正常儿童口腔中白色念珠菌的分布及基因分组

正常儿童口腔中白色念珠菌的分布及基因分组 正常儿童口腔中白色念珠菌的分布及基因 分组 有所不同,除健康青年外,白色念珠菌在检出的念珠菌中 均占多数.白色念珠菌3种基因分组的分布也存在差异,以A组为主.结论不同年龄阶段健康儿 童口腔中,A组白色念珠菌组占主导地位. 【关键词】白色念珠菌;基因分组;口腔;儿童 a,~/eansis’and雩}e咖锄pic鲫bg哪eIlfrom瑚o1”111?viti0fc~teretlteddn3dren Q,嘶gIlD,z日Du,D,删,Chun-hua.WestCh/naCoUege~matol? ,S/dinahu,,/ve,-s~,che.~~0041,Ch/na a印啊曲磐田撕:Q,嘶lD,~ma//:~g404@so/m.oom 【hlJsla’lt】~jediveT0咖dytlle~fion0fCand/da卿.Cand/da~/cansandl10typic l咖pB0fC.~/cansiIl~rnlaloralcaes0fdiffe~ntageclch.d出en.MethodsFivegrou~0fch.d出enA1 (),A2(3.2yearsoldaverageage),A3(7.2yearsold),A4(12.7yearsold)andA5(adul~20.4 years0ld),slandard~eoalswabsampl~,~turedandidentifi~tlICI-mOMa~arCardi~m,鼬8碰edto beC鲫l妣~/cansand~notypieallysul~roupeclbvPCR.Resullsnleiflolationrate0fCand/da~/cansisA1 (7.5%),A2(57.5%),A3(47.27%),A4(加.35%),A5(27.5%),tlleotherspeei~0fCardi~~luding Cand/da虮?如andCand/dan6m纽eta1.Andwetotallyfoundthreekinds0f~notypicsub霉0fCand/- 出~/cans,subgroupA,B,C,mysubo,~pA,amplifi~p~uets0fsI】lbI卿Cl1asthreebands.Cell- chm~/cans咖befoundiIlt}leorales0falltllegrou~0fdiffe~ntageclchil1.butthe ~ifiverate80fiflolationaIediffe~nt.~notypicsubgroupAist}le~minatingeompo~nt0ftlleCand/da~/c ans inaUtllegrou~. 【Keywords】Cand/da~/cans;~notypicsul~up;Oral;Chil~n 白色念珠菌(又称白色假丝酵母菌)是口腔正 常微生物群的组分之一,也是口腔中重要的条件致 病微生物,是包括新生儿”雪口症”在内的许多口腔 疾病的致病菌u].目前关于不同疾病状态下口腔中 自色念珠菌的研究比较多,但是对正常状态下口腔 中自色念珠菌的分布,了解还比较少.以前的研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,白色念珠菌在不同年龄阶段人群的口腔中,可 不同程度的检出【2】.白色念珠菌与口腔中的其它微 生物共同作用,相互粘附,维持口腔中的正常生态平 衡.研究表明,白色念珠菌与格登链球菌(搬. c~rdomi)有复杂的相互作用.另外,白色念珠菌 作者单位:四川大学华西口腔医学院(亓庆国,周学东,胡涛),教 育部口腔生物医学工程重点实验室微生物室(肖晓蓉),分子生物学 室(傅春华) 通讯作者:亓庆国,610o41成都,四川大学华西口腔医学院口腔 内科(~maihqqg404@8dm.c唧) . 细菌学. 与正常的口腔粘膜之间也有复杂的粘附机制,唾液 中的富脯蛋白有介导白色念珠菌粘附的作用【3】.研 究不同年龄阶段人群口腔中自色念珠菌的分布情 况,以及对其进行进一步的基因分组,研究不同基因 分组白色念珠菌的分布特征,是白色念珠菌分子流 行病学研究的重要内容.我们研究了从新生儿到青 少年的4个人群,了解了不同年龄阶段儿童口腔中 以白色念珠菌为代表的念珠菌群的检出情况,以及 白色念珠菌的基因分组情况,为研究白色念珠菌早 期定植以及正常演替提供基础. 材料和方法 研究对象:共有5个研究人群,A1(新生儿组): 出生1周以内的健康新生儿打分在9分以上者,共 有4o名,男孩18名,女孩22名,平均年龄为3d.A2 (乳牙列儿童组):4o名,平均年龄为3.2岁,男孩21 生堡生塑堂塑鱼瘴堂苤盍堡9旦第礁卷第9期cIlinJMicrobiolhm~ol,Senb2OO3,Vol23,No.9 名,女孩19名.A3(混合牙列期儿童组):55名,平均 年龄7.2岁,男孩32名,女孩23名.A4(恒牙列儿童 组):57名,平均年龄12.7岁,男孩34名,女孩23 名,乳牙已经全部换完.A5(健康青年组):40名,平 均年龄20.4岁,男性16名,女性24名.纳人标准为 无系统性疾病和遗传疾病,没有龋病,明显牙周疾病 以及口腔粘膜病.以上人群均来自成都本地或在本 地生活1年以上(新生儿除外). 主要实验器材和试剂:鉴定培养基CHROMagar Candida(法国科玛嘉公司);PCR使用试剂,包括Taq 聚合酶以及引物的合成(TaKaRa大连宝生物工程公 司);小量酵母菌DNA提取纯化试剂盒(上海华舜生 物工程公司);梯度PCR仪GradientThermalCycle(Ep. oendorf公司,德国);Bio-RAD凝胶成像及分析系统 (gel—Doc2OOO美国). 取样及分离鉴定 取样方法:使用改良的棉拭子法,在每一名儿童 的口腔颊粘膜处反复涂擦5次,将棉拭子头部剪断, 放人事先消毒灭菌的装有5OOvaPBS液的离心管中, 在2h以内送到实验室,将其在VERTEX上振荡2 min,无菌镊子将拭子头部的液体尽量挤出,将所有 的样本调整到3OOv~,弃去多余液体,6O00g离心10 min,弃去上清液,用100vl的PBS液重新混悬,准备 接种. 接种培养和鉴定:取样本15接种在CHROMa- garCandida鉴定培养基,37?恒温细菌培养箱需氧培 养48h,根据培养基上菌落的颜色来判断不同的念 珠菌种类,绿色菌落是白色念珠菌,紫色菌落是平滑 念珠菌,蓝色菌落是热带念珠菌,白色为不能鉴定出 来的其它念珠菌】.为确认白色念珠菌,用PCR的 方法作进一步的鉴定. 白色念珠菌DNA的提取,鉴定和基因分组:按 照小量酵母菌DNA提取纯化试剂盒使用说明要求, 将已纯化的单个菌落从培养基中挑出,麦氏比浊法, 用灭菌的PBS缓冲液将细菌数目调整到109/ml,使 用lytic,~e酶破细胞壁,蛋白酶K消化蛋白,RNase除 去RNA,吸附柱法获得白色念珠菌的DNA.白色念 珠菌的鉴定,根据文献[5]的方法,使用针对白色念 珠菌线粒体DNA上的E03序列而 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的一对引物, 引物1:5’-CACCAACTCGACCAGTAGGC.3;引物2:5. cG(GrCTATAI1AGA3.反应条件94?预变 性5min,然后94oC1min,56?2min30s,72?3min, 30个循环以后72?延伸7rain.反应产物用2%的琼 脂糖电泳,100V40mill,溴乙锭显色,白色念珠菌的 扩增产物是125bp左右.白色念珠菌基因分组,根 据MichealJ?的方法,针对白色念珠菌25SrDNA的 一 段内含子序列设计一对引物,CA—INT-L:5一ATA— AGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA一3,CA-INT-R: 5.CCrI’I?)CT_1rrI?GCTAGATAGTAGr-3.反应 条件是943rain预变性,然后94?1min,67?1 min,72?2min30S,30个循环.反应产物用1.5% 的琼脂糖电泳,100V30min,根据扩增产物的大小确 定不同的基因分组,4SObp为A组,s4Obp为B组,以 上2条产物都有者为c组,产物为1080bp的为D 组,产物为14OObp的为E组. 培养鉴定以及白色念珠菌的基因分型,阳性对 照均采用白色念珠菌的参考菌株A1?c90038(由四川 大学华西口腔医学院粘膜病研究室陈谦明教授惠赠). 统计学方法:采用Fisher精确检验. 结果 1.经过鉴定培养基的培养鉴定,共检出白色念 珠菌为主的3种念珠菌,分别是白色念珠菌,平滑念 珠菌,热带念珠菌和一些尚未鉴定的念珠菌菌种,各 组白色念珠菌的检出率分别是:A1组7.50%,A2组 57.50%,A3组47.27%,A4组40.35%,A5组 27.50%(表1);白色念珠菌在检出念珠菌中所占的 比例分别为A1100%,A279.31%,A378.79%,A4 74.19%,A535.48%.白色念珠菌和平滑念珠菌共 存的现象比较多见,A2组有1例,A3组有2例,A4 组有2例,B组有5例;白色念珠菌和热带念珠菌共 存也可以见到,A4组有1例,B组有2例. 表1不同年龄阶段人群口腔中自色念珠菌的检出情况 Table1.1lresultsat”isatatlon?lfCand/daaUgcansthe oralcavities0fnormalchildren0fdifferln~age Theresultsindicate:fishertest,thevarietyofGand/daa/b/canisolates frequencyofthefivegroupshasstatisticalm~nhs(P<0.001),A2,A3, A4,BdifferentfromAIrespectively(P<0.001),A2different丘olnA5P =0.012. ThevIyof,l出isohti~mofthefivegroupshasstatistical rneaI1咄(P<O.001),A2,A3,A4,Bdiffer~tAIrespectively(P< 0.?1).A4differentfromA5P=0.031. 生堡生塑堂塑鱼瘗堂查生旦第垫鲞筮ChinJMicrobiolImmunol,Septm~zr2OO3,v0l23,No.9 2.鉴定培养基上呈绿色的菌落,经过PCR鉴 定,均为白色念珠菌,PCR电泳结果见图1. bpMai’kerABCDEFGH 图1白色念珠菌PeR鉴定的电泳结果 1.Q?蕊出棚PeRidemiflcatlml I~rkel”IDNAln~Lrkel”DI2000(TAKARAI)alian)-P(pr~ctisaix~t 1251~:A:poeitivecootralATCC900~;B:Cand/dacdb/amsisol~ed丘% A1;C:Canada虮如idontifledbyclmmcandida;D:Can— digsg1日aidentifiedayC腿mbeandida;E:,Idb/ea~isol~一 edfromA2group;F:Cand/da础‰?is0l越ed丘.mA3group;G:Cand/da db/ea~isolatedA4gro~;H:Gmdb~msisolatedA5group 3.对白色念珠菌进行基因型鉴定,共检出A,B, c3组,其中c组在s4OSp左右出现2条带,而且都 比较清楚,没有发现其它2组,A组在各组均占主导 地位,各年龄组A组白色念珠菌的比例分别是,A1 100%,A282.61%,A392.32%,A491.30%,A5 81.82%(表2),PCR电泳结果见图2.没有发现同一 样本中存在2组以上(含2组). 表2不同年龄阶段人群口腔中自色念珠菌的基因分组 的分布情况 Table2.Thedist|曲IIti0n0fQ?蕊出窘e咖锄p蠹c 奠曲四mlinoralcavities0fdifferentgroups Diffeff~ttC.口堡! groupsisolatesABC TheremiItindicate:(Fishe~test)thevarietyofo0蜘p(1sil[1gratiosofCan— d/daa~iams8moty#csubgroupAofdiffeceatgToupshasnostatisticaln坦n— ins(P=0.749) 讨论 研究病理状态下白色念珠菌的分布,首先应该 了解其在正常状态下的情况,而且其作为口腔正常 微生物群的组成,在维持口腔生态平衡上,也有其重 要的作用?.目前对正常口腔中念珠菌群分布的研 bpMarker123456 图2白色念珠菌的不同基因分组P(电泳结果 ng2.Differeatm啊剐由呷atCa~ida Croup1and2:~otypicsubgroupB-P(productisabouts4obp; 3:ATCC90038~otypicsubgroupA-P(productisabout4aobp; 4:genotypic?A-P(productisabout4aobp;5and6: ~otypicsubgroupC-P(productsisabout480bpm脚;: DNAm:l【DI2000(TAKARAns]i~) 究比较少,研究结果也有比较大的差别.有人发现, 新生儿时期口腔中的念珠菌检出率只有5.9%,新生 儿1周出院时的检出率是14.2%,在1个月左右的 婴儿,检出率可以达到1个高峰(84%)H】,然后检出 率出现下降趋势,1岁的时侯大约是50%.英国对 学龄儿童口腔中念珠菌的研究,其检出率大约是 70%【8】.Kleinegger[的研究提示,0.51.5岁儿童 的检出率是44%,5—7岁儿童则是24%,15—18岁 年龄组的检出率是4o%.造成这种差别的原因,包 括取样人群的不同,地区差别和取样部位,取样方法 和检出方法的差别.在预实验中我们研究了不同的 口腔取样部位,不同的培养鉴定方法,对口腔白色念 珠菌检出率的影响,研究表明,用标准棉拭子取样并 结合离心浓缩,接种在念珠菌的鉴定培养基 CHROMagarCandida中,培养鉴定同时完成的方法是 简单有效的方法.本研究发现,白色念珠菌的检出 率,不同年龄的儿童差异有非常显着性.主要是因 为新生儿组很低,与已有的研究结果相似.从乳牙 列儿童开始,检出率有下降的趋势,而在健康青年 组,检出率只有27.5%,这个检出率与A2(乳牙列儿 童)差异有显着性,但是整个念珠菌群的检出率并没 有下降,因为随着年龄的增大,其它种类的念珠菌开 始增多,所研究的4个年龄段的儿童口腔中,白色念 珠菌都占据主导地位,而到了成人组,其它念珠菌明 显增多,白色念珠菌的构成比已经下降到35.38%, 与4个儿童组差异有显着性.Kleinegge(在其研究 的3045岁和大于60岁的两组中,白色念珠菌仍占 主要地位,这种差别可能是地域不同造成的,或有可 能随着年龄的增大,口腔环境又发生了新的变化,比 中华微生物学和免疫学杂志20O3年9月第23卷第9期ChinJMicrobiollmmunol 如各种义齿的出现,白色念珠菌的检出率又重新出 现了上升,对此尚待进一步研究. 研究证明了CHROMagarCandida鉴定培养基对 鉴定白色念珠菌的有效性【9】,但是因为对白色念珠 菌进行基因分组采用的方法,其它种类的念珠菌比 如热带念珠菌的扩增结果与白色念珠菌A组相 同【6】,必须对鉴定出的白色念珠菌进行进一步确认, 因此我们使用了一对引物,用PCR的方法进行确认, 结果表明,鉴定培养基和PCR的结果复合率是 100%,同时也证明了这种鉴定培养基的准确性. 对白色念珠菌进行基因分组,是从基因水平研 究白色念珠菌的重要手段,方法也比较多,但是一般 操作比较复杂,在分子流行病学研究中,难以发现有 规律性的分布特征,本研究使用的基因分组方法,是 针对白色念珠菌的25SrDNA中的一段可转移的内 含子序列设计的一对引物,可以将白色念珠菌分为5 组,A组的扩增产物在480bp,B组840bp,C组则2条 产物都有,有人认为C组可能是A组和B组通过某 种有性繁殖方式产生的,或是两组的过渡型,但是目 前还没有白色念珠菌存在有性繁殖的证据,所以还 没有定论.我们检出的C组有明显的3条扩增产 物,而且特异性都很强,和Micheal【6的研究略有差 别,说明该内含子有一定的多态性.B组和文献报 道的一致,扩增产物在840bp.D组常见于艾滋病病 人口腔中,并且有比较强的耐药性,现在有人提出将 这组白色念珠菌单独分开,即最近研究较多的都柏 林念珠菌. 从我们的研究结果可以发现,A组的白色念珠 菌是普遍存在于儿童口腔中并且占主导地位的白色 念珠菌,随着对不同基因分组菌株的致病等特征的 进一步研究,这种比较简单易行的方法为我们检测 白色念珠菌的流行情况,更好的控制各种念珠菌感 染性疾病,以及研究正常口腔中白色念珠菌的定植 和演替提供了有力的工具. 参考文献 1CannonRD.ChaffmWL.OralcolonizatiQnbyC?池a/bb:w:s.Grit RevOralBiolMed,1999,10:359-383. 2KleineggerCL,LockhardSR,VargasK,da1.Frequency,intensity, species.andstrains0foralCaa&k/avaryasafunctiQn0fhostage.JClin Microbiol,1996,30:2246-2254. 3HolmesAR,McnabR,JmkinsmHF.Cand/daa/b/tambindingtothe oralbacterium&??go,ao,~involvesmultipleMhesin-recq伽r. Interactiev.sInfectiQnandI,,,-~mity,1996,64:468O4685. 4郝世雄,王亚丽.ClmOms~Gandida鉴定培养基分离鉴定口腔白 色念珠菌.genotypicCand/daa/b/canssubgroupsandcomp~- withQI矗’6fandQIn出std/ato~ea.JClinMicrobiol, 1999,37:417421. 7RussellC,L町KM.Natmalhistory0fCand~daflpecie8andyeastsinthe oralcavitiesofinfants.ArchOralBiol,1973,l8:957-962. 8MartinMV.WilkinsonGR.Theoralyeasttlora0f10-year-oldschoolchil- drm.Sabammdia,1983,21:129-135. 9HouangEl”,ChuKC,Koehl~-AP,eta1.Useofc,mo candidafor talspecimensinthedi哪枷claboratory.JClinPathol,1997,50: 563-565. (收稿日期:2003-ol-2s)