兔角膜内皮细胞Na～+_K～+_ATP酶活性检测及其意义

【研究原著】 兔角膜内皮细胞N a+ 2K + 2A T P 酶活性检测及其意义 刘蓉1, 张林2, 段惠萍3 作者单位: 1. 山西大同大学医学院眼科 037008; 西安交通大学医学院眼 科硕士研究生, 导师张林; 2. 西安交通大学第一附属医院眼科; 3. 山西 省汾阳医院眼科 032200 作者简介: 刘蓉 (19732) , 女, 天津人, 主治医师, 讲师。研究方向: 眼 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 疾 病。 　　【摘要】　目的: 探讨角膜内皮细胞上N a+ 2K+ 2A T P 酶的活性。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 : 运用接膜联合组织块法获得原代及传代培养的 兔角膜内皮细胞 (RCEC s) , 使用考马斯亮蓝试剂盒及超微量A T P 酶测试盒分别测定即兴揭取组、原代7 d 组、传二代5 d 组的N a+ 2K+ 2A T P 酶活性。结果: 即兴揭取组N a+ 2K+ 2A T P 酶活性平均为 (0. 595±0. 010) U öm gp ro t、原代7 d 组及传 二代5 d 组分别为 (0. 572±0. 007) U öm gp ro t 和 (0. 333±0. 011) U öm gp ro t, 任意两两组间差异均具有统计学意义 (P < 0. 05)。结论: 原代RCEC s 更接近在体细胞。N a+ 2K+ 2A T P 酶活性定量检测, 可作为评价体外培养RCEC s 的功能指标。 【主题词】　内皮, 角膜ö细胞学; 内皮细胞ö酶学; N a (+ ) K (+ )交换A T P 酶ö生理学; 细胞, 培养的; 兔; 动物 【中图分类号】　R 772. 2　　　　【文献标识码】　A 　　　　【文章编号】　100926647 (2009) 0821774203 A ssessm en t on Activ ity of Na+ -K+ -Adenosine Tr iphospha ta se in Rabb it Cornea l Endothel ia l Cells L IU Rong, ZHAN G L in,DUAN H ui2P ing (D ep a r tm en t of Op h tha lm ology ,M ed ica l College of D a tong U n ivers ity , D a tong 037008, Ch ina ) 【Abstract】　Objective: To evaluate the act ivity of N a+ 2K+ A T Pase in rabb it co rneal endo thelia l cells (RCEC s). M ethods: Cu ltu red RCEC s w ere ob tained by a reliab le cu ltu re m ethod2tearing D escem et′s m em brane w ith co rneal endo thelia l sheet in vitro and iden tified by imm unoh istochem ical sta in ing. A ll cu ltu res w ere divided in to tw o team s: one w as p rim ary RCEC s cu ltu red fo r 7 days and ach ieving confluency, the o ther w as the 2th passage cu ltu red fo r 5 days and ach ieving confluency. T he last study group w as co rneal endo thelia l cells layer acu tely teared. N a+ 2K+ 2A T Pase act ivity of all th ree study group s w as evaluated quan tita tely. Results: T he N a+ 2K+ 2A T Pase act ivity of co rneal endo thelia l cells layer group acu tely teared w as (0. 595±0. 010) U öm gp ro t. T he act ivity of p rim ary RCEC s w as ( 0. 572±0. 007) U ö m gp ro t and that of the 2th passage w as reduced to (0. 333±0. 011) U öm g p ro t. T here w as stat ist ic sign ificance betw een them (P < 0. 05). Conclusion: T he assessm en t of N a+ 2K+ 2A T Pase act ivity can be evaluated the function of the RCEC s in vitro. P rim ary RCEC s are m uch sim ilar to the cells in vivo than the passages. 【M eSH】　Endo thelium , Co rnealöcyto logy; Endo thelia l Cellsöenzymo logy; N a (+ ) 2K (+ ) 2Exchanging A T Paseö physio logy; Cells, Cu ltu red; R abb its; A n im als 　　角膜疾患是主要的致盲原因之一, 角膜移植术是 目前复明的主要 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 , 但由于供体角膜的不足和受体 的移植排斥反应等问题限制了该技术的广泛应用。因 此, 人们将目光转向了组织工程角膜, 角膜内皮细胞的 体外培养是构建组织工程角膜的核心, 也是开展角膜 内皮细胞的药物试验与病理、生理研究的基础性工作。 但角膜移植亟需解决的关键问题之一是如何获得健康 而足量的角膜内皮细胞。据此, 本研究检测兔的培养角 膜 内 皮 细 胞 ( R abb it C rnea l Endo thelia l Cells, RCEC s)与在体角膜内皮上N a+ 2K+ 2A T P 酶活性的差 异, 借以筛选更适宜实验目的的培养细胞并试图制定 RCEC s 功能评定的新指标。 1　材料和方法 1. 1　材料来源　CO 2 培养箱 3111 购自 FORM A 公 司。倒置相差显微镜DM IRBHC 购自德国莱卡。医用 超净化工作台 SW CJ IF 购自苏州安泰空气技术公司。 R PM I1640 培养基: 购自G IBCO 公司。胎牛血清: 购自 杭州四季青生物制品公司。兔抗人神经烯醇化酶抗体 (N SE) : 购自美国S IGM A 公司。DAB 显色试剂盒购自 美国V ECTOR 公司。考马斯蓝蛋白测定试剂盒及超微 量A T P 酶测试盒: 购自南京建成生物工程研究所。细 胞培养基的制备: 每 100 m l R PM I1640 培养基中分别 加入 10 m l ConA 上清液, 10 m l 胎牛血清, 1 m l L 2谷 氨酰胺, 青霉素100 U öm l, 链霉素100 Λgöm l。 1. 2　检测方法　健康成年新西兰白兔由西安交通大 学医学院动物中心提供, 体重 1. 5～ 2. 0 kg, 耳缘静脉 空气栓塞处死后立即取出结构完整的眼球, 庆大霉素 生理盐水 (400 U öm l) 多次冲洗眼球, 置入超净工作 台。在体视解剖显微镜下, 于角膜缘内1 mm 环形剪取 4771 中国误诊学杂志2009 年3 月第9 卷第8 期　Ch in J M isdiagn,M ar 2009 V o l 9 N o. 8 角膜片, 揭取内皮细胞层, 将其切割成1 mm ×2 mm 大 小的组织块, 内皮面向下置于以0. 1% 明胶及胎牛血清 预处理的无菌培养瓶中, 放入 37 ℃ 5%CO 2 培养箱中 贴壁后加入培养液孵育。观察到RCEC s 生长接近融合 期利用胰蛋白酶消化法进行传代。将 2 代细胞利用 N SE 免疫组化ABC 法进行鉴定, 细胞浆中出现棕黄色 颗粒为阳性表达。将RCEC s 分成3 组: 原代RCEC s 培 养7 d 为原代7 d 组, 传二代RCEC s 培养5 d 为传二代 5 d 组和即兴揭取的RCEC s 为即兴揭取组。分别按照 考马斯亮蓝试剂盒及超微量A T P 酶测试盒说明书进 行A T P 酶活性检测。 1. 3　统计学处理　按照超微量A T P 酶测试盒说明书 计算N a+ 2K+ 2A T Pase 活力。采用SPSS fo r W indow s 11. 5 one2w ay ANOVA (P < 0. 05)进行统计处理。 2　结果 2. 1　RCEC s 的鉴定　使用相差倒置显微镜进行形态 观察: 培养原代RCEC s 72 h 后, 即可见RCEC s 自组织 块边缘迁出, 呈细长的多角形, 随后呈现典型的角膜内 皮细胞多角形形态, 鹅卵石样, 胞浆色淡。培养到6～ 10 d 时细胞生长最旺盛, 可见细胞间汇合 (图1)。传代后 的RCEC s 24 h 贴壁, 呈多角形或梭形。传代后第3～ 5 天为细胞生长旺盛期, 呈典型的多角形外观, 逐渐汇 合。N SE 是一种鉴定角膜内皮细胞的标志酶。RCEC s 经N SE 染色后, 可见胞浆内粗大棕色颗粒, 细胞核不 着色, 细胞边界清晰, 呈N SE 阳性表达 (图2)。综上证 实本研究中培养的细胞为RCEC s。 2. 2　兔角膜内皮细胞N a+ 2K+ 2A T Pase 活性测值　 即兴揭取组N a+ 2K+ 2A T P 酶活性平均为 (0. 595± 0. 010)U öm gp ro t, 原代 7 d 组及传二代 5 d 组分别为 ( 0. 572±0. 007) U öm gp ro t 和 (0. 333±0. 011) U ö m gp ro t, 通过对三组N a+ 2K+ 2A T Pase 活性测值进行 统计学 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 , 任意两组间差异均具有统计学意义 (P < 0. 05)。其中原代RCEC s 的酶活性最接近即兴揭取的 RCEC s。 图1　原代RCEC s 培养7 d, 细胞生长旺盛80% 汇合 (50×) 图2　传二代RCEC s 的N SE 免疫细胞化学 染色像。免疫组化染色阳性细胞 (100×) 3　讨论 角膜内皮细胞的N a+ 2K+ 2A T Pase 能主动将N a+ 移出细胞外, 将K+ 引入细胞内以维持角膜的相对脱水 状态, 它是维持角膜透明性的关键酶。研究发现, RCEC s 的N a+ 2K+ 2A T Pase 主要位于其两侧的细胞 膜, 即位于相邻部位的细胞膜上, 以及前房和 D escem en t 膜的细胞膜面[ 1 ]。Ko izum i 和V alt ink 等[ 2, 3 ] 在筛选RCEC s 系时将N a+ 2K+ 2A T P 酶的表达与否作 为指标之一。但N a+ 2K+ 2A T Pase 的活性在不同组织 中差异很大, 许多疾病的发生、发展都涉及了酶活性的 改变。于是对酶活性的研究引起了学者们的重视。Sh in 等[ 4 ]利用酶活性的测定作为筛选RCEC s 系的参数之 一。W h ikehart 等[ 5 ]对体外培养牛CEC s 的N a+ 2K+ 2 A T Pase 的检测显示: 细胞培养初期尚未建立良好的 细胞连接时,N a+ 2K+ 2A T Pase 活性较低。而A lam ino s 等[ 6 ]最新研究提出体积的变化会影响膜内外钾离子和 氯离子的流动, 细胞汇合后建立细胞连接对离子流可 能造成影响。据此, 本实验选择了培养 7d 的原代 RCEC s 和培养 5d 的传二代RCEC s, 此时细胞已呈现 典型的单层RCEC s 的形态, 细胞连接已经建立, 此时 汇合率达80%。目前多数学者认为, 现有的培养条件下 CEC s 无法通过不停传代达到扩增细胞数的目的, 若 是用于实验目的最好用传二代细胞。培养的细胞膜上 有一些通道、受体等结构可能生变化, 实验结果可能偏 离生理情况。而我们也观察到细胞在传三代之后, 形态 发生了一些变化, 失去了其典型的形状特征。本研究结 果显示原代 RCEC s 的酶活性最接近即兴揭取的 RCEC s, 更接近在体的细胞, 可能更适合某些体外实 验的要求。传代培养细胞N a+ 2K+ 2A T Pase 活性降低 可能是因为细胞N a+ 2K+ 2A T Pase 结构变化、反馈抑 制作用或遗传的不稳定性。 以往的研究中和临床工作中, 对于RCEC s 的检测 多限于形态学的观察, 对于细胞功能的检测方法较少, 5771中国误诊学杂志2009 年3 月第9 卷第8 期　Ch in J M isdiagn,M ar 2009 V o l 9 N o. 8 本研究使用的N a+ 2K+ 2A T P 酶活性定量检测, 可作为 评价体外培养角膜内皮细胞的功能指标, 对与角膜水 肿有关的角膜疾病的研究, 提供了实验参考, 随着研究 的不断深入, RCEC s 检测有望为将来这些疾病的发 生、发展和治疗提供理论依据。 【参考文献】 [ 1 ]　祝素文, 刘冬娟, 刘宁宇, 等. 兔角膜内皮细胞N a+ 2K+ 2A T P 酶的 电镜酶细胞化学观察[J ]. 解剖科学进展, 2003, 9 (2) : 1512154. [ 2 ]　Ko izum i N , Sakamo to Y, O kum ura N , et al. Cult ivated co rneal endo thelial cell sheet transp lan tation in a p rim ate model [ J ]. Invest Oph thalmo l V is Sci, 2007, 48 (10) : 451924526. [ 3 ]　V altink M , Gruschw itz R , Funk RH , et al. Two clonal cell lines of immo rtalized hum anco rneal endo thelial cells show either differen tiated o r p recurso r cell characterist ics [ J ]. Cells T issues O rgans, 2008, 187 (4) : 2862294. [ 4 ] 　 Sh in JS, Jang IK, Kim CW , et al. D evelopm ent and characterization of a rabbit co rneal endo thelial cell line[J ]. Jpn J Oph thalmo l, 2004, 48 (5) : 4542459. [ 5 ]　W h ikehart DR , A ngelo s P,M ontgom ery B. Effects of m annito l on cultu red co rneal endo thelial cell N a+ 2K+ 2A T Pase activity [ J ]. Co rnea, 1995, 14 (3) : 2952299. [ 6 ]　A lam ino s, Gonzalez2A ndrades,M unoz2A vila. V o lum etric and ion ic regulation during the in vitro developm ent of a co rneal endo thelial barrier[J ]. Exp Eye Res, 2008, 86 (5) : 7582769. 收稿日期: 2008209212; 修回日期: 2009201210　　责任编辑: 许纬洲 【经验交流】 肱动脉穿刺采血85 例血气分析 徐薇 作者单位: 江苏省南京市秦淮区中医院 210006 【主题词】　穿刺术ö方法; 肱动脉; 血样采集; 血气分析 【中图分类号】　R 446　　　　【文献标识码】　B　　　　【文章编号】　100926647 (2009) 0821776201 　　血气分析在帮助疾病诊断在临床使用越来越普遍。根据血 管走行方向经表浅动脉采血, 通常经桡动脉、股动脉等。经桡动 脉穿刺, 疼痛比较敏感, 如一次不成功, 可引起桡动脉痉挛, 给 再次穿刺带来困难。经股动脉穿刺, 患者需平卧, 如哮喘患者、 过度肥胖患者 (腹部脂肪下垂者) , 不能平卧, 给操作者带来了 不便。同时由于股动脉穿刺暴露部位过大, 在冬季易使患者受 凉, 采血时易误穿股静脉, 采血后操作者按压穿刺的部位, 在按 压的过程中可能移动位置或是按压力度、时间不够, 而易出现 局部的血肿[1 ]。为了避免以上的不足, 笔者采用肘关节内侧肱 动脉采血行血气分析, 取得了较好的效果, 总结如下。 1　临床资料 1. 1　一般资料　本组男49 例, 女36 例, 年龄37～ 86 (平均61. 5) 岁。病种: 冠心病37 例, 高血压21 例, 心律失常17 例, 心肌病10 例。 1. 2　操作方法 1. 2. 1　操作前准备　 (1) 首先向患者说明穿刺的目的, 消除其 紧张心理, 取得患者合作。(2)取2 m l 或5 m l 玻璃注射器, 即6 号 半或7 号针头, 抽1. 25 w iu 肝素钠湿润注射器, 排尽空针内的气 体和肝素, 使针头内充满肝素但保证针头外面无肝素沾染。 (3) 安置患者舒适体位, 前臂掌心向上, 有枕头置于肘关节处, 使肱 动脉充分暴露。 1. 2. 2　具体操作方法　 (1) 操作者立于同侧, 先用左手中指触 摸肱动脉, 在肱动脉搏动点最强处用指压一痕迹, 再用 0. 5% 碘 伏消毒患者肱动脉处与操作者左手的食指和中指。 (2) 操作者 在指甲压痕处触摸肱动脉, 行肱动脉穿刺, 在两指间垂直进针, 针头斜面指向近心端, 对于消瘦者, 刚进入皮肤要快, 然后缓慢 进入, 如见鲜血直入注射器, 即表示已刺入动脉。针头固定, 血 至 1. 5～ 2 m l 后拔出; 对于肥胖者需快速进针、稍深, 慢慢上提, 如见到鲜血直入注射器, 即表示已刺入动脉, 针头固定, 血至 1. 5～ 2 m l 后拔出。迅速将针头插入事先备好的橡皮塞, 送检。 2　结果 本组成功 81 例, 失败4 例, 成功率为 95. 3%。 3　讨论 (1) 此法操作比较容易、方便, 穿刺部位疼痛不明显, 患者 易于接受。 (2)严格执行“三查八对”和无菌操作 制度 关于办公室下班关闭电源制度矿山事故隐患举报和奖励制度制度下载人事管理制度doc盘点制度下载 , 要注意穿 刺进针速度快慢因人而异。 (3) 拔针后针头应稍向下或平移迅 速插入橡皮塞, 以免空气进入, 标本采集后需立即送检, 以免相 关指标出现异常, 造成临床误诊、误治[2 ]。 (4) 穿刺后有利于压 迫止血, 防止出血及血肿。 (5) 极度消瘦的患者、血容量不足的 患者, 由于肱动脉比较滑, 不易采用此法。 (6)良好的心理状态, 紧张和烦躁会影响穿刺的成功率, 避免患者因恐惧、剧烈活动 造成检验结果的误差[3 ]。 【参考文献】 [ 1 ]　陈兰英. 动脉血气采集部位的选择[N ]. 现代护理报, 2004202224. [2 ]　周佳. 影响血气分析检验结果可靠性的因素 [J ]. 中华护理杂志, 2001, 36 (5) : 30. [ 3 ]　左淑杰. 血气分析对开心术后病人的临床应用[J ]. 国外医学护理 学分册, 1994, 13 (4) : 151. 收稿日期: 2008209216; 修回日期: 2008212225　　责任编辑: 靳新东 6771 中国误诊学杂志2009 年3 月第9 卷第8 期　Ch in J M isdiagn,M ar 2009 V o l 9 N o. 8