组织型转谷氨酰胺酶在后囊膜混浊中作用研究（可编辑）

组织型转谷氨酰胺酶在后囊膜混浊中作用研究（可编辑） 组织型转谷氨酰胺酶在后囊膜混浊中作用研究 华中科技大学 博士学位论文 组织型转谷氨酰胺酶在后囊膜混浊中的作用研究 姓名:邢星 申请学位级别:博士 专业:眼科学 指导教师:胡义珍 2010-05 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 组织型转谷氨酰胺酶在后囊膜混浊中的作用研究 博士研究生: 邢 星 博士生导师: 胡义珍 华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科 摘 要 第一部分 tTG抑制剂对人晶状体上皮细胞 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 FN、Col-?的 影响研究 目的 观察组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase, tTG)抑制剂单丹磺酰尸胺 monodansyl-cadaverine(MDC)对转化生长因子 β (transforming growth factor- β , 2 2 TGF- β )诱导的人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells, HLECs)表达纤维连 2 接蛋白(Fibrone-ctin,FN)和?型胶原(collagen ?,Col-?)的影响。 方法 将体外培养的人晶状体上皮细胞株 HLE-B3 分为 5 组:无血清培养基中培养的 HLE-B3为正常对照组;加入 10μg/L TGF- β 处理 36h的 HLE-B3为 TGF- β 组; 10 μg/L 2 2 TGF- β 与 100、200 和 400 μmol/L MDC 共同处理 36h 的 HLE-B3 为不同浓度 MDC 2 组。用半定量 RT-PCR 检测 tTG、FN、Col-?在 HLE-B3 细胞中表达的变化。 结果 正常体外培养的 HLE-B 细胞中可表达一定量的 tTG、 FN及 Col-?。与正常对 3 照组相比,TGF- β 组中 tTG、 FN 和 Col-?的表达明显增强,差异有统计学意义 2 (P0.01)。与 TGF- β 组相比,100、200和 400 μmol/L MDC组中 FN和 Col-?的 2 表达含量明显减少(P0.01)。100、200和 400 μmol/L MDC组各组间 FN和 Col-? 的表达差异亦具有显著性意义(P0.01)。 结论 MDC可剂量依赖性的抑制 TGF- β 诱导的 LECs中 FN和 Col-?表达的增加。 tTG 2 可能通过促进 HLECs 表达 FN 和 Col-?等细胞外基质成分参与白内障术后后囊膜混 浊(posterior capsule opacification, PCO)的形成。 关键词 组织型转谷氨酰胺酶;晶状体上皮细胞;细胞外基质;纤维连接蛋白;?型 胶原;后囊膜混浊7华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 第二部分 RNA 干扰对人晶状体上皮细胞 tTG 表达的影响研究 目的 研究 RNA干扰抑制组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase, tTG)对人晶 状体上皮细胞(Human lens epithelial cells, HLECs)中 tTG表达的影响。 方法 设计并合成特异性针对 tTG的 3对小干扰 RNA ( short interfering RNA, siRNA) : siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3, 用 Real-time RT-PCR 和 Western blot 法检测转染了 siRNA 后人晶状体上皮细胞株(HLE-B3)中 tTG 基因在 mRNA 水平和蛋白水平的 变化。 结果 转染 siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 48h 后,tTG mRNA的表达分别下降为空白 对照组的 46.60%, 12.84%, 66.75%,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。 转染 siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3 60h 后,tTG蛋白的表达含量分别下降为空白对照 组的 60.49%,27.87%,55.91% (P0.01)。Real-time RT-PCR 与 Western blot 检测 结果一致显示了 siRNA-2 对 tTG基因的抑制效果昀佳。结论 我们设计并合成的靶向 tTG的 siRNA 可以显著降低 tTG的表达。 关键词 RNA干扰;组织型转谷氨酰胺酶;晶状体上皮细胞第三部分 tTG-siRNA 对人晶状体上皮细胞转分化和细胞外基质沉积的 作用研究 目的 探讨RNA干扰抑制组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase, tTG)的表达对 人转化生长因子β (transforming growth factor β , TGF- β )诱导的人晶状体上皮细胞 2 2 2 (Human lens epithelial cells, HLECs)转分化和细胞外基质沉积的抑制作用。 方法 将体外培养的人晶状体上皮细胞株HLE-B3分为正常对照组,TGF- β 组和 2 TGF- β +siRNA组。Western blot法检测各组细胞tTG、 α平滑肌肌动蛋白( α-Smooth 2 muscle actin, α-SMA)、纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)和?型胶原(collagen ?, Col-?)的表达。 结果 与正常对照组相比,TGF- β 组中tTG、 α-SMA、FN、Col-?的表达量均明显增 2 8华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 加(P0.01);与TGF- β 组相比,TGF- β +siRNA组中tTG、 α-SMA、FN、Col-?的表 2 2 达量均明显减少(P0.01)。 结论 靶向tTG的siRNA可以明显抑制TGF- β 诱导的HLE-B3 细胞合成 α-SMA、FN、 2 Col-?。提示tTG是介导TGF- β 诱导人晶状体上皮细胞转分 化和细胞外基质沉积的重 2 要分子, tTG蛋白有望成为预防和治疗后囊膜混浊(posterior capsule opacification, PCO) 的新靶点。 关键词 组织型转谷氨酰胺酶;细胞外基质; α平滑肌肌动蛋白; 晶状体上皮细胞;后 囊膜混浊;RNA干扰 9华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Effect of tissue transglutaminase on posterior capsule opacification Ph. D. Candidate: Xing Xing Supervisor: Prof. Hu Yizhen Department of Opthalmology Wuhan Union Hospital, Tongji medical college Huazhong University of Science & Technology Wuhan, 430022, China Abstract Part ? Effect of tissue transglutaminase inhibitor on the expression of FN and Col-? in human lens epithelial cells Objective To observe the effect of the tissue transglutaminasetTG inhibitor monodansyl cadaverineonMDC on the expression of fibronectinFN and collagen ?Col-?) induced by transforming growth factor- β TGF- β in human lens epithelial cells HLECs2 2 Methods Cultured human lens epithelial cell lineHLE-B3 in vitro were divided into five groups, including: 1group1, normal control group, 2group2, 10 μg/L TGF- β -treated 2 group, 3group3, 10 μg/L TGF- β +100 μmol/L MDC-treated group, 4group4, 10 μg/L 2 TGF- β +200 μmol/L MDC-treated group and 5group5, 10 μg/L TGF- β +400 μmol/L 2 2 MDC-treated group. Semiquantitative RT-PCR was used to assay the expression of tTG, FN and Col-? in HLE-B3 cells Results HLE-B3 cells cultured in vitro expressed certain quantity of tTG, FN and Col-?And the expression of them were markedly increased in group2 as compared with that in group1 P0.01. The expression of FN and Col-? were significantly inhibited in group3, 4 and 5 by MDC in a concentration-dependent manner as compared with that in group2P0.01 10华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Conclusion MDC can inhibit the enhanced expression of FN and Col-? induced by TGF- β in HLECs. tTG may be involved in posterior capsule opacificationPCO through 2 up-regulating the expression of FN and Col-? in HLECsKey words tissue transglutaminase; lens epithelial cells; tissue transglutaminase; extracellular matrix; fibronectin; collagen ?; posterior capsule opacification Part ? Inhibition of tissue transglutaminase expression in human lens epithelial cells by RNA interference Objective To investigate the inhibition of tissue transglutaminase tTG expression in human lens epithelial cellsHLECs by RNA interference Methods Three specific short interfering RNA siRNA of tTG siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3 were designed and synthesized, and transiently transfected into HLE-B3 cellsReal-time RT-PCR and Western blot were used to measure the expression of tTG mRNA and protein respectivelyResults after the transfection with siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3 for 48 hours, the tTG mRNA expression were decreased to 46.60%,12.84% and 66.75% of that in blank control group respectively. after the transfection with siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3 for 60hours, the tTG protein expression were decreased to 60.49%, 27.87 % and 55.91% of that in blank control group respectively. All differences had statistical significance P0.05~P0.01The same result was showed in Real-time RT-PCR and Western blot that siRNA-2 had the best inhibition effect on tTGConclusion siRNA targeting tTG gene is effective in suppressing the tTG expression Key words RNA interference; tissue transglutaminase; lens epithelial cells 11华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Part ? The role of tTG-siRNA in transdifferentiation and extracellular matrix deposition of human lens epithelial cells Objective To investigate the effect of tissue transglutamiase tTG siRNA on transdifferentiation and extracellular matrix deposition of human lens epithelial cellsHLECs induced by TGF- β 2 Methods Cultured HLE-B3 cells in vitro were divided into normal control group, TGF- β -group and TGF- β +siRNA-group. Western blot was used to assay the expression of 2 2 tTG, α-smooth muscle actin α-SMA, fibronectinFN, and collagen ? Col-? in HLE-B3 cellsResults The expression of tTG, α-SMA, FN and Col-? were markedly increased in TGF- β -group as compared with that in normal control group P0.01. And the expression 2 of tTG, α-SMA, FN and Col-? were significantly decreased in TGF- β +siRNA-group as 2 compared with that in TGF- β -group P0.012 Conclusion siRNA targeting tTG gene can obviously inhibit the synthesis of α-SMA, FN and Col-? in HLE-B3 cells induced by TGF- βIt suggests that tTG may play an 2 important role in transdifferentiation and extracellular matrix deposition of HLECs induced by TGF- βtTG is hopeful to be a new target for the prevention and treatment of posterior 2 capsule opacificationPCO Key words tissue transglutaminase; α-smooth muscle actin; extracellular matrix; lens epithelial cells; posterior capsule opacification;RNA interference 12独创性声明 本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成 果的 总结 初级经济法重点总结下载党员个人总结TXt高中句型全总结.doc高中句型全总结.doc理论力学知识点总结pdf 。尽我所知,除文中已经标明引用的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 外,本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索, 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密? ,在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?” ) 学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 日华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 前 言 经过几十年的发展,白内障手术的方式和技巧日臻完善,已成为世界上无数白内 障患者重获光明的唯一有效手段。然而,晶状体后囊膜混浊(posterior capsule opacification, PCO)又称为后发性白内障(after cataract), 目前仍然是白内障手术后 昀常见的一个远期并发症,直接影响着患者术后视力的恢复。 PCO的发病率与患者年 龄和术后随访时间有关。统计显示,年龄越小,PCO的发病率越高, 在成人其发病率 [1] [2, 3] [4] 可达30~50% ,在婴幼儿则接近100% 。Shaumberg等 报道,接受白内障手术的 患者PCO的发病率在术后1年为11.8%,术后3年为20.7%,术后5年为28.4%。目前对于 PCO开展的治疗方法主要是Nd: YAG激光后囊膜切开术,但是不可避免会产生一些并 [5] 发症,如眼压升高、葡萄膜炎、黄斑囊样水肿、视网膜脱离、人工晶体损害等 。因 此,探索一种安全有效的治疗PCO的新方法,对于减轻白内障患 者的经济、心理负担, 促进婴幼儿患者术后视力的恢复和发育,避免激光后囊膜切开术可能产生的各种并发 症具有重要意义。近些年来,为了寻找有效防治后发性白内障的药物,国内外学者进 [6] 行了大量的研究,其中包括一些抗代谢药物(如甲氨蝶呤,丝裂霉素等) 、糖皮质 [7] [8] [9] 激素 、组织纤溶酶原激活剂 、全反式维甲酸 等。但是这些药物存在作用时间较短、 效果不显著、毒性太强等缺点,均没有获得成功。 PCO的形成机制比较复杂,目前虽未完全阐明,但大量研究已经证实,转化生长 因子β(Transforming growth factor-beta, TGF- β)在PCO的形成中发挥了关键性作用。 手术修复过程中, TGF- β的合成增加,致使残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)转分化为肌成纤维细胞样细胞, 表达肌成纤维细胞的表型标志 α平滑肌肌动蛋 白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA),并大量合成?、?型胶原(collagen ?/ ?, Col-?? / )和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)等细胞外基质成份,加速了LECs的迁 [10-12] 移、黏附和细胞外基质沉积,昀终导致后囊膜的褶皱和斑块而形成 PCO 。可见, 由TGF- β诱导的LECs转分化和细胞外基质的异常沉积是PCO形成的关键。如果能够抑 制TGF- β的这些作用,就可以有效防止PCO的发生。然而,由于TGF- β在调节细胞分 [13] 化、胚胎发育、免疫及炎症等人体众多生理反应过程中发挥重要作用 ,并且对于眼 1华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 [14, 15] 内的多种组织如角膜、晶状体、视网膜、视神经等的发育是必需的 。如果试图通 过长期阻断TGF- β的表达和活性来阻止疾病的发生,则可能引发严重的不良反应。因 此,更深入研究与TGF- β相关的作用机制的细节,寻找更为精确的研究靶点,才能够 选择性的阻断TGF- β的生物学效应。 转谷氨酰胺酶(transglutaminase, TGs)昀初是于上世纪五十年 代在哺乳动物肝脏 2+ [16] 内发现的一类能够催化蛋白质酰基转移反应的Ca 依赖性酶 。它通过催化蛋白质或 多肽链中的谷氨酰胺残基与另一蛋白质的赖氨酸残基间的酰基转移反应,使蛋白质分 子发生共价交联,形成 ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键。转谷氨酰胺酶家族共包含9个成 员:转谷氨酰胺酶1~7(transglutaminase 1~ 7,TG1~ 7),循环酶原因子XIII,以及红 细胞带 4.2蛋白。其中转谷氨酰胺酶 2,也叫做组织型转谷氨酰胺酶( tissue transglutaminase, tTG, TG2)是研究昀为深入的一个,它广泛分布于内皮、系膜、平滑 [17] 肌细胞、成纤维细胞等身体内的绝大多数组织和器官中 。昀初 tTG由于在细胞凋亡 中发挥重要作用而受到关注,近年来的研究表明它在细胞生长分化、细胞外基质的重 塑与稳定、伤口愈合、信号转导、组织纤维化等多种生理和病理过程中均发挥了重要 [18-20] 作用 ,因此引起了研究者们更广泛的兴趣。研究发现,tTG分泌至细胞外,能够使多种细胞外基质蛋白成分之间发生交联, 形成能够抵抗各种酶类降解的牢固结构,使细胞外基质降解减少,促进细胞外基质的 [21] 沉积 。而细胞表面tTG可以介导细胞迁移并黏附于细胞外基质中的FN,促进整合素 介导的信号传递过程,对细胞生长、分化等生物学行为及细胞外基质的合成和分泌进 [22] [23] 行调控 。Schnabel等 在研究肝纤维化时发现,在肝星状细胞(HSC)转分化为肌 成纤维细胞过程中,活化的HSC及转分化后的肌成纤维细胞中tTG的表达显著增加, 进而推测tTG可能在HSC活化并转分化为肌成纤维细胞的过程中发挥重要作用。此外, TGF- β可以上调体内多种细胞tTG的表达。而tTG介导的潜活性TGF- β连接蛋白(LTBP) [24, 25] 与细胞外基质的交联是激活潜伏型存在于细胞外基质中TGF- β的前提 ,激活后的 TGF- β可以反过来以自分泌的方式刺激自身的表达。tTG与 TGF- β之间相互诱导、相互 [26, 27] 作用,形成一个正反馈,共同参与体内多种疾病的发生 。已有研究表明,tTG可以使晶状体内的多种细胞外基质成分发生交联,参与白内 2华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文[28-30] [31] 障的形成 。Wan等 发现,TGF- β可诱导人LECs合成tTG增加,tTG在前极白内 障患者LECs中的表达明显高于正常人。这些结果提示tTG可能与PCO的发生关系密切。本研究中,我们利用TGF- β 作为人晶状体上皮细胞株HLE-B3细胞发生转分化和 2 细胞外基质沉积的刺激因子,通过tTG的竞争性抑制剂单丹磺酰尸胺(monodansyl cadaverine, MDC)抑制tTG的交联酶活性,以及利用RNA干扰技术来高效率阻断tTG 蛋白的表达,观察tTG对HLE-B3细胞发生转分化和细胞外基质沉积的影响,探讨tTG 在PCO发病过程中的作用机制,为寻找有效防治PCO的新方法提供实验依据。3华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 参考文献 1Apple DJ, Solomon KD, Tetz MR, et al. 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Br J Ophthalmol, 2002, 86: 1293-12986华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 第一部分 tTG 抑制剂对人晶状体上皮细胞表达 FN、Col-?的 影响研究 后囊膜混浊(posterior capsule opacification, PCO)又称后发 性白内障(after cataract),是现代白内障囊外摘除或超声乳化吸除联合人工晶 状体植入术后的常见并 发症。大量研究发现,由于术后的创伤修复反应,房水中有活性的 转化生长因子 β (transforming growth factor- β,TGF- β)增加,诱导残留的 晶状体上皮细胞(lens epithelial cells, LECs)转分化为肌成纤维细胞样细胞,并大量 合成 ?、 ?型胶原 (collagen ?/ ?,Col-?? / )和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)等细胞外基质成份, [1-3] 是 PCO发生发展的重要病理过程 。组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase, tTG)存在于多种细胞和组织中, 其表达及活性的异常与细胞外基质的异常改变和细 [4, 5] 胞的增殖、移行、化生之间有密切联系 。本部分通过利用 TGF- β 刺激人晶状体上 2 皮细胞株 HLE-B3表达 tTG、 FN和 Col- ?,观察 tTG抑制剂单丹磺酰尸胺 (monodansyl- cadaverine,MDC)对 HLE-B3 细胞中 FN 和 Col- ?表达的影响,探讨 tTG在 PCO形 成中的作用。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1主要仪器设备 (1)CO 培养箱(美国 SHELLAB公司) 2 (2)超净工作台(德国 Heraeus公司) (3)倒置相差显微镜(日本 Olympus 公司) (4)低温高速离心机(美国 Sigma 公司) (5)电子天平(上海天普 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 仪器有限公司) (6)-80?低温冰箱(德国 Harrs公司) (7)温度梯度 PCR 扩增仪(德国 Biometra 公司) (8)DG- ?双稳数显电泳仪(北京鼎国生物技术发展中心) 13华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文(9)紫外分光光度计 UV-1600 型(上海美谱达仪器有限公司)(10)紫外检测仪(上海顾村电 光仪器厂) (11)UVP凝胶成像系统(美国思博明科学器材公司) 1.1.2主要试剂 (1)DMEM 培养基(美国 Hyclone 公司) (2)胎牛血清(美国 Gbico公司) (3)人转化生长因子(Human TGF- β )(英国 Peprotech 公司) 2 (4)tTG抑制剂 monodansyl-cadaverine(MDC)(美国 Sigma公 司) (5)引物(上海生工生物有限公司) (6)Trizol Reagent 美国 Invitrogen公司 (7)RT-PCR试剂盒(日本 TOYOBO公司) (8)DNA Marker(大连 TaKaRa 公司) 1.1.3 细胞HLE-B3 细胞株(美国 ATCC公司) 1.2 方法 1.2.1 HLE-B3 细胞的培养和分组 将 HLE-B3 细胞在 37?、 5%CO 培养箱中培养于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养 2 液中。待细胞长满瓶底面积的 70%~80%时进行传代:将原培养液弃去,加入 0.5~1mL 0.5%胰酶溶液,消化约 30s 后,显微镜下观察细胞趋于圆形,将胰酶弃去,加入 10mL 培养液终止消化。用吸管将贴壁细胞吹打成单细胞悬液,分装到另外 2~3个培养瓶中 继续培养,每隔 2~3天换液一次。6 取生长状态良好的 HLE-B3 细胞以 1×10 个/孔的密度接种于 6 孔板内,24h 后吸 出培养液,D-Hanks 洗 3 次。按以下分组进行实验:1 组含未加处理的等体积无血清 培养液作为对照组,2组含 TGF- β 10μg/L的无血清培养液 1mL;3、4、5 组含 TGF- 2 β 10μg/L,MDC浓度分别为 100、200、400μmol/L的无血清培养液各 1mL。 2 1.2.2 RT-PCR测定tTG、FN和Col- ? mRNA的表达 1.2.2.1 引物设计 14华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 引物由Premier 5.0软件设计,经NCBI BLAST向基因库检索验证,与其他基因无 高度同源性。由上海生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 技术服务有限公司合成、纯化。 引物序列如下: tTG,产物长度:538bp 上游引物:5’CGAACCACCTGAACAAACTG3’ 下游引物:5’ATCTCCACCGTCTTCTGCTC3’ FN,产物长度:639bp上游引物:5’CGAAATCACAGCCAGTAG3’ 下游引物:5’ATCACATCCACACGGTAG3’ Col-?,产物长度:451bp 上游引物:5’CAATGCCCTTCCTGTTCTGC3’ 下游引物:5’GTGGACGGCGTAGGCTTCTT3’ β-actin,产物长度:285bp 上游引物:5’