免疫原和抗血清制备技术

null免疫原和抗血清制备技术免疫原和抗血清制备技术第一节 免疫原的制备 第二节 免疫血清的制备 第三节 抗体的纯化和鉴定 第一节 免疫原的制备 第一节 免疫原的制备一、细胞性抗原的制备 二、可溶性抗原制备及鉴定 三、半抗原免疫原的制备 四、佐剂 绵羊红细胞的制备 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 图 绵羊红细胞的制备流程图 摇动 15-20min 4℃可保存3周 取适量 NS洗涤3次 2000r/min 10minNS稀释至 2～5% 细菌细胞抗原的制备流程图 细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或 斜面培养 37℃24h100℃水浴 2～2.5h 杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原返回 二、可溶性抗原制备及鉴定来源: 组织和细胞，其成分比较复杂。 1.组织和细胞成分混合抗原制备 2.蛋白质抗原制备 3.核酸抗原制备 4.类脂多糖抗原制备 5.免疫球蛋白片段制备 6.纯化抗原的鉴定 二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸返回 组织和细胞成分混合抗原制备程序 组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液 澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹 及污物NS内含0.5g／L NaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片 及微小组织离心 细胞破碎技术及评价 细胞破碎技术及评价1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4. 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面活性剂处理 1.酶处理法 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 1.酶处理法 方法：在一定的条件下，能消化细菌和 组织细胞。 特点：①此法适用多种微生物； ②具有作用条件温和； 　　　 ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。 2.冻融法 2.冻融法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。完 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然 后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织 细胞及细胞内的颗粒可被融破。 特点：此法适用于组织细胞，对微生物细 胞作用较差。 3.超声破碎法 3.超声破碎法原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 由于超声波发生空化作用（cavitation）使得 液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz～20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。特点：①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于微生物和组织细胞的破碎。 4.表面活性剂处理 4.表面活性剂处理 原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。 常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。 应用：①破碎细菌，且作用比较温和； ②提取核酸时，常用此法破碎细胞。 蛋白质抗原制备 蛋白质抗原制备 蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高 的抗血清通常需要纯化。可采用： 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5.亲合层析法 1．超速离心法 1．超速离心法 原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同， 使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度 的梯度层内，达到彼此分离的目的。 特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。 应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白A、B等。 2、选择性沉淀法 2、选择性沉淀法 原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。 常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用33～50％饱和度的硫酸胺。 特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。 应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。 3．凝胶层析法（凝胶过滤法） 3．凝胶层析法（凝胶过滤法）原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。 4．离子交换层析法 4．离子交换层析法 原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。 5．亲和层析法（亲和色谱） 5．亲和层析法（亲和色谱）原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。 亲和层析法示意图正常细胞 ＋标记细胞 洗滴标记细胞 被酶裂解加入特异 性抗体其它蛋白 洗涤流失SDS-PAGE 分离蛋白 亲和层析法示意图 核酸抗原制备 核酸抗原制备大分子的核酸具有免疫原性。 提取核酸的主要步骤：破碎细胞核酸从细胞中游离出来酸沉淀核除去蛋白质乙醇酚和氯仿 类脂多糖抗原制备 类脂多糖抗原制备苯酚法提取LPS：干燥菌体或湿菌体水中 混匀激烈搅匀 加热5min冰水 急冷降至10℃以下离心上层的水层(含LPS) 下层的酚层 菌体残渣于底部吸取 水层透析 除酚加热超速离心浓缩LPS 在上层沉淀的透明胶状部内绞出悬于水中离心得纯化LPS同温的苯酚 免疫球蛋白片段制备 免疫球蛋白片段制备1．酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。2．氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。3. 还可用强变性剂或利用改变pH将免疫球蛋 白亚单位分开。 酶水解免疫球蛋白示意图 酶水解免疫球蛋白示意图Fc段，用以制备抗重链血清F(ab’)2，常作为抗体试剂用于试验木瓜蛋白酶 （papain)胰蛋白酶 (pepsin)胃蛋白酶 (pepsin) 氧化法和还原法评价1. 氧化法：优点是切开后，肽链不能重新 形成二硫键、便于肽链纯化； 缺点是色氨酸侧链容易被破坏。 氧化法和还原法评价返回2. 还原法：将二硫键还原成琉基。但极不 稳定，易重新形成二硫键，必须及时用 碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化。 纯化抗原的鉴定 纯化抗原的鉴定1.含量鉴定 2.理化性质鉴定 ①凝胶层析技术测定 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③凝胶管状电泳 ④超速离心 3.纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳 4.免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验 1．含量鉴定蓝色 1．含量鉴定在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关。方法：酚试剂法鉴定 主要试剂：磷钼酸-钨酸的混合酸 原理：蛋白质中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能钨酸、钼酸还原3H2OP205·13WO3·5MoO3·10H20 和3H2P205·14WO3·4MoO3·10H20络合物的双缩脲法蛋白质＋Ca2+碱性加深蓝色 2.理化性质鉴定已知分子量的标准品 测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。凝胶柱保留体积分子量的对数 2.理化性质鉴定绘制标准曲线①凝胶层析技术进行测定 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）垂直电泳聚合成大分子凝胶 ②聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 有分子筛效应、电荷效应及浓缩效应，能精 确地分离和鉴定高分子物质。 PAG的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量。 原理： 双丙烯酰胺 N,N-methylene bisacrylamide,Bis 丙烯酰胺 (acrylamide,Acr)催化剂 3. 纯度鉴定 3. 纯度鉴定 方法：醋酸纤维膜电泳进行鉴定。返回 原理：蛋白质在一定pH下都带有电荷，由于 各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此 所带电量也各不相同，在外加直流电场的作 用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后 即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白 质抗原的纯度。 特点：快速简便。 三、半抗原免疫原的制备 三、半抗原免疫原的制备1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、 某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物3.半抗原-载体连接方法: 载体类型 载体类型 1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)， 这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。 半抗原-载体连接方法1 半抗原-载体连接方法1碳化二亚胺法：R-NH=CH-R’半抗原＋载体蛋白质搅拌1～2h室温24h透吸除去未反应的半抗原人工免疫原混合 半抗原-载体连接方法2混合 半抗原-载体连接方法2戊二醛法:半抗原-NH2载体蛋白-NH2半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白OHC-(CH2)3-CHO*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂 半抗原-载体连接方法3 半抗原-载体连接方法3氯甲酸异丁脂法：半抗原-COOH载体蛋白-NH2Cl-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2半抗原-CO-NH-载体蛋白简便，用于类固醇抗原制备HO-CH2CH(CH3)2＋ 半抗原-载体连接方法4 半抗原-载体连接方法4琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备半抗原-CH2OHCH2-CO CH2-CO 带羧基的半抗原琥珀酸衍生物半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH返回吡啶再经氯甲酸异丁脂法或碳化 二亚胺法制备载体半抗原 四、佐剂 四、佐剂* 概念：与抗原同时或预先注射于机体，能增 加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。 条件：①增加抗原的表面积； ②改变抗原的活性基团构型； ③佐剂与抗原混合能延长抗原在局部 组织的存留时间； ④可直接或间接激活免疫活性细胞； ⑤无毒性或无副作用。 （二）常用佐剂的种类和制备 （二）常用佐剂的种类和制备1.氢氧化铝佐剂：5%硫酸铝5%氢氧化钠氢氧化铝沉淀制成悬液 即为佐剂强烈搅拌NS洗 二次NS等体积抗原免疫接种 2.明矾佐剂 2.明矾佐剂10%硫酸钾铝氢氧化钠校正pH值至6.5沉淀乳状悬液* 明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿。NS搅拌NS洗 二次离心抗原备用防腐剂 3.弗氏佐剂(Freund adjuvant)作用大于不完全佐剂 局部形成肉芽种和溃疡 不能用于人体弗氏完全佐剂 3.弗氏佐剂(Freund adjuvant)液体石蜡完全乳化备用＋高压 灭菌加热抗原弗氏不完全佐剂卡介苗羊毛脂鉴定一滴 乳剂乳剂不散浮于液面水中混合 4.佐剂应用原则和评价 4.佐剂应用原则和评价目的:①增强抗原对机体的免疫原性； ②增强抗体的产生能力； ③为制备出高效价的免疫血清； ④增强可溶性抗原的免疫原性； ⑤在某种情况下，改变Ag免疫应答类型； ⑥延长抗原在免疫动物的时间； ⑦改变抗原的分布； ⑧增强局部对变应原的超敏反情况； 应用佐剂的缺点 应用佐剂的缺点① 佐剂常混有微量其它物质，这些物质进 入体内后也可引起抗体的产主，影响抗 血清的特异性；② 注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌 性脓肿；③ 反复注射，易发生超敏反应，使局部组 织坏死，甚至引起动物死亡。 第二节 免疫血清的制备 第二节 免疫血清的制备1.免疫动物选择 2.免疫方法 3.动物采血法 4.免疫血清的分离及保存 一、免疫动物选择 一、免疫动物选择 能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。 1.抗原与免疫动物种属差异越远越好； 2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎要求； 3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫 应答； 4.按需要量选择大小不同的动物。 二、免疫方法 二、免疫方法 3.免疫方案 ①全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 ②微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月 抗原 ③混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉 1.免疫原的注射剂量 2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉＞ 腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内＞淋巴结＞足掌 三、动物采血法 三、动物采血法1.颈动脉放血法：最常用的方法 2.心脏采血法：要求操作熟练 3.静脉采血法：1.4℃保存：可保存3～6个月 2.低温保存：-20～-40℃，可保存2～3年 3.冰冻干燥保存：可保存3～5年 第三节 抗体的纯化和鉴定 第三节 抗体的纯化和鉴定1.抗体特异性的纯化 2.特异性IgG类抗体的纯化 3.特异性抗体的鉴定 一、抗体特异性的纯化 一、抗体特异性的纯化 1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。 二、特异性IgG类抗体的纯化 二、特异性IgG类抗体的纯化1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取γ球蛋白 3次，基本为IgG类抗体，但不纯。2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个A蛋白至少可以结合二个 IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等 三、特异性抗体的鉴定 三、特异性抗体的鉴定 1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定 2.抗体特异性鉴定： ①细菌类抗原的抗体用凝集试验 ②可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验 3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法 4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好 第四节 单克隆抗体技术 第四节 单克隆抗体技术单克隆抗体：由B细胞杂交瘤产生的只识别抗原 分子上一种抗原决定簇的抗体分子。多克隆抗体：识别抗原分子上各种抗原决定簇 的多种抗体的混合制剂。一、杂交瘤技术的原理及流程 二、单克隆抗体的应用返回 一、杂交瘤技术的原理及流程 一、杂交瘤技术的原理及流程 二、单克隆抗体的应用 二、单克隆抗体的应用1.医学检验试剂： ①传染病的快速诊断 ②寻找TSA及检测TAA ③免疫细胞抗原检测 ④激素测定 ⑤血中药物浓度监测 ⑥HLA分型监测2.导向治疗作用 3.抗原物质的分离和提纯