动物体细胞克隆技术的研究进展

黑龙江动物繁殖 第 l4卷 第 l期 2006年 l7 动物体细胞克隆技术的研究进展 李光华，叶绍辉 (云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201) 摘 要：本文就体细胞克隆技术的研究现状、体细胞核移植过程中的核质互作、该技术目前存在的问题 及其在制作转基因动物上的应用等方面，概述了体细胞克隆技术的研究进展。 关键词：体细胞克隆；体细胞核移植；细胞周期；转基因动物；基因组重编程 中图分类号：S 814 文献标识码：B 文章编号：1005—2739(2006)01—0017—04 克隆(cloning)是 英语 关于好奇心的名言警句英语高中英语词汇下载高中英语词汇 下载英语衡水体下载小学英语关于形容词和副词的题 “clone”音译，来源于希腊语 “klon”[1I，原意是扦插枝条，即无性繁殖。动物克隆指不 通过精子和卵子受精过程而获得与亲本具有相同遗传 物质后代的过程。动物克隆包括孤雌生殖、卵裂球分离 与培养、胚胎分割和细胞核移植等。目前，生产哺乳动 物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。所 谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动 物的细胞核，经显微手术和细胞融合方法移植到去核 卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。细 胞核移植技术，特别是细胞核连续移植技术可以产生 无限个遗传相同的个体。由于细胞核移植是产生克隆 动物的有效方法，所以在一般情况下人们往往把它称 为动物克隆技术。过去人们认为，细胞的分化程度越 高，它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低，高度 分化的高等成年动物体细胞甚至完全不具备这种基因 组全能性。但是，1997年2月罗斯林(Roshilin)研究所 的伊恩-维尔穆特(I．Wilmut)等 宣布世界首例体细胞 克隆绵羊“多莉”(Dolly)诞生一 这一突破性进展打破 了这一观念。 1 Dolly后的体细胞核移植研究的重要成果 1．1 同种属内的体细胞核移植 1997年7月，罗斯林研究所和PPL公司f4I宣布用 基因改造过的胎儿成纤维细胞克隆出世界上第 l头带 有人类基因的转基因绵羊“波莉”(Polly)。显示了克隆 技术在培育转基因动物方面的巨大应用价值。1998年 7月，美国T．Wakayama等I I用小鼠卵丘细胞作核供体， 克隆出小鼠，而后又成功地用克隆出的小鼠卵丘细胞 作核供体，从中克隆出第 2代小鼠。他们克隆小鼠的技 术与克隆Dolly的技术不同，相对简单且成功率较高 — — 称为 “檀香山技术”。此后，美国、法国、荷兰、日本 和韩国等国科学家也相继报道了体细胞克隆牛成功的 消息。至 1999年底，全世界已有6种类型细胞(胎儿成 纤维细胞、乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管／子宫上皮细 收稿日期：2005一O8—31 作者简介：李光华(1978一)，男，在读硕士。 通讯作者：叶绍辉，男，硕士生导师，教授。 胞、肌肉细胞和耳部皮肤细胞)的体细胞克隆牛诞生。 2000年6月 l6日，张涌等从成年羊的耳朵取下皮肤 细胞培育出的世界首例成年体细胞克隆山羊“元元”。 1999年 12月到今年 1月，张涌教授领导的课题组在 一 只成年青山羊的耳朵上采集了体细胞，经过体外传 代培养，选出5至 1O代的体细胞，用于组装克隆胚；同 时，他们将从屠宰场采集的山羊卵母细胞在体外培养 成熟，在组装过程中，去掉卵母细胞的细胞核，再把青 山羊体细胞核注入去核的卵母细胞中。经过体外培养， 将发育到8细胞胚和囊胚移植给受体山羊。经过5个 月的孕育，顺利产下“元元”。另一只妊娠受体羊“阳阳” 将于6月底前诞生。据专家介绍，培育“元元”所采用 的克隆技术与英国体细胞克隆绵羊，所采用的克隆技 术与克隆“多莉”的技术羊“多利”的技术完全不同。已 系统化为具有自主知识产权的一整套动物体细胞克隆 技术。 1．2 不同种属问的体细胞核移植 1998年 1月，美国威斯康星一麦迪逊大学的科学 家们以牛的卵子为受体，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕 猴5种哺乳动物的胚胎， 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明某个物种的未受精卵可 以同取自多种动物的成熟细胞核相结合。虽然这些胚 胎都流产了，但它对异种克隆的可能性作了有益的尝 试。1999年，美国科学家用牛卵子克隆出珍稀动物盘 羊的胚胎。1999年，陈大元等将大熊猫的体细胞植入 去核的兔卵细胞中，培育出了大熊猫的早期胚胎。2001 年，Loi等将欧洲盘羊的颗粒细胞移植到去核的绵羊卵 母细胞中也克隆出欧洲盘羊。．这些成果 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 克隆技术 有可能成为保护和拯救濒危动物的一条新途径。 1-3 体细胞核移植与转基因动物 用体细胞核移植法制作转基因动物效率高。这是 因为用作核供体的细胞是确证整合了某一外源结构基 因的细胞，一旦核移植成功，就意味着得到了转基因动 物。 前面已经提到，Wilmut等 通过体细胞核移植克隆 出世界上第一头带有人类基因的转基因绵羊 “波莉”。 他们用整合了人凝亦因子Ix和新霉素抗性基因的胎 维普资讯 http://www.cqvip.com 1 8 Heilongjiang Journal of Animal Reproduction Vo1．14 No．1 2006 儿成纤维细胞作核供体，这样“波莉”成年后就可能在 乳汁中大量表达昂贵的凝血因子IX。此外，Cibelli等同 也把胎儿成纤维细胞作供体，经核移植制作了3头含 有外源标记基因(B一半乳糖苷酶基因)的犊牛。1999 年，美国科学家首次利用体细胞克隆技术生产出了人 类历史上第 1头转基因克隆牛，2002年新西兰与澳大 利亚科学家合作也获得了转基因体细胞克隆牛。2003 年，李宁等培育了1O头体细胞克隆牛。其中包括两头 转基因体细胞克隆牛“乐娃”和“岩娃”。“乐娃”转入了 绿色荧光蛋白基因，标志着我国在转基因体细胞克隆 的新突破。“岩娃”创造了两个世界首次：首次获得了转 有人岩藻糖转移酶基因的转基因体细胞克隆牛；首次 获得了在同一头牛中转有3种外源基因 (绿色荧光蛋 白基因、人岩藻糖转移酶基因和新霉素抗性基因)的转 基因体细胞克隆牛。 2 供体核在细胞周期中的位置及供体核与受体去核 卵母细胞的协调 胚胎发育过程是核质之间、细胞与细胞及细胞与 胞外基质按严格的时空秩序相互作用的结果。从全能 或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞，完 全取决于基因在时间与空间上的选择性表达。对细胞 分化和发育来说，最重要的不是个别基因的表达，而是 整个基因网络在时间和空间上的紧密联系和配合171。 罗斯林研究所的研究结果表明，处于第 2次减数 分裂(MⅡ)中期的卵母细胞质中含有大量的成熟／有丝 分裂／减数分裂促进因子(MPF)，这些因子可诱导供体 核物质发生一系列形态学的变化，包括核膜破裂 (NEBD)、早熟染色体凝集(Pcc)。当供体核处于s期时， 受体卵母细胞质中高水平的MPF使染色体出现异常的 概率显著升高，而当供体核处于G 或 G：期时，虽然供 体核同样会出现PCC现象，但对染色体没有损害【81。因 此，Cambell等171提出两条协调供体核和去核卵母细胞 的途径：其一，选取处于 Cn或c 期的细胞作核供体； 其二，选取MPF水平低时的卵母细胞作受体。现在看 来。前者的可行性较大，这是因为去核时多选择处于M Ⅱ期的卵母细胞，这时期的卵母细胞极体易于观察，染 色体位于极体附近，便于去核。Wilmut等圆率先在世界 上获得体细胞克隆羊，与其 Cn期细胞的成功捕获有 关。他们采用血清饥饿法，即先将乳腺上皮细胞在含 10％的胎牛m清(FCS)的培养基中培养，然后转入胎牛 血清含量仅为O．5％的培养基中连续培养5 d，从而使 培养细胞暂时性地退出增殖周期(即G。期)。从细胞遗 传学的角度看，发生在 G。期和G 期细胞中的变化很 相似，都主要是 RNA和蛋白质的合成。不同的是G 期 细胞当其 RNA和蛋白质的合成越过限制点后细胞就 由G．期过渡到s期，而 期细胞只有在特殊条件下才 能重新进入增殖周期进行分裂和分化。目前认为钙调素 及P 种抗癌基因)与G。期细胞的启动增殖有关同。T． Wakayma等『51克隆小鼠采用的供体细胞所处的状态也 是 G 或 G．期。获取 G0或G 期细胞的方法主要有两 种：其一是人工捕获法，即通过限制细胞培养基中的某 种成分，从而使大部分细胞滞留在细胞周期的某一阶 段，Wilmut等就是通过该种方法获取 期细胞的；其 二是选择细胞类型来获得，对于不同类型的细胞，其在 细胞周期的不同阶段上的细胞数目相差很大，如刚排 出的卵母细胞其周围的卵丘细胞 90％以上处于 G0期 或G 期。Wakayama等【51就是通过该方法获得处于 Gn 或G．期的供体核的。 3 目前存在的问题 3．1 克隆效率一般仅为 1％一6％而且存活率低 表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿 体重较重及产生后对环境的适应性较差，尤其是以成 体细胞核作核供体问题更为严重。 3．2 部分个体表现出生理或免疫缺陷 以克隆牛为例，大部分克隆牛已先后死去。解剖表 明，因部分犊牛胎盘功能不完善，其血液中含氧量及生长 因子的浓度都低于正常水平f5l。其中一头克隆牛看起来很 健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急 剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸 腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育 01。 3_3 基础理论研究有待加强 1998年，Shiels等⋯发现“多莉”的染色体端粒比正 常的要短，即其细胞处于更衰老的状态。当时认为，这 可能是用成年绵羊的细胞克隆“多莉”造成的，使其细 胞具有成年细胞的印记，但美国罗伯特·兰扎等用培养 的衰老细胞克隆牛，得到6头小牛，出生5～lO个月后 发现这些克隆牛的端粒比普通同龄小牛要长，有的甚 至比普通新生小牛的端粒还长。因此，染色体端粒变短 是否与提供供体核的动物的年龄有关尚未取得一致的 观点。 基因组重新编程的机制尚不清楚[t2A31。人们虽然观 测到核移植后细胞核的激活与早期胚胎原核发育类 似，但较详细的信息仍不太清楚。 细胞质遗传问题。供体细胞线粒体DNA和卵子细胞 质中的遗传物质对克隆后代的影响有待于进一步研究。 动物克隆种属及细胞差异的原因。克隆不同种属 的动物难易有别，其中的原因目前人们还不清楚。目前 可以用作体细胞核移植核供体的细胞类型还较少。 Wakayama等用处于 GdG．期的卵丘细胞克隆得到小 鼠，而他们采用处于 G。期的足细胞 、神经细胞作核供 维普资讯 http://www.cqvip.com 黑龙江动物繁殖 第 14卷 第 1期 2006年 19 体进行的克隆实验均未获得成活个体，这说明供体核 处于Gn期并非保证胚胎发育的充分条件。Dominko等 发现去核的牛卵细胞能使来自羊、猴、鼠、猪等不同种 属的细胞核激活，并在体外发育为相应的胚胎，但目前 还没有一个可继续发育为完整的动物个体。 3．4 动物克隆技术条件的优化还没有解决 如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚 胎的激活方式、是否需要作连续核移植等。导致动物 克隆存活率低和异常发育的原因很多。动物克隆技术 的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学 等相关基础学科的进一步研究和发展。 4 体细胞核移植技术的应用前景与展望 4．1 生产转基因动物应用于医药领域 利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子Ix的转 基因羊，可能在乳汁中大量表达昂贵的凝血因子Ix。 Schnicke等141(1997)发现，利用体细胞克隆生产的转基 因羊比Hammer等(1985)建立的原核显微注射法有效 得多。其中，两者最显著的差异是体细胞克隆中的受体 母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法仅仅能使 大约5％的动物携带外源基因。这是由于原核微注射 法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检 测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。 用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有 较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物 的性别只有等到动物出生后才能得知，而核移植可以 通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性 别，可选择性地制备雌性的转基因动物，有利于在母乳 中表达外源基因。 另一个例子是，李宁等(2003)培育的转基因体细 胞克隆牛“乐娃”和“岩娃”。“乐娃”转入了绿色荧光蛋 白基因。“岩娃”携带人岩藻糖转移酶基因。岩藻糖转移 酶是人体内催化形成血糖抗原的一种酶。这种酶催化 形成的抗原物质可特异调节幽门螺旋杆菌与人胃上皮 细胞结合。而幽门螺旋杆菌正是慢性浅表萎缩性胃炎、 消化性溃疡、胃增生性息肉、胃癌等重要致病菌，被世 界卫生组织列为一类致癌病原。据世界卫生组织公布， 世界人口的50％一80％均感染了幽门螺旋杆菌，在中 国，感染率达到70％。由于岩藻糖抗原仅仅存在于人 类和灵长类的动物体内，我们通过转基因克隆方法将 人岩藻糖转移酶基因转入牛基因组内，使其在牛奶中 表达产生岩藻糖抗原。转基因牛奶可以作为一种口服 药物达到治疗或预防胃病的目的。这对全球性胃病的 预防和治疗方面将会有重要意义 克隆技术除了生产人体医用蛋白外，对人类的细 胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者 本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏 症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织具 有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产 生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感 话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。考虑到伦 理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作 异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。 克隆技术还可用于肿瘤和癌细胞基因的研究㈣。 利用核移植技术可以将肿瘤或癌细胞核移植到胚胎细 胞或卵母细胞内，进而研究重组胚胎的发育情况基因 调控规律，以便为肿瘤和癌症的治疗提供依据。一旦找 到控制肿瘤细胞或癌细胞和活动的“机关”，就可为解 决肿瘤细胞发生的重大理论问题提供依据，也可为胚 胎的大量克隆提供核的来源。 4．2 有利于加速动物育种的进程 利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物， 可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生 育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效 率。此外，动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛 的关注。 总之，不管人们对克隆持何种态度，这项技术由于 其自身的价值吸引了越来越多的科学家加入克隆研究 行列。 参考文献： Il l AE．Schnicke，JM ．Alexander，AR．Willianm，et a1．Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfeeted fetal fibroblasts．Science，1997，278：2130—2133． 【2] T．Wakayama，et a1．Full-term development of mice from nucleated oocyte injected with cumulus cell nuclei．Nature， 1 998．394：369—374． 【3】 J,B．Cibelli．，et a1．Cloned transgenic calves produced from Non-quiescent fetal fibroblasts．Science，1 998，280：1 256～ 1258． [41 KHS Campbell，et a1．Nuclear—cytoplasmic interactions during the first cell cycle of uuclear transfer reconstructed bovine embuos： implications for de0xyrib0nucleic acid replication and development．Biology of Reproduction，1993，49：933-942． 【5】 KHS Campbell，et a1．Improved development to blastocyst of ovine nuclear transfer emb~os reconstructed during the presumptive g—phase of enucleated activated oocytes．Biology of Reproduction，1994，50：1385—1393． t61 E Pennis．After dolly，a 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