广东省仔猪腹泻大肠杆菌血清型鉴定

第 18卷第 1期 中　　国　　兽　　医　　学　　报 Vol. 18, No . 1 1 9 9 8年 1 月 Chinese　Journal　of　Veter inary　Science 　　Janu. 1 9 9 8 广东省仔猪腹泻大肠杆菌血清型鉴定 姜卫东　黄引贤　(广东省兽医防疫检疫站, 广州 510230) 摘要　从广东省 12 个猪场的 107 头腹泻仔猪的直肠和肠系膜淋巴结以及 4个猪场的 22 头母猪的泌尿生 殖器官分别分离出 118 株和 40 株大肠杆菌。分离菌的 86. 08% ( 136/ 158)对昆明系小鼠有毒力, 24. 5% ( 25/ 102)产生耐热肠毒素( ST )。经 34 种大肠杆菌单价 O 抗原血清鉴定, 134 株分离菌中有 26 种血清型, 其中 O 119、O 60、O 75、O141、O 20、O8和 O 101为优势血清型。O 119和 O 75作为猪源致病性大肠杆菌优势血清型在我国较少 报道。尚有 24 株未能定型,占分离菌株的 15. 2% ( 24/ 158)。 关键词　仔猪腹泻　大肠杆菌　优势血清型 中图分类号　S852. 53 　　大肠杆菌引起的仔猪腹泻是养猪场最常见的 疾病。该病流行面广, 终年发生,发病率与死亡率 较高。幸免于死者则生长迟滞,饲料报酬降低。近 年来, 国内外开展了预防肠毒源性大肠杆菌 ( ETEC)腹泻的各种类型疫苗研究,例如基因工 程活菌苗 [ 1～3]与多价灭活菌苗 [ 4]等。但由于大肠 杆菌血清型多, 变异大, 抗原复杂, 制苗菌株的血 清型很难与地方菌相一致, 影响了菌苗的使用效 果。为选用针对性较强的菌苗,收到较好的防治效 果,进行了本研究。 1　材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1. 1　主要培养基与试剂等　MR、V -P、Indole、 Citrate、T SI、EMB 培养基(液) , 按文献[ 5]配制; 微量生化鉴定管、麦康凯培养基(浙江省 军区后 勤部卫生所) ; M R、V-P、Indole 试剂(华南农业大 学动物医学系) ; 34种大肠杆菌 O 抗原单价血清 (中国兽药监察所) ;昆明系小鼠(广州军区后勤部 军事医学研究所, 体重 18～22 g)。 1. 2　致病性大肠杆菌的分离与鉴定 1. 2. 1　采样分离　用无菌棉拭子, 从广州( DF、 BY )、增城( ZN )、番禺( JF )、东莞( DL、BL、TS )、 惠州( HZ)、汕尾( SW)、深圳( SZ)、珠海( YF)和台 山 ( LW)等 12个猪场的腹泻仔猪采集直肠及肠 　　本文收到日期: 1996-07-16 系膜淋巴结检样, 从广州( DF * )、深圳 ( SZ* )、增 城( ZN * )和台山( LW * )等 4个猪场的淘汰母猪 (患有泌尿生殖器疾病)采集卵巢、子宫颈、子宫 体、阴道和膀胱检样, 然后接种于麦康凯平板上, 37℃培养 18～24 h。 1. 2. 2　纯化培养　从麦康凯平板上挑取单个砖 红色菌落接种于 EMB 平板上, 37℃培养 24～48 h。再挑取 EMB平板上的单个菌落接种于半固体 培养基, 37℃培养 18 h, 然后用石腊油密封保存 备用。与此同时, 取 EMB平板上的菌落涂片, 革 兰氏染色。 1. 2. 3　生化鉴定　对所分离的菌株进行 H2O2、 T SI、MR、V -P、Indo le、Citr ate、H2S、尿素、甘露 醇、麦芽糖和蔗糖等项目的鉴定。 1. 2. 4　小鼠毒力试验　以各分离菌株的 37℃ 18 h 新鲜牛肉汤培养物分别腹腔接种小鼠 2 只, 每 只 0. 2 mL(约含 2亿个 CFU) ,另取 2只同批小 鼠,腹腔注入新鲜牛肉汤 0. 2 mL, 观察小鼠死亡 数及死亡时间, 并在死亡小鼠肝中重新分离接种 菌。致死 2只小鼠为强毒力,致死 1只为低毒力, 不致死为无毒力。 1. 3　大肠杆菌耐热肠毒素( ST)测定　参照文献 [ 6]进行,采用乳鼠灌胃试验。每菌株用2只 2～3 日龄乳鼠。 1. 4　大肠杆菌 O抗原血清型鉴定　经培养特 性、形态特点及生化鉴定而确认的大肠杆菌,再进 行纯培养后, 用 0. 5% NaCl 溶液制成浓菌液, 121℃高压 2. 5 h,取 1铂耳 O 抗原单价血清进行 玻片凝集试验, 1 min凝集者判为阳性。 2　结果 2. 1　致病大肠杆菌的分离鉴定结果　腹泻仔猪 及泌尿生殖器疾患母猪检样在麦康凯平板上均长 出砖红色菌落, 在 EMB 平板上纯培养的菌落略 高起, 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面平坦或略有凹陷,菌落中央呈黑色, 带 有金属光泽。EMB平板上的菌落经镜检均为革兰 氏阴性杆菌。从107头腹泻仔猪和 22头泌尿生殖 器疾患母猪分别分离出大肠杆菌 118株和 40株。 经生化鉴定,均符合大肠杆菌的特征(表 1)。各猪 场分离菌的毒力试验结果见表 2, 其中强毒力菌 株占 67. 1% ( 106/ 158) , 低毒力菌株占 19. 0% ( 30/ 158)。 表 1　分离菌的生化特性鉴定结果 项　　目 H2O 2 T SI MR V-P In dole Cit rate 阳性菌株数 158 143 144 0 140 0 阳性率( % ) 100 90. 5 91. 1 0 88. 6 0 项　　目 H2S 尿素 甘露醇 麦芽糖 蔗糖 阳性菌株数 14 2 145 148 25 阳性率( % ) 8. 9 1. 3 91. 8 93. 7 15. 8 表 2　各猪场分离菌的小鼠毒力试验结果 猪场 菌株总数 强毒力菌株数 低毒力菌株数 无毒力菌株数 DF 16 9 4 3 DF* 19 15 1 3 TS 8 6 1 0 BY 8 4 2 2 YF 18 15 3 0 ZN 10 4 3 3 ZN * 7 5 1 1 BL 8 5 2 1 HZ 11 6 3 2 L W 7 5 1 1 LW * 7 5 0 2 SZ 13 9 4 0 SZ* 7 5 1 1 JF 6 6 0 0 DL 7 6 1 0 SW 6 1 2 3 合计 158 106 30 22 2. 2　大肠杆菌耐热肠毒素( ST)测定结果　在所 测 102株菌中有 25株产生 ST ,占 24. 5%(表 3)。 表 3　各猪场分离菌的 ST 测定结果 猪　　场 DF DF* BY ZN BL HZ YF T S JF 阳性菌株数 2 4 1 4 2 3 4 3 2 阳 性菌 所占比例 2/ 16 4/ 19 1/ 8 4/ 8 2/ 8 3/ 11 4/ 18 3/ 8 2/ 6 2. 3　大肠杆菌 O抗原血清型鉴定结果　158 株 分离菌中的 134株分属 26种血清型,优势血清型 为 O 119、O 60、O 75、O14 1、O 20、O 8和 O 101 ,这 7种血清 型的菌株占已鉴定菌株的 56. 0%。另有 24株未 能定型, 占分离菌株的 15. 2%( 24/ 158) , 详见表 4。 表 4　大肠杆菌 O 抗原血清型鉴定结果 血 清型　　 O 1 O 2 O 4 O 6 O 8 O 9 O 11 O 12 O 20 菌 株数　　 2 4 6 1 7 2 5 2 7 来源于猪场数　　 3 6 3 5 血 清型　　 O 26 O 38 O 45 O54 O 60 O 64 O 75 O 84 O 86 菌 株数　　 1 4 1 1 15 1 11 3 7 来源于猪场数　　 11 8 4 血 清型 O 89 O 101 O 115 O 119 O 138 O 141 O 147 O 149 菌 株数 6 7 5 19 2 9 1 5 来源于猪场数 4 5 3 7 5 3 3　讨论 3. 1　仔猪腹泻的病因　在 12个猪场的 76头腹 泻死亡仔猪中, 其小肠各段粘膜均见有不同程度 的充血和水肿,肠内充满黄色粘稠物和气体,以十 二指肠病变最严重。7头仔猪肠系膜淋巴结的分 离菌和 107头腹泻仔猪直肠的分离菌几乎全为大 肠杆菌, 其中有 67. 1% ( 106/ 158)对昆明系小鼠 具有强毒力, 19. 0%( 30/ 158)具有低毒力。由此认 为,致病性大肠杆菌是引起上述 12个猪场仔猪腹 泻的主要病原。 3. 2　母猪泌尿生殖器官中的致病性大肠杆菌　 本试验从母猪泌尿生殖器官中分离到的大肠杆菌 与从同一猪场仔猪分离到的大肠杆菌的血清型相 一致,并且也分离到 ET EC( 4/ 19) , 因而推测, 最 早患病仔猪有可能经过已污染的产道而被感染。 提示在防治仔猪大肠杆菌腹泻时, 除了重视猪舍 的环境卫生条件外,对母猪的卫生保健也绝不能 放松,分娩时尤应严格消毒。此外,大肠杆菌感染 可导致母猪无乳或患乳房炎、子宫炎( MMA )综 合征[ 7] ,又是引起仔猪腹泻的主要病原。所以, 控 制母猪泌尿生殖器官内的致病性大肠杆菌感染也 是防治仔猪腹泻的措施之一。 3. 3　大肠杆菌的耐热肠毒素　耐热肠毒素( ST ) 65第 1期 姜卫东等:广东省仔猪腹泻大肠杆菌血清型鉴定 是引起仔猪腹泻的主要毒素之一[ 8]。本试验检测 结果表明, 102 株被测菌中 25 株为阳性, 占 24. 5% ,与高崧[ 9]用单克隆抗体测定粘附因子阳 性率的结果( 30. 3%, 314/ 1 038)较接近, 这可能 因为肠毒素的产生与粘附因子的存在有一定的关 系, 即产生粘附因子的菌株大多数产生肠毒 素[ 10 ]。采用乳鼠灌胃法测定 ST 简便、易行,因此 可通过测定 ST 筛选ET EC菌株。在 25株ST 阳 性菌中有 21株属于 O119、O 60、O 141、O 20、O 101、O 115、 O 149, 说明这些菌株是引起广东省仔猪腹泻的主 要致病菌。 3. 4　广东省致仔猪腹泻大肠杆菌的血清型　本 试验所查的仔猪腹泻大肠杆菌共有 26种 O 抗原 血清型, 其中 7种为优势血清型。不仅广东省流行 的血清型与其他省市有较大差别[ 11～15] ,而且省内 各个猪场之间亦有所不同, 同一猪场可存在多个 血清型。由此可见,广东省仔猪腹泻的大肠杆菌血 清型十分复杂, 这与猪场不断从外地引进种猪更 新猪群,以及这些菌株的变异性和更迭性等有密 切关系。而且,各猪场不同时期流行的血清型也不 尽相同[ 16]。因此, 必须定期对猪场的大肠杆菌进 行分离鉴定, 选用针对性较强的菌苗,才能收到较 好的防治效果。E coli O 119是犊牛消化道致病菌 的主要血清型,作为仔猪的优势血清型较少报道。 此外尚有 24株未能定型,其中有 2株可产生 ST , 是否属于新流行的血清型, 尚待研究。 参　考　文　献 1　刘俊熙, 娄淑杰,张远钰等 . 预防仔猪大肠杆菌性腹 泻 MM -3 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 菌苗的免疫效果 . 中国兽医科技, 1992, ( 5) : 3 2　许崇波 . 我国预防幼畜腹泻大肠杆菌基因工程菌苗 的研究现状 . 青海畜牧兽医, 1993, 23: 33～35 3　郭　海,刘全喜 . 预防仔猪大肠杆菌性腹泻 K88 遗传 工程菌苗免疫途径和剂量的研究 . 中国兽医科技, 1992, ( 5) : 5～6 4　潘松年 . 仔猪大肠杆菌腹泻三价灭活苗的研究 . 中国 兽药杂志, 1989, ( 4) : 5～8 5　林万明译 . 医学细菌生化试验鉴定手册 . 北京: 人民 卫生出版社, 1985 6　于恩庶主编 . 中国人兽共患病学 . 福州:福建科学技 术出版社, 1988. 147～170 7　滕衍河, 蔡金冠 . 猪 MMA 综合征 . 畜牧与兽医, 1993, ( 4) : 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om 22 heads of sow suffered f rom disease of ur ogenital o rgan w er e substant iated to be dist ributed over 26 O serotypes. T he predom inant types w ere O 119, O60 , O 75 , O 141 , O 20, O 8 and O 101. The O 119 and O 75 were seldom repor ted to be predominant ser otype of pigs in our country . 25 out of 102 detected st rains pro- duced ST. 136 str ains out of 158 were v ir ulent to Kunming m ice. 　　Key words　pig let diarrhea; E coli ; predominant sero type 66 中　　国　　兽　　医　　学　　报 1998 年