黄绿青霉素对心脏毒性损伤作用

黄绿青霉素对心脏毒性损伤作用         &nb sp;         作者:刘密凤～王丽华～林林～姚洪菊～张芳鸣～王文革～杨建伯 【摘要】  目的 观察黄绿青霉素(CIT)对离体心肌细胞及大鼠心肌组织结构和功能的损伤。方法 电镜检查法观察黄绿青霉素致离体心肌细胞超微结构的改变～并对15mg,(kg〃d)CIT喂饲8周的大鼠心肌组织进行病理学观察。结果 光镜下CIT处理组大鼠心肌发生变性和坏死～病变呈灶状或条索状分布～有炎性细胞浸润～肌原纤维凝集崩解～部分心肌细胞颗粒变或空泡变性。电镜下～2 5μmol/L CIT组～细胞形状不规则～染色质边集～肌丝明显～胞质内存在脂滴颗粒～线粒体嵴清晰～部分线粒体空泡变性,25μmol/L CIT可使完整的肌细胞结构消失,随剂量增加～毒性作用增强。结论 CIT在体内和体外均可引发心肌的变性和坏死。 【关键词】  黄绿青霉素 黄绿青霉素(CIT)是黄绿青霉的次级毒性代谢物～能在较低的温度和较高的湿度下生长〔1〕～自然界中广泛存在～ 容易污染新收获的农作物～呈黄绿色霉变～食用后可发生急性中毒～是一种与人类生活密切相关的真菌毒素。现已 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 ～该毒素具有神经毒作用〔2〕及致畸性〔3〕。也有研究认为～其可能是克山病的病因〔4〕。该毒素在体外能抑制人类免疫缺陷病毒-1,HIV-1,活性及白色念球菌生长〔5〕。本文旨在从体内和体外水平观察黄绿青霉素的心脏毒性作用。 1  材料与方法 1 1  仪器和试剂  Olympus光学显微镜和倒臵显微镜:CO2恒温培养箱,超速低温离心机,净化工作台,Millipore超纯水系统,spc-10Avp液相色谱仪(日本岛津公司),Uv-VIS检测器,数据采集和处理使用的色谱工作站,凯氏振荡器,手术器械及细胞培养瓶等。黄暗青霉菌(Penicillium citreonigrum Dierckx,PCV)(中科院微生物研究所),CIT 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品和胶原酶?(美国Sigma公司),最低必需培养基(MEM)和胎牛血清(美国GIBCO公司),胰蛋白酶(美国AMRESCO公司),其余试剂均为国产分析纯。 1 2  实验动物  雌性Wistar大鼠～体重80，120g(哈尔滨市兽医研究所),观察和检疫1周。出生1，3d Wistar乳鼠(哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物 中心)。 1 3  心肌细胞原代培养  新生Wistar乳鼠～无菌取心肌～清洗并剪碎～0 1,胰蛋白酶消化5min后弃去～加入10ml 1mg,ml的胶原酶?～37?下消化30，40min～500r,min离心5min～含20,胎牛血清的基础培养液制成细胞悬液～37?～5,CO2温箱内培养。根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同～采用差速贴壁分离法～并在前3d的培养液中加入0 1mmol/L  5-溴脱氧核苷酸～以抑制成纤维细胞的增殖。 1 4  黄绿青霉素致离体心肌细胞损伤的电镜观察  CIT连续倍比稀释成25～2 5μmol/L剂量组～按常量分别加入已基本长成单层的心肌细胞中～同时设立正常细胞对照组。24h后将细胞刮下～2 5,戊二醛固定～常规电镜检查。 1 5  黄绿青霉素致大鼠心肌组织的毒性观察  黄绿青霉素的生物合成〔1〕～并利用高效液相色谱法进行检测〔6〕。Wistar大鼠随机分为2组～每组7只～分笼喂养。A组作为正常对照组～饲以普通饲料,B组给予15mg,(kg〃d)CIT～并随体重增加而增加。8周后处死动物～剪 取心肌组织～10,甲醛固定～常规病理学检测。 2  结果 2 1  CIT对心肌细胞超微结构的影响  培养的心肌细胞～体积较大～表面光滑～胞质内有肌丝散在分布～Z线清晰～质膜下游离核蛋白体丰富～线粒体发达～嵴明显可见。2 5μmol/L剂量组～肌细胞为不规则形～细胞核内高密度的染色质边集核膜下～核周Z线结构清晰～肌丝明显～胞质内存在脂滴颗粒～线粒体嵴清晰～相邻细胞以脂膜紧贴～未见连接结构～部分线粒体出现空泡变性。25μmol/L剂量组～未见完整的肌细胞结构～疑为肌细胞的胞质内有大量的脂滴颗粒存在～细胞功能状态不佳～其他肌细胞轮廓不清～胞质内线粒体高密度团块状～嵴微细结构不明显～见图1，3。 图1  电镜下正常培养心肌细胞,略, 图2  电镜下2 5μmol/L CIT处理的心肌细胞,略, 图3  电镜下25μmol/L CIT处理的心肌细胞 ,略, 2 2  黄绿青霉素对实验动物体重及脏体比值的影响  实验开始时～实验组与对照组体重比较～差异无统计学意义(P,0 05)。给予CIT后～实验组体重无明显增加～对照组体重增长明显(P<0 01)。实验组大鼠的心、肝、肾脏与体重的比值均高于对照组～差异有统计学意义(P<0 01)。 2 3  黄绿青霉素对大鼠心肌组织结构的影响  光镜下～对照组心肌纤维排列规整～无明显异常。实验组大鼠心室肌均出现明显病变～病变呈灶状或条索状分布～涉及范围较大～有大量淋巴细胞和单核细胞浸润～间质水肿～心肌细胞呈颗粒变性～肌浆凝聚～肌原纤维凝集、崩解～部分心肌细胞空泡变性～见图4～5。 图4  CIT处理组心室肌病变(HE染色～×40),略, 图5  CIT处理组心室肌(HE染色～×200),略, 3  讨论 黄绿青霉素是黄绿青霉、黄暗青霉、瘿青霉、垫状青霉、毒青霉等青霉菌的次级毒性代谢物～由α-吡喃酮色基、多烯部分和氢呋喃环3部分组成〔1〕～其中吡喃酮-多烯结构中的共轭多烯系统是与三磷酸腺苷酶,ATP,结合的重要组分～可与线粒体ATP酶β亚基相结合～使其活性受抑～己证实CIT是线粒体可溶性ATP酶的强效抑制剂～可抑制牛心肌和大鼠肝脏线粒体中～ADP刺激的呼吸作用,ATP驱动的氧化辅酶?还原琥珀酸盐,及牛心肌线粒体亚单位中～ATP驱动的辅酶?转氢酶和ATP酶活性〔7〕。CIT可能通过对线粒体的损伤而对多器官、多系统产生毒性作用～其主要靶器官为呼吸系统和循环系统～可引起实验动物鼠、猫、狗、和蛙等进行性麻痹～全身僵直～低温～呼吸困难～直至死亡。本研究显示～CIT可致大鼠心肌发生变性和坏死～呈灶状散在分布～涉及面较大～有炎性细胞浸润～心肌细 1胞呈空泡样变～间质水肿～横纹消失。应属于吞噬阶段的较早病变～与本实验的急性期特点相符合～表明病变尚处于发展中。 【参考文献】   〔1〕 Ueno Y.Citreviridin from penicillium citreo-viride Biourge,Mycotoxins,M,.Amsterdam Oxford New York: Elsevier Scientific Publishing Company,1974:291-300. 〔2〕 Ueno Y,Ueno I.Isolation and acute toxicity of citreoviridin,a neurotoxic mycotoxin of penicillium citreo-viride Biourge,J,.Japan J Exp Med,1972,42 (2): 91-105. 〔3〕 Morrissey RE,Vesonder RF.Teratogenic potential of the mycotoxin,citreoviridin,in rats,J,.Food Chem Toxicol,1986,24 (12): 1315-1320. 〔4〕 杨建伯～杨秋慧.克山病病因研究,J,.中国 地方病学杂志～2002～19(5):350-355. 〔5〕 Vieta ?,Savarino A,Papa G,et al.In vitro inhibitory activity of citreoviridin against H1V-1 and an HIV-associated opportunist: Candida albicans,J,.J Chemother,1996,8 (5): 351-357. 〔6〕 Robert DS,Judith IG,Odette LS.Liquid chromatographic method for determination citreoviridin in corn and rice,J,.J Assoc of Anal Chem,1988,71(4):721-724. 〔7〕 Linnett PE,Mitchell AD,Osselton MD,et.al.Citreoviridin,a specific inhibitor of the mitochondrial adenosine triphosphatase,J,.Biochem J,1978,170:503-510.