocytes[J].Theriogenology.2004,62(9): l596—606. [10]邵华,孟和宝力高,张锁链,旭13干.”两步法”体外培养山羊卵 母细胞的初步研究[J].内蒙古大学,2002,33(5):546— 551. [11]张涌,刘素娟,李裕强,芮荣,李勇.山羊大腔卵泡卵母细胞的体 57 外成熟和体外受精[J].河北农业大学,1998,21(1):45— 49. [12]AbeydeeraLr,WangWH,CantleyTC,RiekeA,MurphyCN, PratherRS,DayBN.Developmentandviabilityofpigoocytesma? turedinaprotein—freemediumcontainingepidermalgrowthfactor [J].Theriogenology,2000,54,787-797. [13]ParkKW,IgaK,NiwaK.ExposureofbovineoocytetoEGFduring maturationallowsthemtodeveloptoblastocystsinachemically—-de?- finedmedium[J].Theriogenology,1997,48:l127一l135. [14]MerloB,laeonoE,ZambelliD,PratiF,BelluzziS.EffectofEGF oninvitromaturationofdomesticcatoocytes[J].Theriogenology, 2oo5,63(7):2032—2039. [15]鲁进,刘风军,王勇胜,赵晓蛾,张涌.EGF和IGF—l对山羊卵 母细胞体外成熟的影响.黑龙江畜牧兽医[J],2005,3:7—9. [16]李勇.山羊卵母细胞体外受精及胚胎早期发育的研究.西北农 业大学,硕士学位论文,1996. [17]张涌,刘泽隆,李裕强.山羊卵泡卵母细胞体外成熟的研究.西 北农业大学[J],1999,27(1):l4一l8. [18]毕春明,李劲松,吴昱琪,张利生,寇朝辉,姜岩,蒋满喜,吕自 力,孙青原,陈大元.牛卵母细胞不同时间的成熟培养可以提高 核移植效率.自然科学通报[J],2003,13(9):997—1000. [19]YangX,JiangS,Fan’ellP,FooteRH,McGrathAB.Nucleartra/Isfer incattle:effectofnucleardonorcells,cytoplastage,eo—culture,and embryotransfeLMolReprodDev.1993,35(1):29—36. [20]AbdulRS,ShiD.Theeffectofprolactinandbovinefollicularfliud ontheinvitromaturationandsubsequentdevelopmentofimmature buffalo(Bublusbubalis)oocytes[J].JournalofSouth—ChinaA一 culturalUniversity(NatSciEd),2004,25(2):93—97. [21]OrsiNM,GopichandranN,LeeseHJ,PictonHM,HarrisSE. Fluctuationsinbovineovarianfollicularfluidcompositionthroughout theoestrou$cycle[J].Reproduction,2005,129(2):219—228. [22]胥焘,海里且木,陈静波,窦忠英.发情牛血清和绵羊卵泡液对 绵羊卵母细胞体外成熟和受精的影响[J].草食家畜,2005,l:40 — 42. [23]禹学礼,昝林森,邓雯,庞有志,王新庄.卵泡大小及卵泡液对牛 卵母细胞体外受精后发育的研究[J].中国农业科学,2005,38 (8):1664—1668. [24]卢晟盛,魏凤,房慧伶,王爱德,卢克焕.猪卵泡液和促性腺激素 处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响[J].安徽农业大学学 报,2005,32(3):289—292. [25]崔亚利,桑润滋.牛卵母细胞体外成熟及体外受精的研究.河 北农业大学[J],1999,22(1):68—70. [26]NandiS,RaghuHM,RavindranathaBM,Guptalos,SarmaPV.In vitrodevelopmentofbuffalooocytesinmedia—containingfluidsfrom differentsizeclassfollicles[J].ReprodDomesthnim,2004,39 38. (1):33— (上接第93页)于傍晚均匀喷施或泼浇,叶色正常的每 hm用尿素15—22.5kg兑水1500—2250kg喷施. 4.2带药移栽 栽前1—2d用25%的快杀灵乳油30—40ml兑水40— 50kg喷雾,以防治螟虫及飞虱. 4.3起苗运秧 轻起轻放轻运,随运随栽,以防止秧板变形和折断秧 苗. 4.4机插前坚持泥浆沉淀 因机插秧苗苗龄短,植株小,应根据土壤质地 确定泥浆沉淀时间的长短,以保证栽插质量夺取 壮苗.