胆管癌的蛋白质组学分析

《中国癌症杂志》2010年第20卷第6期 CHINA ONCOLOGY 2010 Vol.20 No.6 411 胆管癌的蛋白质组学分析 吕济相　王济明　罗诗樵　黄国飞 重庆医科大学附属第一医院肝胆外科，重庆 400016 　　［摘要］　背景与目的：胆管癌是目前常见的消化道恶性肿瘤，早期诊断困难，总体5年生存率极低，所 以改善预后的关键在于早期诊断。近年来，蛋白质组学的迅猛发展，为 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 肿瘤标志物提供了一种新技术。本 研究通过比较胆管癌组织与正常胆管组织的蛋白质组表达差异，寻找胆管癌相关的蛋白质，选择敏感的分子标 志物。方法：运用蛋白质组学技术，对16例胆管癌患者的胆管癌组织和正常胆管组织进行胶内差异双向凝胶电 泳（2-DE），选择差异表达超过2倍的蛋白质进行MALDI-TOF质谱分析和生物信息学分析。结果：成功建立胆管 癌组织和正常组织的双向凝胶电泳图谱，胆管癌组织和正常胆管组织平均蛋白质斑点数分别为1 087和1 048， 其中表达差异超过2倍的斑点共有32个，质谱分析和数据库检索共鉴定出l8种蛋白质，包括衔接蛋白成纤维细 胞生长因子受体底物2（fibroblast growth factor recptor substrate 2，FRS2）、连环蛋白（catenin， beta 1)、细胞外信号调节激酶（extracellular response kinase）等。从功能上分析，这些差异蛋白质与癌 细胞的发生、增殖、分化、转移等相关。结论：胆管癌组织与正常胆管组织间有l8种差异蛋白质可能为研究胆 管癌的生物学行为提供新的分子标记物。 　　［关键词］　胆管癌；　蛋白质组学；　双向凝胶电泳 　　中图分类号：R735.8　　文献标识码：A　　文章编号：1007-3639(2010)06-0411-05 Proteomic analysis of cholangiocarcinoma LV Ji-xiang,WANG Ji-ming,LUO Shi-qiao,HUANG Guo-fei (Department of Hepatobiliary Sugery, First Affiliated Hospital，Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016, China) Correspondence to：WANG Ji-ming　E-mail：wangjiming@263.com 　　［Abstract］ Background and purpose：Cholangiocarcinoma is a common digestive tract cancer which is difficult to be early diagnosed, and has a low overall 5-year survival rate. Early diagnosis plays an important role in improving its prognosis. The proteome develops so rapidly that it has provided a new technology for tumor markers in recent years. This study was aimed to investigate cancer associated proteins and sensitive biomarkers in cholangiocarcinoma. Methods：Two-dimensional gel electrophoresis was used to define patterns of protein expression in cholangiocarcinoma and these patterns were matched to normal tissues from 16 patients. Proteins that showed differential expression of a 2-fold change were cut and analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. Results： Two-dimensional protein maps of cholangiocarcinoma and matched normal tissues were gained successfully. Gel- analysis software identified an average of 1 087 spots in cholangiocarcinoma, while 1 048 were identified in matched normal tissue and statistical filtering yielded 32 spots of a 2-fold change, of which, 18 were identified by using mass spectrometry. These 18 included fibroblast growth factor receptor substrate 2 (FRS2), catenin, beta 1, extracellular response kinase, etc. Functional analysis revealed that these proteins were associated with cancer cellular oncogenesis, proliferation, differentiation and metastasis. Conclusion：Proteomic analysis could identify proteins with variance in cholangiocarcinoma versus in normal tissues as well as be able to provide probable 18 new biomarkers correlated with biological behavior of cholangiocarcinoma. 　［Key words］　cholangiocarcinoma; proteomic; two-dimensional gel electrophoresis 基金项目：重庆市卫生局2007年度医学科研项目计划（07-01-003）。 通讯作者：王济明　E-mail:wangjiming@263.com 　　胆管癌是消化系统常见的恶性肿瘤，在我 国的消化道恶性肿瘤中居第5位，占各种恶性肿 瘤死亡的0.48%，每年约有4 500人死于胆道恶 性肿瘤。该病起病隐匿，临床症状及体征出现 晚，早期诊断困难、预后差，因此寻找能特异 性早期诊断胆管癌的方法是目前临床上迫切需 412 要解决的问题［1］。本研究利用蛋白质组学技 术［2］对胆管癌组织和胆管正常胆管黏膜组织 进行对比分析，找出存在的差异蛋白，为筛选 可用于临床早期诊断胆管癌的特异性生物标志 物提供理论依据。 1　材料和方法 1.1　标本　本实验中用于蛋白质组学研究的 组织标本全部来自于重庆医科大学附属第一医 院肝胆外科，取2007—2009年间的16个病例， 其中男性、女性各8例，年龄35～76岁，平均 年龄55.5岁，中位年龄57岁。术前均未进行 放、化疗。所有病例切除的标本均经病理证实 为胆管腺癌，其中高分化4例，中分化4例，低 分化8例。正常胆管组织来源于肝移植患者供 肝修肝丢弃的部分。实验标本收集后均立刻放 入液氮罐中冻存。 1.2　主要试剂　固相pH梯度干胶条（IPG） （pH：3～10，17 cm）（Bio-Rad公司）、 I P G 缓 冲 液 （ p H ： 3 ～ 1 0 ） 、 尿 素 、 硫 脲 、 3 - ［ （ 3 - 胆 固 醇 氨 丙 基 ） 二 甲 基 氨 基］-1-丙磺酸（3-［（3-Cholanidopro- pyl）dimethylammonio］-1-propanesulfonate， CHAPS）、二硫苏糖醇（di th i o th re i t o l， DTT）、三羟甲基氨基甲烷［tris（hydroxy- methyl）aminomethane， Tris-base］、碘乙 酰胺（iodoacetamide， IAA）、甘氨酸、丙 烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硝酸 银、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）、甘油、琼脂糖、胰蛋白酶、铁氰化 钾和2DE-Cleanup试剂盒GE（均 Amersham 公 司）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、四甲基二乙 胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、 乙腈、三氟乙酸（Sigma公司）、牛血清白蛋 白（bovine serium albumin，BSA）（上海生 工），其余为国产分析纯试剂。 1.3　主要软件　PDQuest8.0 2-DE图像分析 软件（Bio-rad公司）、凝胶扫描仪Scanmaker 4685（Bechman公司）、MALDI-TOF-MS Voy- ager DE-PRO（美国ABI公司）等。 1.4　样品制备　在液氮条件下将组织研磨成 粉末，加入细胞裂解液（尿素7 mol/L，硫脲 2 mol/L，CHAPS 40 g/L，DTT 65 mmol/L，体 积分数0.002的Bio-lyte两性电解质），加入 DNA、RNA酶各5μL，4 ℃冰箱静置30 min， 然后4 ℃ 16 000 r/min、离心1 h，取少量上清 液用Bradford法定量，其余上清液分装并且放 在-80℃冰箱冻存。 1.5　固相pH梯度双向凝胶电泳　⑴第一向固 相pH梯度等电聚焦：主要按Gorg等［3］的方法 和Protean IEF cell等电聚焦系统指南进行；⑵第 二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：将平衡后的胶 条移至1.0 mm厚的120 g/L的SDS-PAGE胶上至 溴酚蓝条带迁移至距底边1～2 cm处；⑶银染： 参照文献［4］进行硝酸银染色。 1.6　凝胶图像分析　在相同条件下对每例患 者的胆管癌组织和正常组织的总蛋白样品分别 进行了3次双向凝胶电泳，银染显色的凝胶通 过GS-800凝胶扫描仪获取图像，用PDQuest软 件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配和获 取斑点位置坐标等。统计分析使用t检验法。选 取蛋白斑点表达差异大于2倍、t检验P<0.05的 斑点作为研究蛋白。 1.7　制备质谱样品　蛋白质点从银染凝胶中 切取成1～2 mm2大小的胶块，经水洗、脱色、 脱水、酶解和萃取后送质谱分析。 1.8　质谱数据的分析　将质谱数据使用Mascot 软件在NCBInr数据库中进行搜索，参数设置 为：种属Homo sapiens；肽段容忍度75×10-6； 离子碎片容忍度0.2；蛋白质检索得分大于95的 认为是成功鉴定的蛋白。 2　结　　果 2.1　凝胶图谱分析结果　胆管癌组织和正常 组织总蛋白分布模式非常相似（图1），其 识别的蛋白质斑点数分别为（1 087±40）和 （1 048±11），凝胶中斑点的平均匹配率分别 为84.0和80.3。第一向等电聚焦（IEF）的平均 偏差为（1.16±0.29）mm，第二向SDS-PAGE 方向上的斑点位置偏差为（1.00±0.38） mm。 　　PDQuest软件分析显示，有70个蛋白质点 仅存在于癌组织中（图1A），有8个蛋白质点 仅出现在正常组织中（图1B）；癌组织与正常 黏膜组织相比，有19个蛋白质点表达上调且大 于5倍，正常组织与癌组织相比，上调相差5倍 的蛋白质点有41个。 2.2　质谱分析结果　在胆管癌组织和胆管 正常黏膜组织的2-DE图谱中，选取胆管组织 吕济相，等.　胆管癌的蛋白质组学分析 《中国癌症杂志》2010年第20卷第6期 413 癌中高表达的蛋白斑点18个，进行MALDI- TOF-MS分析，得到蛋白质点的肽质量指纹图 （PMF），18个点共获取18张PMF。图2为衔接 蛋白成纤维细胞生长因子受体底物2蛋白的肽 质量指纹图。我们根据从数据库查到的蛋白点 的组织来源性，以及与胆管癌分化和生长的相 关性大小列出了6个意义相对较大的差异蛋白 点（表1）。 图 1　胆管癌组织(A)和胆管正常组织（B）的2-DE图谱 Fig. 1 Two-dimensional protein maps of cholangiocarcinoma (A) and matched normal tissue (B) The protein points (marked by arrows) are significantly different in cholangiocarcinoma and matched normal tissue. 图 2　衔接蛋白成纤维细胞生长因子受体底物2蛋白的肽质量指纹图（PMF） Fig. 2 The peptide mass fingerprinting of fibroblast growth factor recptor substrate 2 414 3　讨　　论 　　尽管近年来对早期发现胆管癌从生理、生 化和分子生物学等进行了许多研究，如对胆 汁中的癌胚抗原（CEA）、糖类抗原等进行检 测，对胆汁中以及肿瘤标本的癌基因和抑癌基 因等研究也取得了一些进展，如目前实验室用 于胆管癌检测的癌抗原19-9（CA19-9）的敏 感度为67.5%，特异度达到86.8%［5］。但总体 来说，能用于临床、同时具有高敏感性及高特 异性的早期诊断胆管癌和提高其预后的标志物 尚未发现。目前用于蛋白质组学研究的主要技 术之一是双向凝胶电泳技术，我们通过反复摸 索，建立了分辨率高、重复性好的双向凝胶电 泳方法系统，这保证了我们进行肿瘤蛋白质组 学差异分析的基本条件。 　　本实验我们鉴定出了一些差异蛋白质，其 中匹配分数大于63分的差异蛋白点共有18个， 并筛选出6个意义相对较大的差异蛋白点。 　　连环蛋白是一组具有相似结构的胞内糖蛋 白家族，它们的氨基酸组成中都具有数个相同 序列的结构域。目前将该家族分为四大类： α、ß、γ和p120ctn，其中ß-连环蛋白（ß- catenin）尤为重要。ß-catenin的氨基端有130 个氨基酸，富含Ser、Thr位点，控制着分子的 稳定性；羧基端由100个氨基酸组成，负责激 活靶基因的转录。ß-catenin最重要的结构是含 有12个armadillo重复区，它们形成一个棒状的 超螺旋结构，可防止蛋白水解，在与E-钙黏蛋 白（E-cad）、活化蛋白C（APC）、转化生长 因子（TCF）等的结合过程中有重要作用［6］。 ß-catenin基因突变后，胞质内游离ß-catenin积 聚，发生核转位并与转录因子Tclf4结合，启动 c-myc、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）、基质 金属蛋白酶MMP-7、CD44等靶基因的转录、 表达，这些靶基因在细胞增殖和癌变过程中起 着重要作用［7］。郑启昌等［8］研究发现在肝门 部胆管癌细胞中ß-catenin存在异常表达，并与 c-myc阳性表达呈显著的正相关，且ß-catenin 异常表达与肝门部胆管癌的淋巴结转移密切相 关。这可能是因为癌细胞膜上的ß-catenin向胞 质中转移，导致 E-cad/cat复合体结构破坏和功 能障碍，使防止癌细胞转移的屏障消失，从而 致使癌细胞转移。 　　细胞外信号调节激酶（extracellular re- sponse kinase，ERK）信号转导通路是调控细 胞增殖的重要途径。近期研究表明，ERK蛋白 表达与某些恶性肿瘤的浸润转移密切相关。据 王江宁［9］报道p-ERK1/2蛋白在高、中、低分 化胆管癌组织中的表达组间比较均有统计学差 异，其表达与肿瘤的病理分化程度密切相关， 分化越差P-ERK1/2蛋白表达越高。但与年龄、 性别、临床TNM分期无关。此外，p-ERK1/2蛋 白阳性表达的患者术后无复发生存时间显著延 长。因此，P-ERK1/2的表达可能与肿瘤的发展 有关，并对判断胆管癌预后有一定价值。 　　蛋白质组学技术为研究肿瘤相关蛋白提供 了有效手段，本实验运用双向凝胶电泳和质谱 技术，鉴定出与胆管相关的蛋白18个。某些蛋 白与肿瘤的发生发展、转移以及细胞分化相 关［10］。对其功能的深入研究，有可能为胆管 癌的诊断、治疗提供新的靶向性分子标志物， 以达到早期发现、有效治疗的目的，改善总体 预后。 ［参　考　文　献］ ［1］ Jabara B, Fargen KM, Beech S, et al . Diagnosis of cholangiocarcinoma: a case series and literature review［J］. J La State Med Soc, 2009, 161(2): 89-94. ［2］ 魏晓丽, 王悦. 癌蛋白质组学技术及其应用［J］. 基础医 学与临床, 2008, 28(10): 1107-1110. ［3］ Gorg A, Obermaier C, Boguth G, et al. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized ph gradient ［J］. Electrophoresis, 2002, 21(6): 1037-1053. ［4］ Mortz E, Kroght N, Vorum H, et a1. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using 表 1　胆管癌组织与正常组织差异蛋白点的鉴定结果 Tab. l Characteristics of identified proteins expressed in cholangiocarcinoma and matched normal tissue ID No. Protein name Swiss-Prot ID Mr PI Matched 1. Fibroblast growth factor recptor substrate 2(FRS2) Q8WU20 57393 5.65 70 2. Catenin, beta 1 P3522 86069 5.53 75 3. Extracellular response kinase XP638833 56634 7.81 80 4. Fibrinogen P02680 65403 6.45 68 5. TGF-β Q96GQ7 21023 8.21 71 6. S100A6 P06703 9917 5.05 69 吕济相，等.　胆管癌的蛋白质组学分析 《中国癌症杂志》2010年第20卷第6期 415 matris-assisted laser desorption/ionization -time of flight -analysis［J］. Proteomics, 2001, 11(11): 1359-1363. ［5］ Weber A, Schmid RM, Prinz C. Diagnostic approaches for cholangiocarcinoma［J］. World J Gastroenterol, 2008, 14(26): 4131-4136. ［6］ De Langhe SP, Carraro G, Tefft D, et al. Formation and differentiation of multiple mesenchymal lineages during lung development is regulated by beta-catenin signaling［J］. PLoS One, 2008, 3(1): 1516-1528. ［7］ Vespúcio MV, Turatti A, Modiano P, et al. Intrinsic denervation of the colon is associated with a decrease of some colonic preneoplastic markers in rats treated with a chemical carcinogen［J］. Braz J Med Biol Res, 2008, 41(4): 311-317. ［8］ 郑启昌, 陈海波, 左克强, 等. ß-连环蛋白在肝门部胆管癌 中的表达及其与 c-myc 表达的关系［J］. 中国普外基础 与临床杂志, 2005, 12(1): 67-70. ［9］ 王江宁. ERK1/2蛋白在胆管癌组织中的表达及意义［J］. 山东医药, 2008, 48(14): 60-61. ［10］ Sahni A, Simpson-Haidaris PJ, Sahni SK, et al. Fibrinogen synthesized by cancer cells augments the proliferative effect of fibroblast growth factor-2(FGF-2)［J］. Thromb Haemost, 2008, 6(1): 176-183. （收稿日期：2010-03-09 　修回日期：2010-05-15） 胆管癌的蛋白质组学分析 作者： 吕济相， 王济明， 罗诗樵， 黄国飞， LV Ji-xiang， WANG Ji-ming， LUO Shi-qiao， HUANG Guo-fei 作者单位： 重庆医科大学附属第一医院肝胆外科,重庆,400016 刊名： 中国癌症杂志 英文刊名： CHINA ONCOLOGY 年，卷(期)： 2010,20(6) 被引用次数： 1次 参考文献(10条) 1.王江宁 ERK1/2蛋白在胆管癌组织中的表达及意义[期刊论文]-山东医药 2008(14) 2.郑启昌;陈海波;左克强 β-连环蛋白在肝门部胆管癌中的表达及其与c-myc表达的关系[期刊论文]-中国普外基础与临床杂志 2005(01) 3.Jabara B;Fargen KM;Beech S Diagnosis of cholangiocarcinoma:a case series and literature review 2009(02) 4.Vesp ú cio MV;Turatti A;Modiano P Intrinsic denervation of the colon is associated with a decrease of some colonic preneoplastic markers in rats treated with a chemical carcinogen 2008(04) 5.De Langhe SP;Carraro G;Tefft D Formation and differentiation of multiple mesenchymal lineages during lung development is regulated by beta-catenin signaling 2008(01) 6.Weber A;Schmid RM;Prinz C Diagnostic approaches for cholangiocarcinoma[期刊论文]-World Journal of Gastroenterology 2008(26) 7.Mortz E;Kroght N;Vorum H Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matris- assisted laser desorption/ionization-time of flight-analysis 2001(11) 8.Gorg A;Obermaier C;Boguth G The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized ph gradient[外文期 刊] 2002(06) 9.魏晓丽;王悦 癌蛋白质组学技术及其应用[期刊论文]-基础医学与临床 2008(10) 10.Sahni A;Simpson-Haidaris PJ;Sahni SK Fibrinogen synthesized by cancer cells augments the proliferative effect of fibroblast growth factor-2(FGF-2)[外文期刊] 2008(01) 本文读者也读过(7条) 1. 黄国飞.王济明.罗诗樵.吕济相.HUANG Guo-fei.WANG Ji-ming.LUO Shi-qiao.LV Ji-xiang 人胆管癌与正常人胆汁蛋白质组学研究 [期刊论文]-中国癌症杂志2009,19(2) 2. 胆管癌患者血清肿瘤标志物的筛查和鉴定[期刊论文]-中华实验外科杂志2009,26(12) 3. 郭婧.李基业.GUO Jing.LI Ji-ye 胆管癌分子病理学研究进展[期刊论文]-中华肝胆外科杂志2011,17(2) 4. 林飞峰.金俊哲.LIN Fei-feng.JIN Jun-zhe p16在胆管癌相关疾病中的表达[期刊论文]-中华肝胆外科杂志2010,16(11) 5. 路文彦.王文斌.吕海涛.刘润田.边伟.赵腾 胆管癌组织中COX-2、VEGF-C的表达变化及意义[期刊论文]-山东医药2010,50(10) 6. 胆管癌分子生物学特性研究进展[期刊论文]-中华实验外科杂志2009,26(12) 7. 张峰伟.杨景红.侯巧燕.李美琼 N-cadherin 在胆管癌组织中的表达及意义[期刊论文]-广东医学2011,32(6) 引证文献(1条) 1.廖存.贺永明.吴留成.甘嘉亮.曹云飞.高枫 血清CEA阴性结直肠癌患者血清差异蛋白质的初步筛选[期刊论文]-结直肠肛门外科 2011(3) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgazzz201006003.aspx