扇贝多肽对长期紫外线辐射豚鼠皮肤光老化的保护作用研究

扇贝多肽对长期紫外线辐射豚鼠皮肤光老化的保护作用研究 青岛大学 硕士学位论文扇贝多肽对长期紫外线辐射豚鼠皮肤光老化 姓名:曹鹏利 申请学位级别:硕士 专业:药理学 指导教师:王春波 20030801 旃搬多肚对长期紫外线辐射姆氡立肤光老化的保护作用研究 扇贝多肽瓣长期紫外线辐射脬暴皮肤光老化的保护作用研究, 研究生 曹鹏利 导师 王春波教授 青岛丈学鞋学院 药理学专业 中文藉要 目的建立模拟紫夕,线长期辐射豚醒背部皮肤光老他的病理模举，探讨应用扇贝多肽(,,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,?，,，,,,)对长波紫外续(,,,)和中波紫外线 (,,,)长期辐射豚鼠背部皮肤的光老化保护,乍用及其桃制。方法用海洋生物酶工程技术，扶栉孔扇贝(,,,,,,,(细删)中提取,;,(分子量为,,,—,，,,,,,,，建立长期紫外线辐射豚鼠背部皮肤光老化的病理模型。将,, ,豚鼠(, ,,,,,;雌雄兼用)随枫分成弼组(”,,):对照组、模型组(,,照射组)、,,,小剂量缀(,,,,,，,,,)、,,,大剂最组(,,,,,,，,,,)。照射的第„至七周，每周隔天照射一次共照射三次，,,,,和,,,，,,照射强度分剐是,(,,, ,(;,,,移, ,, ,,;,。。。照射的第,至十四周，每周照射五次，,,,和,,,照射强度分别是, ,,, ,?;,,,和,, , ,(;,。。,,,和，,,,总照射剂量分别为:,,, ,,, ,,;,,和,,, , , ,?,;,”,。,,,的照射剂量小于最小红斑量(,,,)的,,,。用肉,,观察的方法，隔周一次观察皮臌的外观状态和缴纹数:用硫代巴比妥酸法(,,,法)测定皮肤组织中丙二醛(,,,)的含量:用酶生化方法测定其超氧化物鼓化酶(,,,)和答琥甘赋过氧化物酶 (,,,,,,)的活性;用氨基酸自动分析仪测定豚鼠皮肤组织中羟脯氨酸技其他氨基酸的舍量。结果长期紫步,线辐射后豚鼠背部皮靛出现锻纹、皮肤外观状态改变(红斑、松弛、脱屑)(模型组与对照组相比，差异有显著统计学意义((,,, ,,(,,, ,,):,,,熊保护豚鼠背部皮肤免受紫外线辐射顼致酶皮默皱纹、松弛及鳃斑，且在定浓度范隔内(,,蕉,,,)(随,,,浓度升高，保护作用增强:长期紫外线辐射后豚盥奎自缝量譬,,垒垂?:墅,堑量,,，卫～,塑 ——一 盘毽羔,,盟挂熊錾盐续描啦隧醢。皮雎芷耋弛鎏撮控盎,硝毫 鼠背部皮肤组织中,，，,,,俞量提高，,,,和,,,，—,,的活性“著降低，与对魁娴比 较，茇异有最著统计学意义(,,,,,，,,,(,,);,,和,,,,,, ,,降低皮肤组织 中,,,的含量，显著提高,,,和,,,,,,的活性。,,,各细与,,模型组比较， 差异有显著统计学意义(,,, ,,，,,,(,,)。,乏期的紫，,线辐射可致豚鼠皮救组织 中羟脯氨酸、灭冬氨酸、苏氨酸、,氨酸、举丙氨酸和赖氨酸含量降低(与对照组 比较,均,,(,,)，应用…定浓度(,,一,,,)朗,,,最可升高皮款组织中上述氨 基酸的含量(与模型组比较,,,(,,)。 结论在,,,和,,,总照射剂量分别为 ,,,(,,, ,?;,。和,,,(, ,, ,(;,,,的强度下，成功制备了豚鼠皮肤光老化的病理模型。 紫外线辐射是通过产生浦能氧中间体，目,起皮肤组织氧化成激而致光老化;,,,作 为抗氧化剂，可抑制脂质过氧化，降低,,,含量，提高,,,和,,,,,,括性，而对抗目光中,,,和,,,,,舞魏皮肤的光老纯损伤。 关键阏 扇贝多肽(,;,);紫外线:光老化:豚鼠;羟腩氯酸 ,基余项日:国家自然科学耩台资助项目项目编号,,,,,,,,翻末自然斟学基金项目，项日编号:,,,,,,, ,一—— 一—— 盔皿童弛烈韪数,监盎线辐赫睡越出目,盘点盐篚，德控值出础,, ,,,,,;,,,, ,,,,;, ,,,,,,;,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,，,，,,,,,,,, ,，,,,,,,,,, ,,,,,,,,,—,,,,;,, ;,,,,,; ,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,， ,,, ,,,,,〔。, ,,,,,,,,,,,, ,,,,;,,, ,, ,,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,;,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,，,,,,;,, ,,,,,, ,,,?孤,,, ,，, ,,,,,,; ,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,，,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,;,,,,, ,,,,;, ,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,;,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,每,,“,,,,,,,,,,,, ; ,,,,;,, ,, ,,,,,,,,,,,,,; ,,,, ,,,,,, ,,, ,(,,,),,, ,,,,,,,,,,, ,?,,),,,,,,,,,(,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,知,,竹(,,,，科,,撼日,,,,,,),, ,,,,,, ,,,,,, ,,,;, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,,;,,,, ,,,,, ,,, ,; ,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,？,,。,,,,,,; ,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,, ,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,,,: ,,,,,, ,,,, ,;,,, ,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,;,,,,, ,,,,,(,,, ,,,,);, ,，, ,,, ,,”,,,(,,,,, , ,,,);,,,,,,,,,,,,,十,,,),,,,,, ,,,, ,;,, ,,,,,,,,,, , ,,,,, ,,,,,, ,,,, ,，,,, ,,,,。,,,,,,,,,,,,, ,,, ,(, , ,,;,“,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,, ,, ,,,,, ,,,,, ,,,,,(，, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,，,,,,,, ,,,, ,?,,,,,,,,,, , ,,,,, ,,,,,, ,,,, ,(,,, ,。;,。,,, ,,,,,,,,, ,,, ,, , ,，;,。,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,(,,, ,,;,。,,, ,,,。,, ,?;,,,,,,,,,,,,，,,, ,,, ,,,, ;,,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,; 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,;,,，,,,,,,,,;，,,,;,,,，,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,,, ,,, ,,,,(尸,,(,, ;,,,,,,, ,,,, ;,,,,,,)，,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,, ,, ,, ,,,,,,,,, ;,,,, ,,;,,,,, ,,, ,,,？,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,;,,, ,, ,,,,,, ,,, ,,,, ,,,, ,, ,,,, ,, ,,,,,),,,,〔，,,，,, ,,,,,,; ;,,,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,;;,,,,,,,,(,,, ,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ,,, ,,, ,?;,,,,, ,,,(,, ,?;,—,,,,,,,,,, ,,, ,, , ,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,，,,,;, ,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,,,，,,,,;,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,，,,;,,,,,,,;,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,, ,,, ;,,,,,; ,,,,;,, ,,,,,;,,,,, ,,,,, ;,,,, ,,,,,;, ,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,，,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,, ,,,,，,,,,,,,,,,;,,,,，,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,, ,;,,,;, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,，,, ，,,,,,;, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,目家自然科学基金靖？，项目编号:,,, , , , ,, 商烈多肤对长期紫外线辐刳豚鼠皮丑】:,光老化的保护作用研究 中英文缩略词表 ,,, 扇贝多肚 精氨酸 ,, 紫外线 ?, 长波紫外线 苏氨酸 ,,, 中波莹外线 ,氨酸 ,,, 短波紫天冬氨酸 , 外线 苯丙氨酸 ,,, 紫外线辐射 亮氨酸 ,,,,,, 谷胱甘且赶过氧化物酶 酪氨酸 ,,,, 氧化型彳警胱甘兢 组氧酸 ,,, 还原型谷胱甘肽 丝氨酸 ,,, 超氧化物歧化酶 谷氨酸 ,,, 过氧化氢酶 丙氨酸 ,,, 黄嘌呤氧化酶 半胱氨酸 蛐, 蠢二二醛 缬氨酸 , 硫代巴比妥酸 蛋氨酸 ,,, 活性氧 异亮 超氧阴离子 赖氨酸 ,,, 羟基自由基 羟腑氨酸 ,? 脂质自由基 氨酸 ,,一 挑鲫,嘶‰,圣溉时乱地哪??强蛳耋,‰ 脯氨酸 ,,,, 脂过氧自南基 ,,, 嚣质过氧化物 ,,, 电子自旋共振 州匣, 最小红斑量 ,,, 磷酸缓冲液基堑盎垫整生垂垒垂曼点整,垫兰;塑,,?,型 塞墨兰塾翌篓塑鉴堑堡塑墅墅亟堡墼垄童堡塑堡鲨堡型竺篓 弓,言 一 随着大气臭瓶层的不断破坏，臭氧层逐渐变薄，,们接触紫外线的机会越来越 多。在目光对皮胰的作,,,,中，只有,,,和，』、部分,,,可穿过大气篷至《迭地虱，引 起人类皮肤的多种损害。其,，， ,,,主要由表皮吸收、损伤表皮，占日光对皮肢损伤 作用的,,,,,,;,,,可达真皮上层,”,。 皮肤的光老化与自由摹在体内大鬟堆积密切相关，紫外线辐射以及臭氧层物质 均可引起皮肤组织中的自由基大量增加、代谢失衡【,】。当自由基代谢失衡，外源性 抗氧优剂对协助维持自由基豹代谢平衡生起到了极其重要的作用口,。近年来，懑外 对抗氧化剂的研究多为人工合成或是大分子药物(,,,等)，这些抗氧化剂易引起 皮肤组织的过敏反应。我国科技工作者整重在从中草药等陆地生物中提取抗氧化剂 的方面做了大量的研究工作。发现了茶多酚(赢昧了索、银杏叶提取物等多钟天然抗氧化剂,】(但对来源于海洋生物的抗氧化活性物质研究较少。 尽管许多学者对从海洋生物中提取天然抗氧化荆的已取得一定成绣确，鲔从海藻中提取了海藻多酚天然抗氧化剂、具有免疫功能的紫菜多糖、微晶甲壳质等，但 国内外对海洋生物肽豢天然抗氧化剂的报道并,;多见。 扇贝多肽(,;甲)是首次从海洋生物栉孔扇贝废弃物中提取并经酶工程处理而得到的水溶性多从，分子量为,,,,,,,,,,,,,,,,。课艇组对扇蛾多曩,具有我国自主知识产权。研究发现，,,,筢有效地清除体外自由基产生体系中的自由基聊;能够抗,,,、,,,对,,,,上皮细胞的氧化损伤;可明显减轻,,,、,,,对昆明种无毛小鼠皮肤的损伤„”,;髓够抗,讼、,,,氧化损伤人真皮成纤维 细胞霸无毛审鼠的皮肤?“】;以扇贝多肽为主要成分的海洋肽面膜已经成功地应用于美容方面四。 圜外,,年代钾以无毛小鼠为实验动物模型，研究光老化的损害及防护毒?的应耀,,,,?巾科院皮肤病研究所在,。年代末用氤灯、金属卤素灯为紫针线光源长期照射豚鼠皮肤，产生类似于人光老化性弹性组织变性的皮肤光老化的彤淼掌变化,,“。 本研究旨在建晓长期紫，,线辐射致艨鼠皮胶光老化损伤的病理模型，探究,,,的保护作用及机制。堕壅叠整整茔塞童堡自～塑翌照量二,,,,,,,, 扇贝多默对长期絮外鼗辎射辣鼠皮肤光老佬的保护,乍用研究 实验材料 ,，,实验动物 自色豚鼠，鼠龄,圃，赡雄兼壤。俸重,,,(,?,, , ,，由上海齑牧医学会提供， (动物台格证编号:,,,,,，由上海医学实验动物管理委员会签发)。在普通数幼物房癌饲养，每笼,只，给予标准饲料、自由饮水，照射前机械法脱掉积鼠背部黾发。在宴验结束时，用术棰敲击豚鼠枕骨部处死豚鼠。,(,试剂 扇贝多敢:奉谦题组分离提纯，分子最为,,,一,,,,,,,，敏蒸永配制戚,,,的母液，过滤滁菌，,?保存备用;,,,;参照文献本室盎配，,,,，烈,盘一,(,;,,,、,,,,,,、，,,,,测试盒:均购自南京建贼生物研究所;己,醇:山衷省化学碜,究所产，搬号,,,,,,;丙酮:常州市万选斌剂厂产，批号,,,,,,;苯荦醇:上海试剂一，„产，攫号,,,,,,;氢氧化钠:中国化学试剂三厂产，搬譬,,,,,,;拧檬酸;中国讫工站试验厂产，批号,,,,,,;氯化钠:青岛四方区化学试剂厂产，批号,,,,,,;柠檬酸钠:沈阳试铷,厂产，舭号,,,,,,;正辛酸:北京他工厂产，羝号,,,,,;三氯化肽:日本产，批号,,, ,;硫,,甘鼹:,,本产，批号,,,,;巯基乙酸;,海第二军医大学制翦厂。，(,仪器设备 ,,,和,,,光源:北京师范大学光电仪器厂生产:紫辨线模拟箱:北京师范大学光,趣仪器厂生产;,,,型紫外辐照许:北察师范大学光电仪器厂生产，波长范围,,,,,,,,,，峰值波长,,,,,,,;,,,型絮外辎照计:北衷师蒋大学光电仪器厂生产，波长范围,,,—,,,,,,，峰使波长,,,,,;,,,,,,型电予秤;?【本进日;,,，,型高速分散器:江苏海门麒麟医用仪器』一;低温离遮离心机;日本日立公司产品;,,,一型分光光度量,:上、海分嘏仪器厂制造;氨基酸自动分析仪:羹国,,,,,,,,,,;,,,,公司生产。匿室垒鉴盘茎塞垒堕女，整,堕量。塑,,堑?～ 赢受多,嫩对长粥紫韩线辐射躲鼠瘦靛光老纯赡保护作用研巍 实验方法,(,实验动耪饲养与分缒 敢,,只自色豚鼠，体重,,,(,,〔,,(, ,，随机分成圆缀(,:,,):对照组;模型组(,,照射维);,,,，』、弃,量组(,,,,,，,,,);,,,太帮量组(,,,,,,，,,,)。每笼,其饲养，给予标准饲料、自妇饮水，在控制室溢、湿度的房闽里，模拟光照和黑暗,,小时循环交替。照射前机械法脱掉豚鼠背部毛发,…，,。,实验设计 缚次照射前,小时，于备实验组脉鼠背部实验区域(,×, ;,,)分别涂抹,(,,,;去离子水(对照纽和模型组)、,,,,,和,,,,,,，,小时后用去离子农洗净备实验组脬鼠背帮涂抹的样品。对照组的豚鼠放回动物笼不经,,,和,,,照射，丽将模型缮、,,,小剂量?楹停校悖拼缶,孔榈拿科渥潦蠓直鸱畔 缸潦蠊潭ㄆ魅猓 恐浑嗍笏驯?镀浔巢恳淹丫活环?氖笛榍 颍 湃耄眨郑梁停桑剩郑抡丈湎洌 诰嗬牍庠矗常担澹颍岽ν 苯 校酰郑梁停眨郑抡丈洌 恚保 ?表,蜜验动物分组及涂抹样品的方法 涂 抹样品 涂摔耪星 ,(,,,菇，用去离子水 缀别 动物数 (,(,,,,,, ;,一) (,,,;一) 洗净涂抹的样品 对照组 ,, 去离子承 不经,,,和,,,照射 模型组 ,, 去离子水 同时进行,，,,。,,,小蒴,量缀 ,, ,,,,, , 和,,,照射 ,,,大莉量组 ,, ,(),,,, ,,(, ,,,和,,,照射过程…„,。? 预试验确定,,,的照射剂量小于最小彝辍量(，,，,,)的,,,。模型组、,,,小 ,凰垂鱼盛盎望蕉垒堡旦,壁?照量;塑～,型望 崩摁多肽对长期紫外线辐射豚鼠皮脞光老化的糅护作用研究 铷量组和,,,犬剂量组豚鬣分别瓣时进章于,,,和,,,照射。繇毒幸的第一周至第, 周，每周隔天照射一次共照射三次(姆周，、三、弧照射)，,,,和,,,照射强渡 分别是,(,,， ,,;,,”,,,和,(, , ,,;,『,。照辩的第七周至第十蹬周，每周照射五次(闽 一至五照射)，〔,,和,,,照射强度分别是,,,,, ,,,,,,,,和,, , ,,;,产。涟续照射 ,,阁后，,,,和,,,总照射剂量分别为:,,,。,,, ,,;,,,和,,, ,, ,(;, ,,,和,,,的照射过程 照射粼量(,。,,,, 每,,(觅表,)。 表, 蠲照射 照射过程 每周照射目援 ,、,, ,,, 次 数,第,周至第,周 ,(,,, ,(,×,,,, , 星期,、三、五,第,阁至第,,周 ,(,铊 ,(,, ,,,, , 璧期一至五,。,皮麸外观状态的译价及皱纹散的测定“?, 在,,,和,,,照射捌阔，隔周记录各组豚鼠皮肤外踟状态和皱纹数的嶷他度评分。皮肤，,戏炊态的评分标准共分为,级(薅袅,)，,分代表皮肤步,残无改变，,(,分代表皮获外观星最大程度的改变。用,,,,,,，,,,,,彩色腔卷撩照。 皮肤皱纹数的测定:是以实验区域内垂商于豚鼠头部至耀部方向舶横肉皱纹数量丽定。 表, 皮默,,观状态评分标准 ,平分等级 皮歇，,戏状态 , 皮肤挤窥疆常，呈肉红色 ,(,皮肤呈现少量红斑(即轻度纽斑) , 部分皮肤呈现缀斑(即中度红斑) ,，, 全身皮肤呈现红斑(酆重度红斑)堕窒鱼整篓整墓垒至,～一翌,垫量;,,,～楚,～ 扇担多融对长期紫外线辐射辣飘皮肤党老化的僳护作用妍黧 , 盛趺呈现重发红斑，并出现部分皮蕊 ,，, 皮肤呈现霞度红斑，并出现大量皮霜 , 皮肤松懈、狙糙 ,(, 皮默松懈、穰糙、失去光泽,(, ,,,含量及,,,和,,,,,,活性的测定“”” 最后一次照射后,,小时，机械法脱掉各组豚鼠背部毛.