赤芍与白芍药材高效毛细管电泳指纹图谱方法学研究1

赤芍与白芍药材高效毛细管电泳指纹图谱方法学研究1 作者:王磊磊，陈军辉，王虹，殷月芬，王小 如，杨东方 【摘要】 目的确定赤芍和白芍的高效毛细管电泳分析方法，建立赤 芍和白芍的高效毛细管电泳法(HPCE)指纹图谱。方法HPCE工作条 件:采用未涂层熔融石英毛细管(内径75 μm,有效长度50 cm) ，分离 电压为25 kV，柱温25 ?，二极管阵列检测器(DAD)检测波长为220 nm，缓冲液为30 mmol/L硼砂(pH = 9.0)溶液。按此条件对来自不同产 地的7种赤芍样品和8种白芍样品进行了分析。结果建立了赤芍和白芍 HPCE指纹图谱，采用中药指纹图谱相似度 计算 软件，以系统生成的 对照指纹图谱为对照 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 对不同样品的图谱进行相似度计算。结论该方 法简捷、有效，可以用于赤芍和白芍药材的质量控制。 【关键词】 赤芍; 白芍; 高效毛细管电泳法; 指纹图谱 Abstract:ObjectiveTo set up a modern High Performance Capillary Electrophoresis analysis method for separating and detecting Radix paeoniae Alba and Radix paeoniae Rubra and establish their fingerprints. MethodsSeven samples of Radix paeoniae Alba and eight samples of Radix paeoniae Rubra were carried out by HPCE under the following conditions: bared fused silica capillary (50 cm ×75 μm i.d. ) , 30 mmol/L borate (pH = 9.0) as buffer, the run voltage is +25 kV, detection wavelength of UV at 220 nm, and column temperature of 25?.ResultsThe fingerprints were confirmed and compared by the software of the similarity evaluation system for chromatographic fingerprint. ConclusionThe results showed that the method of HPCE fingerprint is reliable and accurate to control the quality of two Chinese traditional medicines. Key words:Radix paeoniae Alba; Radix paeoniae Rubra; High Performance Capillary Electrophoresis ; Fingerprint 赤芍为毛茛科芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch. 直接使用的干燥根，其味苦，微寒，归肝经，具有清 热凉血、散瘀止痛之功能。白芍为毛莨科芍药Paeonia lacttiflora Pal1. 水煮去皮后使用的干燥根，其味苦、酸，微寒，归肝、脾经，具 有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗之功能,1,。两种药材中均含有芍 药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类和苯甲酸、没食子酸等酸 类成分,2，3,，其中总苷类物质为药材的主要活性成分,4,，因此 2005版《 中国 药典》规定芍药苷的含量作为赤芍和白芍的质控指 标。但是赤芍和白芍的疗效和在临床使用上有很大不同，仅使用单一成 分作为指标进行质量控制，不能全面反映药材的有效成分，难以真正全面地控制药材的内在质量。中药指纹图谱是指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材及其制剂的各组分群体特性的共有峰的图谱,5,。色谱指纹图谱是通过把复杂的化学成分进行分离，形成高低不同的峰，组成一张色谱图，整个色谱图 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达了该样品所含化学成分的多少和量的大小，不仅可用于已知成分的分析，还可以用于未知成分的分析,6,。因此指纹图谱目前被国际上公认为是植物药和中草药质量控制最有效的工具之一 ,7,，如《美国草药典》(AHP)为五味子、甘草等热点植物药确定了比较稳定可靠的TLC、HPLC分析结果和指纹图谱，为该类药材的生产和应用提供依据,8,。 近年来，将色谱指纹图谱的方法用于赤芍和白芍研究的相关 文献 也不断出现，但这些文献多利用高效液相色谱法(HPLC)进行研究,9,12,，如王巧等,10,利用HPLC分析了三十多种赤芍和白芍药材的醇提物，建立了白芍与赤芍的HPLC指纹图谱分析方法 。但用HPLC进行中药成分分析，运行成本较高、分析时间长，而且常遇到一些问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，例如色谱柱易受污染，并且对于含极性成分较多的中药，其“指纹”的特征性不强。相比而言，高效毛细管电泳法(HPCE)分析中药则有独特的优势，具有柱效高、快速、进样体积小，水溶性样品的“指纹”特征性强，前处理简单，而且分析运行成本低,13，14,的优点。关于赤芍或白芍HPCE指纹图谱的研究未见报道，所以本文对赤芍和白芍药材的HPCE指纹图谱进行了探索性研究，以期为有效控制赤芍和白芍药材质量提供新的方法。 1 仪器与试剂 G1062A 型HPCE仪(美国Agilent公司)，配有二极管阵列检测器(DAD);未涂层熔融石英毛细管(美国Agilent公司)，内径75 μm，有效长度50 cm;KQ-400KDE型高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);R201型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);FA1104型 电子 天平(上海精天电子仪器厂)。 硼砂，无水乙醇，氢氧化钠均为分析纯，甲醇为色谱纯，实验用水均为Milli-Q超纯水。芍药苷标准品(110736-200629)购自中国药品生物制品检定所，其他样品购自各药品公司，来源为全国各产地。 2 方法与结果 2.1 标准溶液及供试品溶液的配制 2.1.1 标准溶液的配制准确称量芍药苷标准品，加入甲醇溶解定容，用30 mmol/L的硼砂溶液稀释。进入HPCE系统前经0.45 μm微孔滤膜过滤。 2.1.2 供试品溶液的制备将供试样品干燥后进行粉碎，过60目 筛。准确称取粉碎后的样品1.0 g，置于100 ml具塞锥形瓶中，加入40 ml 95%乙醇，在35?温度条件下超声辅助提取30 min，提取液过滤，将滤液在55?条件下进行旋转蒸发浓缩至干，再加入30 mmol/L硼砂溶液20 ml 溶解，过0.45 μm微孔滤膜后作为供试品溶液。 2.2 HPCE工作条件采用压力进样方式，压力50 mbar，进样时间3s，分离电压25 kV，运行温度保持25?，紫外检测波长220 nm，带宽8 nm，参比波长500 nm，运行缓冲液为30 mmol/L的硼砂溶液(用氨水调pH值至9.0)。试样进入毛细管前，均需过0.45 μm微孔滤膜，分析开始前，依次用1 mol/L NaOH溶液，超纯水和缓冲液冲洗毛细管各5 min，分析过程中，及时更换缓冲液瓶中的缓冲溶液，以保证两缓冲液瓶中缓冲液组分一致，保证分析精度。 2.3 提取方法优化 2.3.1 提取溶剂的选择根据2005版《中国药典》，对赤芍与白芍进行鉴别时，选用乙醇作为提取溶剂，对赤芍项下芍药苷进行含量测定时，选用甲醇作为提取溶剂，而水煎提取是中草药传统提取方法，所以本研究对不同溶剂(水、甲醇、乙醇)作提取溶剂时所得到的图谱进行了比较。测定结果表明，以水为提取溶剂时，出峰数量少且各峰响应值较低，不适于做指纹图谱;甲醇为提取溶剂时，提取结果与乙醇类似，但是甲醇与乙醇相比，有较强的毒性，会对实验人员及环境造成一定的危害;而用乙醇提取时，分离度较好，基线较平稳，适合做指纹图谱，而且安全无害，因此选择乙醇做提取溶剂。但是由于乙醇与缓冲盐溶液极性不同，对各种化学成分的的溶解度也不相同，因此直接将乙醇提取液进样检测时，色谱峰会出现较严重的拖尾现象，而将乙醇蒸干，以缓冲溶液重新溶解提取物再进样，可以解决这个问题，得到峰形较好的色谱图。 继续考察了50%，70%和95%3种不同浓度的乙醇作为提取溶剂得到的提取结果。结果表明，以50%乙醇为提取溶剂时，分离度较差，基线漂移严重，以70%乙醇为提取溶剂时，基线也略有漂移，而以95%乙醇为提取液时分离结果较为理想(见图1,3)。 2.3.2 提取方法的选择比较了回流法和超声辅助提取法对样品进行提取，结果显示，回流法与超声辅助提取法得到类似结果，但是回流法操作复杂，处理时间较长，且加热过程可能会引起其它组分的变化，比较而言，超声法方便快速，提取效率较高，且结果良好，因而选用超声法进行提取。 2.4 HPCE实验条件优化 2.4.1 缓冲溶液性质对分离结果的影响HPCE分离各种组分是利用电泳的原理，但由于电渗的存在，又与传统的电泳不同，电渗就是毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动，这种流动能够实现 所有样品组分的同向泳动，实现正负离子的同时分离，而HPCE运行中的缓冲溶液可以直接影响或改变电渗,15,，因此缓冲溶液的性质会直接影响样品分离结果。 根据文献报道，出于对药材中的成分进行质谱定性分析的期望，本实验首先选择可进行质谱分析的碳酸铵和乙酸铵水溶液作为缓冲溶液，但是结果表明碳酸铵水溶液和乙酸铵水溶液作缓冲液时，样品响应值低，分离度不高，得到的HPCE谱图不适于作指纹图谱，而选择紫外吸收比较低，pH缓冲范围比较宽的硼砂水溶液作为缓冲液时，则取得了较好的分离结果，因此确定硼砂溶液作为分离赤芍和白芍样品的缓冲体系，并对其浓度和pH值的选择作了系统的考察。 首先比较了10，20，30和40 mmol/L 的硼砂溶液作缓冲液时得到的色谱图(见图4,7)，由图4,7可以看到，随着浓度的升高，样品中各峰的保留时间差别逐渐增大，分离效果也越好，但由于硼砂溶液有较高的电导率，浓度过高时，会导致产生热量较多，不利于分离，而且保留时间过长，会延长每次进样分析的周期，因此选择30 mmol/L的硼砂溶液作为缓冲液，各峰得到较好的分离，且分析时间较短。 缓冲液的pH值控制弱电解质样品的有效淌度、电渗甚至样品在管壁上的吸附水平，因此对柱效和样品的分离度有显著的影响，本实验比较了缓冲液pH值分别是4.1，6.4，7.2和9.0时得到的分离结果(见图8,11)，随着缓冲液的pH值逐渐升高，保留时间变短，分离度显著提高，峰形更好，所以本研究最终选择pH9.0的硼砂溶液作为缓冲液。 缓冲液中加入少量的有机溶剂常常能有效改善分离度，并使许多水难溶的样品得以用毛细管电泳分析，所以本实验尝试在硼砂水溶液中分别加入少量的甲醇和乙腈，但是结果只略影响响应值的大小，对分离度并无显著影响，所以本研究只选用硼砂水溶液作缓冲液，不加任何有机添加剂。 2.4.2 HPCE电压和温度的选择本实验采用瞬间升压的恒压工作方式，对不同的工作电压进行比较选择。在15,30 kV的范围内，随着电压的升高，分离效率升高，分离速度加快，但在较高的电压下，焦耳热效应过大，导致峰形较差，噪音明显增大，不利于进行分析，所以选择25 kV作为运行电压，在此条件下电流稳定，且可以得到较好的分离结果。 电泳温度的选择主要指毛细管外表温度的选择与控制，应该考虑热效应控制、重复性控制、分离效率控制和分离介质对温度的限制等因素，同时受到仪器条件的影响。本实验考察了温度在15,30?的范围内得到的不同分离结果，温度过低时，分离效率不高，分离速度过慢，而温度过高时，热效应过大，也会影响分离结果，所以最终选择25? 作为电泳温度。 2.4.3 检测波长的选择根据文献报道，利用HPLC对赤芍或白芍样品进行紫外检测时，多选用230 nm作为检测波长,16，17,，故本实验首先选择230 nm波长进行检测，结果发现芍药苷响应值较大，而其他成分响应值则相对较低，导致谱图中出峰数量少，不适于作为表现所有成分整体情况的指纹图谱。而通过分析一个样品提取物的三维-紫外-毛细管电泳(3D-UV-CE)图，比较不同波长下的紫外吸收值的大小，确定220 nm为检测波长时，得到的谱图较之其他检测波长基线平稳，分离度较好，可以得到最佳的指纹图谱，所以最后选择220 nm作为检测波长。 2.5 方法学考察 2.5.1 色谱峰的定位本文主要根据对照品的保留时间对样品进行色谱峰定性。芍药苷作为赤芍和白芍中的重要有效成分之一，在药材中含量较高，而且药典规定以它作为赤芍和白芍的质控指标，所以本实验选择芍药苷标准品对样品中的芍药苷峰进行定性，并以此峰作为参照峰。实验时以标准溶液和样品供试溶液按相同的条件进样分析，通过对比得到的两份色谱图，并将其UV谱图与相应已知标准品图谱进行比较印证，以确定与对照品相应的峰位，最终确认样品谱图中与标准品谱图保留时间相同的峰为芍药苷峰(见图12)。 a-标准品 b-供试样品 图12 在相同条件下芍药苷标准品的HPCE色谱图 和光谱图与供试样品的HPCE色谱图 2.5.2 精密度实验按优化后的HPCE工作条件，对一个赤芍样品供试品溶液进行6次重复进样分析，测得谱图中芍药苷峰的峰面积和保留时间，分别计算其标准偏差，得到峰面积和保留时间的RSD值分别是2.46% 和0.59% ，表明仪器精密度良好。 2.5.3 重复性实验精密称取同一样品5份，分别按“2.1”项下处理方法制成供试品溶液，然后按照“2.2”项下的HPCE工作条件进样测定，测得芍药苷峰面积和保留时间，并计算其标准偏差，峰面积和保留时间的RSD值分别为3.93% 和0.42% ，表明该方法重复性良好。